藥用植物大戟組培快繁體系優(yōu)化研究

， ， ， 坤華， 林軒，

(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園a.廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室；b.藥用植物保育實驗室， 南寧 530023)

·應用技術·

藥用植物大戟組培快繁體系優(yōu)化研究

李翠，韋瑩，繆劍華，韋坤華，李林軒，張占江

(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園a.廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室；b.藥用植物保育實驗室， 南寧 530023)

[目的]采用組織培養(yǎng)快繁技術解決大戟種苗短缺和種質(zhì)資源可持續(xù)開發(fā)利用問題，為人工種植提供技術支持。[方法]對消毒劑和消毒時間進行篩選，以大戟帶側芽莖段為外植體，以MS、B 5、N 6為基本培養(yǎng)基，采用正交試驗比較植物生長調(diào)節(jié)劑 (6-BA、2,4-D、KT、NAA、IAA、IBA 、AC)對大戟愈傷組織誘導、不定芽分化、繁殖系數(shù)和誘導生根的影響。[結果]外植體經(jīng)15 d誘導培養(yǎng)，形成愈傷組織，其誘導的最佳培養(yǎng)基為B 5+2,4-D 1.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，愈傷組織誘導率達到80%；不定芽分化的最佳培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ IAA 0.6 mg/L；最利于增殖的培養(yǎng)基為MS+KT 0.5+ 6-BA 1.5 mg/L+IAA 1.0 mg/L，增殖倍數(shù)6～10；最佳的生根培養(yǎng)基為MS+IBA 2.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L，生根率93.1%。[結論]此途徑繁殖速度快、再生率高，有望為栽培大戟提供大量種苗，為大戟深入開發(fā)利用研究提供依據(jù)。

藥用植物； 大戟； 組培快繁； 生根率

大戟屬(EuphorbiaLinn．)是大戟科(Euphorbiaceae)中最大的屬，《中國植物志》及《Flora of China)記載其約2 000 種，幾乎遍布全球，是特大屬之一，中國約有77種，大戟科植物大戟(EuphorbiapekinensisRupr.)，為多年生常綠草本，根圓柱狀，長20～30 cm，花期5—8月，果期6—9月，廣布于全國(除臺灣、云南、西藏和新疆)，北方尤為普遍；生于山坡、灌叢、路旁、荒地、草叢、林緣和疏林內(nèi)，根入藥，具有較高的藥用價值(約100元/kg)，具有逐水通便，消腫散結，主治水腫，并有通經(jīng)之效，用于治療慢性腎炎，晚期血吸蟲病腹水或其他肝硬變腹水等癥。大戟對生長環(huán)境要求苛刻，近年來，大戟資源遭到了嚴重破壞，隨著市場需求量的不斷增加，野生大戟資源瀕臨枯竭，價格從幾元一公斤到現(xiàn)在的上百元一公斤，且常常有價無市，由于種子細小，生產(chǎn)上難以實現(xiàn)大面積栽培。采用生物技術組織培養(yǎng)技術，可以有效快速地提高大戟種苗的繁殖速度和質(zhì)量，實現(xiàn)大戟優(yōu)質(zhì)種苗的工廠化育苗，以滿足生產(chǎn)上的需要。本研究通過誘導愈傷組織獲得叢生芽，得到的種苗健壯、成活率高，可在短期內(nèi)提供大量大戟的優(yōu)質(zhì)種苗，有效解決了大戟的規(guī)?；鐔栴}。>

表1 不同培養(yǎng)基對大戟愈傷組織誘導的影響

試驗編號培養(yǎng)基接種外植體數(shù)(個)產(chǎn)生愈傷組織數(shù)(個)愈傷組織誘導率(%)1MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.5mg/L4022552MS+2,4-D1.5mg/L+6-BA0.5mg/L4032803B5+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.5mg/L4025624B5+2,4-D1.5mg/L+6-BA0.5mg/L4029725N6+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.5mg/L4024606N6+2,4-D1.5mg/L+6-BA0.5mg/L402768

