丁苯酞通過混合譜系激酶3信號通路對1-甲基-4-苯基-吡啶離子誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖和凋亡的影響

郭子夢，吳慶文，陳秀秀，關(guān)亞麗，李鵬飛，王妍，程月發(fā)

丁苯酞通過混合譜系激酶3信號通路對1-甲基-4-苯基-吡啶離子誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖和凋亡的影響

郭子夢1，吳慶文1，陳秀秀1，關(guān)亞麗2，李鵬飛2，王妍2，程月發(fā)2

目的 探討丁苯酞對1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞混合譜系激酶3(MLK3)通路的影響，及其對細(xì)胞增殖與凋亡的作用機(jī)制。方法 對數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞分為對照組、MPP+組、丁苯酞組和URMC-099組，對照組正常培養(yǎng)，MPP+組加1 mmol/L MPP+培養(yǎng)24 h，丁苯酞組予10μmol/L丁苯酞預(yù)處理3 h后，加入MPP+培養(yǎng)24 h，URMC-099組予200 nmol/L MLK3通路特異性抑制劑URMC-099預(yù)處理3 h后，加入MPP+培養(yǎng)24 h。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，噻唑藍(lán)比色法檢測細(xì)胞活性，Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，Hoechst33342熒光染色法觀察凋亡細(xì)胞，Western blotting檢測MLK3磷酸化蛋白(p-MLK3)、c-Jun氨基末端激酶磷酸化蛋白(p-JNK)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化蛋白(p-ERK1/2)的表達(dá)。結(jié)果 MPP+組細(xì)胞存活率低于對照組(p＜0.05)，丁苯酞組和URMC-099組細(xì)胞存活率高于MPP+組(p＜0.05)；MPP+組細(xì)胞凋亡率高于對照組(p＜0.05)，丁苯酞組和URMC-099組細(xì)胞凋亡率低于MPP+組(p＜0.05)；與對照組相比，MPP+組p-MLK3、p-JNK蛋白表達(dá)量增加(p＜0.05)，p-ERK1/2蛋白表達(dá)量降低(p＜0.05)；與MPP+組相比，丁苯酞組和URMC-099組p-MLK3、p-JNK蛋白表達(dá)量降低(p＜0.05)，p-ERK1/2蛋白表達(dá)量升高(p＜0.05)。結(jié)論 丁苯酞可減少MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能是通過抑制MLK3通路，調(diào)節(jié)下游p-JNK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)。

帕金森??；丁苯酞；混合譜系激酶3；凋亡；SH-SY5Y細(xì)胞

帕金森病是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其病理特征主要為黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元大量丟失及嗜酸性包涵體形成[1]。帕金森病的病因和發(fā)病機(jī)制可能與線粒體功能失調(diào)、氧化應(yīng)激、免疫炎癥和泛素-蛋白酶系統(tǒng)損傷[2-4]及同核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子如p53和miR-34a等有關(guān)[5-6]。

1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenyl-pyridin-iumion,MPP+)是 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)的有效成分，可選擇性破壞中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，引起細(xì)胞凋亡。MPP+已廣泛用于誘導(dǎo)帕金森病實驗?zāi)Ｐ?，作用機(jī)制與p53、Bax、Bcl-2、caspase家族、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族等有關(guān)[7]。

URMC-099是混合譜系激酶3(mixed-lineage kinase 3,MLK3)通路特異性抑制劑，可減少炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，其機(jī)制與抑制MLK3、p38MAPK和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化蛋白的表達(dá)，減少白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6和腫瘤壞死因子α基因表達(dá)有關(guān)[8]。

丁苯酞是從芹菜籽提取的脂溶性物質(zhì)，臨床廣泛用于治療缺血性腦血管病、帕金森病、阿爾茨海默病等腦疾病。丁苯酞可改善腦組織微循環(huán)，抑制炎癥，改善認(rèn)知功能，且副作用少[9]。有文獻(xiàn)報道[10]，丁苯酞可抑制JNK通路，降低Fas配體、活化型caspase-3蛋白表達(dá)。本研究探討丁苯酞對其上游通路MLK3的影響，及其對下游JNK通路和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extra cellular regulated protein kinases,ERK)通路的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

