獼猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采集、分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究

邱銳唐成坤邵榮學(xué)全仁夫

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)V興醫(yī)院 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬江南醫(yī)院

獼猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采集、分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究

邱銳1唐成坤1邵榮學(xué)2全仁夫3

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)V興醫(yī)院 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬江南醫(yī)院

[目的]體外分離培養(yǎng)獼猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs),研究其生長(zhǎng)增殖特性及其向成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力。[方法]采用全骨髓貼壁法純化獼猴骨髓源BMSCs,觀察獼猴BMSCs的生長(zhǎng)情況并運(yùn)用MTT法繪制其生長(zhǎng)曲線；對(duì)其進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)分析，鑒定 BMSCs的生物學(xué)特性；在體外應(yīng)用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含 0.1umol·L-1地塞米松、10mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、10%FBS、50umol·L-1抗壞血酸鈉、維生素C 50mg·L-1)定向誘導(dǎo)分化,對(duì)分化后的細(xì)胞進(jìn)行ALP、Von Kossa染色以鑒定其向成骨誘導(dǎo)的潛能。[結(jié)果]獼猴BMSCs的生長(zhǎng)曲線如下:細(xì)胞在開始培養(yǎng)時(shí)有2d左右的相對(duì)靜止期，3～6d增殖迅速，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，7d后進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞增殖明顯減緩。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：CD44和CD105的表達(dá)率分別為98.20%和95.01%，均呈強(qiáng)陽(yáng)性，而CD34和CD45的表達(dá)率分別為1.38%和3.30%，呈陰性。未進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的第3代獼猴BMSCs，ALP染色呈陰性，未出現(xiàn)紅色顆粒，且不隨時(shí)間而改變；進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的第3代獼猴BMSCs，ALP染色呈陽(yáng)性，第7d細(xì)胞中央出現(xiàn)散在分布的紅色顆粒，并且隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增多顏色也逐漸加深，第14d鏡下紅色顆粒較前增多，且顏色也較前加深，其結(jié)果表明BMSCs在定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞。未進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的第3代獼猴BMSCs，Von Kossa染色呈陰性，且不隨時(shí)間而改變；進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的第3代獼猴BMSCs在第7d Von Kossa染色后鏡下出現(xiàn)黑色沉積樣結(jié)節(jié)，呈散在分布、大小不一，提示有鈣樣基質(zhì)產(chǎn)生，第14d Von Kossa染色后鏡下出現(xiàn)明顯增大的黑色結(jié)節(jié)樣物質(zhì)，且數(shù)量增多、顏色加深。[結(jié)論]通過(guò)全骨髓貼壁分離法可以獲得純度較高的獼猴骨髓源BMSCs,體外培養(yǎng)具有較強(qiáng)的增殖能力,在成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基里可以誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞方向分化，具有良好的成骨分化潛能，是組織工程骨中理想的種子細(xì)胞。