1 實驗材料

2015年5月采集自廣西藥用植物園引種繁育圃，經(jīng)呂惠珍副主任技師鑒定該品種為京大戟，經(jīng)篩選后選擇無病蟲害的優(yōu)良大戟植株為實驗材料，選取其帶側芽莖段作為外植體。

2 外植體處理及培養(yǎng)條件

2.1 外植體處理

將帶側芽莖段表面洗凈去污，于超凈工作臺內(nèi)采用濃度為75%的酒精滅菌30～45 s，無菌水沖洗1～3次，放入0.1% HgCl2滅菌劑滅菌，并充分震蕩，再用無菌水沖洗2～5次，用無菌濾紙將莖段表層的水分吸干，剪去與滅菌劑接觸部分，然后按自然順序接種到誘導培養(yǎng)基上。

2.2 培養(yǎng)條件

各個培養(yǎng)階段附加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，蔗糖 3%，瓊脂0．6%，pH值5.8～6，培養(yǎng)室平均光照強度2 000 lx左右，光照時間12 h/d，溫度(24±2)℃。

3 試 驗

3.1 大戟愈傷組織的分化

基于MS、B 5、N 6培養(yǎng)基，添加不同濃度的2,4-D(0.5，1.0，1.5 mg/L)、6-BA(1.0，1.5，2.0 mg/L)，進行大戟愈傷組織誘導實驗，每組接種10瓶，每瓶接種3個外植體，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計外植體的愈傷組織誘導率等結果。

3.2叢生芽再生誘導

基于MS、B 5、N 6培養(yǎng)基，添加NAA、IAA、6-BA 3種不同類型激素，并開展正交設計NAA(0.5，1.0，1.5 mg/L)、KT (0.1，0.2，0.4 mg/L)、6-BA(1.0，1.5，2.0 mg/L)進行大戟不定芽誘導實驗，每個處理10瓶，每瓶4塊愈傷組織，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計叢生芽誘導率等結果。

3.3 叢生芽繁殖培養(yǎng)

在MS為基本培養(yǎng)基的基礎上以6-BA、IAA為生長調(diào)節(jié)激素考察大戟叢生芽繁殖情況。6-BA(0.5，1.0，1.5 mg/L)、IAA (0.2，0.4，0.6 mg/L)2種激素設計6組試驗對大戟叢生芽繁殖效果比較研究，每個處理10瓶，每瓶3個單芽，30 d統(tǒng)計叢生芽增殖結果。

芽增殖倍數(shù)=(20 d后芽數(shù)-接種時芽數(shù))/接種時芽數(shù)。

3.4 生根培養(yǎng)

為了尋找大戟無菌苗生根壯苗的最適合培養(yǎng)基，設置以下不同處理(表3)，以MS為基本培養(yǎng)基，IBA(1.0，2.0 mg/L)、AC(0.5，1.0，1.5 mg/L)2種添加物進行試驗，對大戟的繁殖培養(yǎng)基進行優(yōu)化，將生長健壯，高2～3 cm的無根苗接種于4種不同處理的生根培養(yǎng)基上，每組試驗接種10瓶，每瓶6個單芽，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計生根數(shù)平均值和生根率等結果。

4 結果與分析

4.1 愈傷組織誘導情況

基于MS、B 5、N 6培養(yǎng)基，添加2,4-D(0.5，1.0，1.5 mg/L)、6-BA(1.0，1.5，2.0 mg/L)，進行大戟不定芽誘導實驗，每組接種10瓶，每瓶接種4個外植體，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計外植體的愈傷組織誘導率等結果(圖1)。

愈傷組織誘導率(%)=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%；

生根率(%)=產(chǎn)生不定根的叢苗數(shù)/接種叢苗總數(shù)×100%；

生根數(shù)平均值=總生根數(shù)/接種總數(shù)。

圖1 大戟愈傷組織

4.2 叢生芽再生誘導

將得到的試管苗叢生芽置于愈傷組織分化出芽培養(yǎng)基中，MS培養(yǎng)基，添加IAA、6-BA 2種不同類型激素，并添加IAA(0.2，0.4，0.6 mg/L)、6-BA(0.5，1.0，1.5 mg/L)進行對大戟不定芽誘導實驗，每組試驗接種10瓶，每瓶4塊愈傷組織，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計叢生芽誘導率等結果(圖2)。