SH-SY5Y細(xì)胞株：中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

丁苯酞(批號201502)：中國食品藥品檢定研究院。MPP+(批號 014M4704V)、Hoechst33342(批號20141017)：美國SIGMA公司。URMC-099(批號S734301)：美國SELLECK公司。胎牛血清和胰酶：美國BI公司。DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基：美國CORNING公司。p-JNK、p-ERK1/2、p-MLK3抗體：美國AFFINITY公司。GAPDH抗體：杭州華安生物技術(shù)有限公司。AnnexinV/PI試劑盒：美國BD公司。噻唑藍(lán)：日本TCI公司。BCA蛋白定量檢測試劑盒和RIPA裂解液：北京索萊寶公司。

CO2培養(yǎng)箱：美國THERMO FISHER公司。酶標(biāo)儀：意大利BIO-RAD公司。超凈工作臺：中國蘇州凈化設(shè)備廠。流式細(xì)胞儀：美國BD公司。倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡：日本OLYMPUS公司。低溫離心機(jī)：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將SH-SY5Y細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，胰酶消化傳代，2～3 d更換培養(yǎng)基。

取對數(shù)生長期細(xì)胞，分為正常對照組(細(xì)胞正常培養(yǎng)，不加藥物干預(yù))、MPP+組(加1 mmol/L MPP+培養(yǎng)24 h)、丁苯酞組(10μmol/L丁苯酞預(yù)培養(yǎng)3 h后，加入MPP+培養(yǎng)24 h)、URMC-099組(200 nmol/L URMC-099培養(yǎng)3 h后，加入MPP+培養(yǎng)24 h)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2 細(xì)胞存活率

待細(xì)胞貼壁后，每孔1×104細(xì)胞接種于96孔板。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按分組藥物處理細(xì)胞。加入50 mg/ml噻唑藍(lán)20μl，孵育3 h。棄去培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜150μl，搖床10 min。酶標(biāo)儀490 nm波長檢測吸光度值(A值)，計算細(xì)胞存活率。

重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞每孔5×105接種于6孔板。待細(xì)胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按分組藥物處理細(xì)胞。胰酶消化后收集細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌3次后棄上清，加入Binding Buffer 400μl制備單細(xì)胞懸液，取單細(xì)胞懸液100μl，加入Annexin-FITC 5μl混勻，室溫避光孵育15 min后，加入Propidium Iodide 5μl混勻。流式細(xì)胞儀檢測。重復(fù)3次。

1.2.4 Hoechst33342染色

細(xì)胞以每孔5×105接種于6孔板。待細(xì)胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按分組藥物處理細(xì)胞。棄去培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗2次，加入4%多聚甲醛溶液1 ml固定10 min；PBS緩沖液洗2次后，加入10μg/ml Hoechst33342熒光染液，37℃避光孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 Western blotting

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征(倒置相差顯微鏡,200×)

細(xì)胞每孔5×105接種于6孔板。待細(xì)胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按分組藥物處理細(xì)胞。用冷PBS緩沖液洗2次，每孔加入裂解液100μl冰上裂解30 min；移入離心管，超聲打碎，收集細(xì)胞，吸取上清液，BCA法測蛋白濃度。蛋白變性，SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。加p-MLK3(1∶1000)、p-JNK(1∶500)、p-ERK1/2(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)一抗4℃搖床過夜。TBST緩沖液洗3次，每次8 min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶5000)，室溫孵育2 h。TBST緩沖液洗3次，ECL顯色，用Image J軟件分析條帶灰度值，用內(nèi)參GAPDH進(jìn)行校準(zhǔn)，計算各組蛋白相對表達(dá)含量。重復(fù)3次，取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用(xˉ±s)表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)

對照組細(xì)胞呈三角形或梭形，貼壁細(xì)胞數(shù)較多；MPP+組貼壁細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞變圓，突起結(jié)構(gòu)回縮；丁苯酞組、URMC-099組較MPP+組貼壁細(xì)胞增多，細(xì)胞突起明顯，與對照組形態(tài)相似。見圖1。

2.2 細(xì)胞存活率

與對照組比較，MPP+組細(xì)胞存活率降低(p＜0.05)；與MPP+組比較，丁苯酞組和URMC-099組細(xì)胞相對存活率升高(p＜0.05)。見表1。

2.3 細(xì)胞凋亡率

與對照組比較，MPP+組細(xì)胞凋亡率升高(p＜0.05)；與MPP+組比較，丁苯酞組和URMC-099組細(xì)胞凋亡率降低(p＜0.05)。見表1、圖2。