圖2 愈傷組織誘導出芽

20～30 g/L蔗糖和3.8～4.8 g/L的瓊脂，培養(yǎng)基pH=5.8，觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L的6-BA和0.6 mg/L的IAA壯苗效果最好，株高達5.37 cm。

4.3 叢生芽繁殖培養(yǎng)

將外植體接種到MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23～26 ℃，光照強度1 400～2 000 lx，光照時間為10～12 h/d的條件下培養(yǎng)30 d，側芽分化后獲得叢生芽，其中MS培養(yǎng)基中含0.1～0.4 mg/L的KT、1.0～2.0 mg/L的6-BA、1.0～2.0 mg/L的NAA、20～30 g/L蔗糖和3.8～4.8 g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中6-BA和NAA濃度增加，大戟叢生芽數(shù)均增加；在培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L的KT、2.0 mg/L的6-BA和1.5 mg/L的NAA，叢生芽效果最好(圖3)。

4.4 生根培養(yǎng)

將健壯植株置于MS生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23～26 ℃，光照強度1 400～2 000 lx，光照時間為10～12 h/d的條件下，培養(yǎng)40 d得到帶根的完整植株，其中MS生根培養(yǎng)基中含0.5～1.5 mg/L的IAA、1.0～2.0 mg/L的IBA、25～30 g/L蔗糖和3.8～4.8 g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中IAA濃度增加，組培苗的生根率也增加；培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L的IBA和1.0 mg/L的IAA生根效果最好，生根率達93.1%，平均根長達到4.49 cm；

圖3 大戟叢生芽繁殖

圖4 大戟組培苗

表2 不同激素水平對大戟叢生芽壯苗效果的影響

試驗編號6-BA(mg/L)IAA(mg/L)株高(cm)長勢10.50.23.47生長慢,弱黃綠色20.50.44.51生長較慢,黃綠色30.50.64.88生長較快,綠色41.00.24.27生長較快,綠色51.00.44.92生長快,翠綠色61.00.65.37生長快,翠綠色71.50.24.68生長較快,綠色81.50.44.90生長較快,綠色91.50.65.13生長較快,綠色

5 討 論

大戟屬植物(EuphorbiaL.)為大戟科植物中最大的屬。大部分為一年或多年生草本植物，全球有2 000余種，廣泛分布于世界各地，尤以非洲和南美洲最多，大戟屬植物在中國有80余種。作為一種具有悠久用藥歷史的傳統(tǒng)藥物，大戟屬植物在我國民間有著廣泛的應用基礎。在藏藥系統(tǒng)中主要用于治療水腫、結核、疥瘡、無名腫毒等疾患。大戟屬植物良好的藥物活性，吸引了眾多的藥物化學家的關注。

表3 不同激素對大戟組織培養(yǎng)快速繁殖效果的影響

試驗編號A(KT)(mg/L)B(6-BA)(mg/L)C(NAA)(mg/L)D(誤差項)芽繁殖倍率10.11.00.513.3120.21.51.023.8930.42.01.534.2440.11.00.534.6850.21.51.015.1460.42.01.524.7570.11.00.524.9280.21.51.034.8190.42.01.514.56芽增殖倍率K110.9621.9124.2114.69A>B>CK215.1326.4123.1423.63A2B3C3K314.6922.5620.7922.719∑yi I=1=40.3R0.310.150.120.31CT=180.45

注：芽增殖倍數(shù)=(30 d后芽數(shù)-接種時芽數(shù))/接種時芽數(shù)。

表4 不同激素水平對大戟組培苗生根效果的影響

試驗編號IBAAC生根率(%)平均根長(cm)11.00.588.93.6621.01.089.54.0731.01.592.14.4142.00.591.33.9652.01.093.14.4962.01.592.74.37