2.4 Hoechst33342染色

對照組細(xì)胞核呈彌漫均勻藍(lán)色熒光；MPP+組細(xì)胞染色不均勻，可見濃染致密的顆粒熒光及塊狀熒光，表示細(xì)胞核固縮、碎裂；丁苯酞組和URMC-099組凋亡細(xì)胞較少。見圖3。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率

表1 各組SH-SY5Y細(xì)胞存活率和凋亡率比較(%)

圖3 各組細(xì)胞凋亡情況(Hoechst33342熒光染色，200×)

2.5 Western blotting

與對照組比較，MPP+組p-MLK3和p-JNK表達(dá)升高，p-ERK1/2表達(dá)降低(p＜0.05)；與MPP+組比較，丁苯酞組和URMC-099組p-MLK3、p-JNK表達(dá)降低，p-ERK1/2表達(dá)升高(p＜0.05)。見表2、圖4。

圖4 各組Western blotting結(jié)果

表2 各組p-MLK3、p-JNK、p-ERK1/2蛋白相對表達(dá)量

3 討論

本研究采用MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞建立帕金森病細(xì)胞模型，以MLK3通路抑制劑URMC-099為對照，研究丁苯酞治療帕金森病的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，丁苯酞預(yù)處理后，細(xì)胞形態(tài)、存活率、凋亡率和p-MLK3及下游蛋白表達(dá)有顯著變化。

MLK3廣泛表達(dá)于人體組織中，是MAPK家族重要的上游信號分子，在神經(jīng)變性疾病中參與誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[12]。MLK3參與多種信號級聯(lián)反應(yīng)，可激活p38MAPK途徑介導(dǎo)caspase-3活化，也可激活JNK通路抑制ERK通路，引起凋亡級聯(lián)反應(yīng)[13-14]。

JNK和ERK1/2都位于MLK3下游，兩者生物學(xué)效應(yīng)并不相同[15]。ERK1/2磷酸化是功能活動的標(biāo)志，ERK1/2信號通路激活可減少α-突觸核蛋白引起的神經(jīng)元損傷，在多巴胺神經(jīng)元急性氧化損傷中起保護(hù)作用[16]。張弛等[17]用MPP+誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)激活ERK通路可降低MPP+神經(jīng)毒性。JNK激活后稱為p-JNK，可活化核內(nèi)c-Jun，介導(dǎo)caspase-3，增加Bax蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[18]。潘靜等[19]通過6-羥基多巴胺誘導(dǎo)帕金森病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)p-MLK3、p-JNK蛋白表達(dá)增加；MLK3通路抑制劑可減少MLK3和JNK磷酸化水平，保護(hù)多巴胺神經(jīng)元，改善大鼠旋轉(zhuǎn)行為。

本研究首次探討MLK3通路在MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡作用機(jī)制，結(jié)果顯示，使用MLK3通路抑制劑URMC-099后，可改善細(xì)胞形態(tài)，提高細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞凋亡，提示URMC-099具有神經(jīng)保護(hù)作用。這與Marker等[20]研究結(jié)果一致。URMC-099可使p-MLK3及下游因子p-JNK蛋白表達(dá)減少，p-ERK1/2蛋白表達(dá)增加。

丁苯酞是一種多靶點神經(jīng)保護(hù)性藥，可阻止神經(jīng)元退化，有效延緩疾病進(jìn)程，減輕疾病引起的殘疾水平[21]，其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制與保護(hù)線粒體功能、抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡、適度提高自噬水平有關(guān)[22-24]。我們早期的研究發(fā)現(xiàn)，對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞，丁苯酞預(yù)處理可維持細(xì)胞正常形態(tài)和良好活性，逆轉(zhuǎn)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，與下調(diào)p53、Bax和p-JNK蛋白表達(dá)水平，維持線粒體膜穩(wěn)定性，減少細(xì)胞色素C的釋放[25-27]，適度上調(diào)自噬水平，防止細(xì)胞繼發(fā)性損傷有關(guān)[28]。

本研究進(jìn)一步顯示，丁苯酞預(yù)處理后，細(xì)胞形態(tài)明顯改善，數(shù)量增加，細(xì)胞活性提高，凋亡率下降，p-MLK3、p-JNK蛋白表達(dá)顯著降低，p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著增高，與使用URMC-099預(yù)處理的細(xì)胞大體相同。本研究中p-JNK的變化與我們早期研究結(jié)果一致[27]。