圖5 大戟組培苗生根情況

植物生長調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中的關鍵物質(zhì)，能以極微小的量影響到植物的細胞分化、分裂和發(fā)育，對組織培養(yǎng)起著重要的調(diào)節(jié)作用[9]。當細胞分裂素/生長素的比值合適時，能誘導芽的形成和促進芽的生長。6-BA是組織培養(yǎng)研究中最常用的細胞分裂素，能促進細胞分裂、側芽和植株的生長等，萘乙酸NAA是一種廣譜型植物生長調(diào)節(jié)劑，能促進細胞分裂與擴大，誘導形成不定根、增加坐果，防止落果等作用，吲哚乙酸IAA廣譜多用途，但因它在植物體內(nèi)外易降解而未成常用商品植物生長素，能誘導形成不定根[10-11]。多種激素組合能更有效的促進植物的相互作用的生長，屬于協(xié)同效應。因此在MS基本培養(yǎng)基內(nèi)同時加入6-BA、IAA對大戟生長的具有較大的效果。

本研究中，大戟外植體經(jīng)15 d誘導培養(yǎng)，形成愈傷組織，其誘導的最佳培養(yǎng)基為B 5+2,4-D 1.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，愈傷組織誘導率達到80%；試驗中得出大戟叢生芽繁殖的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+ KT 1.5+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L，大戟叢生芽的增殖率一般可達到6.5，且芽苗翠綠粗壯。試驗中MS培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L的IBA和1.0 mg/L的IAA生根效果最好，生根率達93.1%，平均根長達到4.49 cm,該研究方法生產(chǎn)的大戟種苗既可滿足人們對大戟的用途需求，又可保護珍稀瀕危種質(zhì)資源，同時還為豐富我國園林植物種類提供保障。本研究結果為大戟的保護和可持續(xù)開發(fā)利用開辟了一條新的途徑，為同屬其他物種的組織培養(yǎng)研究提供借鑒和參考。

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志(第四十四卷,第三分冊)[M].北京:科學出版社,1997:89-90.

[2]WU Z Y,RAVEN P H,HONG D Y,et al.Flora of China(V01.¨)[M].Beijing:Science Press,and St.Louis:Missoufi Botanical Garden Press,2008:305.

[3]勇應輝,戴傳超,楊啟銀,等.內(nèi)生真菌和培養(yǎng)基對大戟組培苗生長和煉苗的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2008,36(2):505-507.

[4]戴傳超,余伯陽,董晨,等.藥用植物大戟的快速繁殖研究[J].廣西植物,2005,25(2):152-155.

[5]張蓓蓓.三種大戟屬植物的化學成分及抗腫瘤活性研究[D].東南大學,博士學位論文,2013.

[6]黃衡宇,王美蓉.紫背金盤愈傷組織誘導與再生體系的建立[J].中草藥,2014(9):1 313-1 318.

[7]張占江,李翠,呂惠珍,等.條葉唇柱苣苔組織培養(yǎng)研究[J].種子,2013,32(9):19-22.

[8]韋范,李翠,韋坤華,等.巖黃連的高頻再生體系建立與優(yōu)化[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2014,42(11):68-71.

[9]李林軒,凌征柱,李翠,等.琺菲亞組織培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究[J].中草藥,2013,44(10):33-35.

[10]楊冉,黃萍,祁珊珊,等.柳枝稷種子組培快繁技術[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2014,42(2):46-48.

[11]于紅梅,趙密珍,錢亞明,等.海沃德獼猴桃?guī)а壳o段的組織培養(yǎng)快繁技術[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2014,42(11):78-79.

(本欄目責任編輯：申 曉)

Optimization Study of Tissue Culture Regeneration of Medicinal PlantsEuphorbiapekinensisRupr.

LICui,WEIYing,MIAOJianhua,WEIKunhua,LILinxuan,ZHANGZhanjiang

2016-10-20

廣西青年基金項目(2015 GXNSFBA 139104)；廣西中醫(yī)藥民族醫(yī)藥項目(GZBZ 14-15)；廣西壯藥質(zhì)量標準研究項目(MZY 2013052)。

李 翠(1982—)，女，黑龍江省依安縣人；碩士，助理研究員，主要從事藥用植物繁育與保存研究；E-mail:licuicui941@aliyun.com

張占江，副研究員，研究方向：藥用資源保護與開發(fā)利用；E-mail:zzj1811@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.04.131

S 567.23+9

A

1001-4705(2017)04-0131-04