綜上所述，丁苯酞影響MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖和凋亡，對神經(jīng)元有保護(hù)作用；其機(jī)制與抑制MLK3通路、調(diào)節(jié)促活通路的ERK和促凋亡通路的JNK有關(guān)。由于細(xì)胞實驗的局限性，對丁苯酞在臨床上防治帕金森病的作用機(jī)制仍需深入研究。

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Effects of DL-3-n-Butylphthalide on Proliferation and Apoptosis of 1-Methyl-4-Phenylpyridinium-induced SH-SY5Y Cells via Mixed Lineage Kinase 3 Signaling Pathway

GUO Zi-meng1,WU Qing-wen1,CHEN Xiu-xiu1,GUAN Ya-li2,LI Peng-fei2,WANG Yan2,CHENG Yue-fa2
1.College of Nursing and Rehabilitation,North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063210,China;2.Jitang College of North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063210,China

WU Qing-wen,CHENG Yue-fa.E-mail:wxywqw@163.com(WU Qing-wen);arthurcy@163.com(CHENG Yue-fa)

Objective To investigate the effects of DL-3-n-Butylphthalide(NBP)on proliferation and apoptosis of 1-methyl-4-phenylpyridinium(MPP+)-induced SH-SY5Y cells,and mechanisms via mixed lineage kinase 3(MLK3)signaling pathway.Methods The SH-SY5Y cells were divided into control group,MPP+group,NBP group and URMC-099 group,that cultured normally,with 1 mmol/L MPP+for 24 hours,with 10μmol/L NBP for 3 hours and then with MPP+for 24 hours,and with 200 nmol/L MLK3 inhibitor URMC-099 for 3 hours and then with MPP+for 24 hours,respectively.The morphology of SH-SY5Y cells was observed under inverted phase contrast microscope and the survival rate was measured with 3-(4,5-Cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide assays.The apoptosis was quantified under flow cytometry with Annexin V/PI fluorescence staining,and the nuclear morphology was observed with Hoechst 33342 staining.The expression of phosphorylated protein of MLK3(p-MLK3),c-Jun N-terminal kinase(p-JNK),extra cellular regulated protein kinases(p-ERK1/2)were detected with Western blotting.Results Compared with the control group,the survival rate reduced and apoptosis increased in MPP+group(p＜0.05),with the increase of p-MLK3 and p-JNK and decrease of p-ERK1/2 d(p＜0.05).Compared with MPP+group,the survival rate increased and apoptosis reduced in both NBP and URMC-099 groups(p＜0.05),with the decrease of p-MLK3 and p-JNK and increase of p-ERK1/2(p＜0.05).Conclusion NBP can decrease the apoptosis and promote the proliferation of SH-SY5Y cells in-duced by MPP+,which may be associated with inhibiting MLK3 signaling pathway,and regulating the downstream p-JNK and p-ERK1/2.

Parkinson's disease;DL-3-n-butylphthalide;mixed-lineage kinase 3;apoptosis;SH-SY5Y cells

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.11.009

1.華北理工大學(xué)研究生創(chuàng)新項目(No.2017S37)；2.華北理工大學(xué)博士科研啟動基金項目(No.35647699)；3.河北省高等學(xué)校科學(xué)研究青年基金項目(No.QN201722)。

1.華北理工大學(xué)護(hù)理與康復(fù)學(xué)院，河北唐山市063210；2.華北理工大學(xué)冀唐學(xué)院，河北唐山市063210。作者簡介：郭子夢(1990-)，女，漢族，河北新樂市人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)康復(fù)。通訊作者：吳慶文、程月發(fā)。E-mail:wxywqw@163.com(吳慶文)；arthurcy@163.com(程月發(fā))。

R742.5

A

1006-9771(2017)11-1284-06

[本文著錄格式] 郭子夢，吳慶文，陳秀秀，等.丁苯酞通過混合譜系激酶3信號通路對1-甲基-4苯基-吡啶離子誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2017,23(11):1284-1289.

CITED AS:Guo ZM,Wu QW,Chen XX,et al.Effects of DL-3-n-butylphthalide on proliferation and apoptosis of 1-methyl-4-phenylpyridinium-induced SH-SY5Y cells via mixed lineage kinase 3 signaling pathway[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(11):1284-1289.

2017-06-12

2017-07-26)