BMSCs；體外培養(yǎng)；細(xì)胞生物學(xué)特征；誘導(dǎo)分化；成骨細(xì)胞；組織工程

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是能夠自我增殖和具有多向分化潛能的細(xì)胞，由Friedenstein等[1]在1966年最先發(fā)現(xiàn)并對(duì)其進(jìn)行闡述。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs具有良好的成骨分化潛能，其誘導(dǎo)分化技術(shù)較成熟，獲取較方便、易分離培養(yǎng)，及免疫原性低等生物學(xué)特性，是組織工程骨較為理想的種子細(xì)胞。種子細(xì)胞[2-3]是組織工程骨研究的重點(diǎn)內(nèi)容，組織工程骨中理想的種子細(xì)胞應(yīng)具備以下幾個(gè)特性：①來(lái)源廣泛，取材方便，并能適應(yīng)于臨床應(yīng)用需要；②細(xì)胞本身增殖性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，傳代培養(yǎng)后依舊有良好的成骨潛能；③種子細(xì)胞必須能夠與生物支架材料有較好的相互作用，且能在材料上迅速增殖；④細(xì)胞的免疫原性低，種植于宿體內(nèi)不引起排斥反應(yīng)，對(duì)宿體的毒性作用和致瘤性小，能適應(yīng)宿體。本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁法從成年獼猴骨髓中獲取BMSCs，對(duì)其體外分離、培養(yǎng)，研究BMSCs的生長(zhǎng)增殖特性及鑒定其向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的能力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為4只年齡4～6歲健康獼猴，體質(zhì)量4.5～7kg，雌雄不限，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滇）K2013-0005、使用許可證號(hào)：SYXK(滇）K2013-0012]，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑及耗材 低糖DMEM培養(yǎng)基（hyclone，批號(hào)：A163310）；胎牛血清（Gibco，批號(hào)：1676593）；雙抗溶液 (100×，hyclone，批號(hào)：L16132):10000units/mL青霉素和10000units/mL鏈霉素溶液；胰蛋白酶（0.25%Trypsin+0.02%EDTA，hyclone，批號(hào)：20160907）；細(xì)胞凍存液：低糖DMEM培養(yǎng)基/FBS/DMSO（二甲基亞砜，Amresco，批號(hào)：16300）按照 7：2：1 的比例分裝，－20℃保存，使用前 4℃解凍；PBS（hyclone，批號(hào)：2016165）；維生素 C(Sigma，批號(hào):16003)；地塞米松(Sigma，批號(hào)：16787):3.9mg加入100mL無(wú)水酒精，0.2μm 濾膜過(guò)濾，分裝；β-甘油磷酸鈉(Sigma，批號(hào)：16357)：9.18g加入30mL三蒸水，0.2μm濾膜過(guò)濾，分裝；茜素紅（上?；鶢栴D生物，批號(hào)：163223）：茜素紅1g、蒸餾水90mL、1%氫氧化銨10mL混合，調(diào)整ph為6.3；抗壞血酸鈉（Sigma，批號(hào)：16689）：0.4g加入10mL 三蒸水，0.2μm濾膜過(guò)濾，分裝；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色試劑盒（上?；鶢栴D生物,批號(hào):161020）；GENMED 細(xì)胞馮庫(kù)薩（Von Kossa）染色試劑盒（上?；鶢栴D生物，批號(hào)：1607235）；CD105,CD44,CD34,CD45抗體，CY3標(biāo)記二抗（Abcam，貨號(hào)：1617145、1617253、1617365、1617396、1617876）；二甲苯（國(guó)藥，批號(hào):130207）；抗原修復(fù)液（無(wú)錫菩禾，批號(hào):20160812）；4%多聚甲醛（國(guó)藥，批號(hào):2016062）；3%H2O2/PBS（無(wú)錫菩禾，批號(hào)：160083）；0.01%Triton-X（無(wú)錫菩禾）；噻唑藍(lán)（MTT，Sigma，批號(hào)：2016081）。

1.3 主要器材 自動(dòng)CO2溫控細(xì)胞培養(yǎng)箱（5060/BB16，美國(guó)Heraeus公司）；超凈細(xì)胞培養(yǎng)工作臺(tái)（SWCF-2FD，上海博訊有限公司）；高速離心機(jī)（5810R，Eppendorf公司）；倒置相差顯微鏡（DMI3000B，Leica公司）；熒光顯微鏡（IX71，Leica公司）；自動(dòng)溫控水浴箱（h1210，Leica公司）；超低溫冰箱（991，F(xiàn)orma Scientific公司）；液氮罐（7403，F(xiàn)orma Scientific公司）；25cm2一次性培養(yǎng)皿、6孔板、24孔板、96孔板、凍存管（J00600、353072、353047、352046、5001-1020，上海諾辰生物技術(shù)有限公司）；移液器（3111000840，Eppendorf公司）；流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，Becton Dickinson公司）；酶標(biāo)儀（MK3型，Thermo公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（8000，Thermo公司）；搖床（TS-1000，Qilinbeier公司）；光學(xué)顯微鏡（XDS-1A，上海嚴(yán)豐精密儀器有限公司）。

1.4 獼猴骨髓標(biāo)本的采集 在中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所手術(shù)室進(jìn)行骨髓標(biāo)本的采集，無(wú)菌環(huán)境下將獼猴進(jìn)行肌肉注射鹽酸氯胺酮（5mg·kg-1）麻醉，麻醉成功后固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)局部備皮、消毒皮膚和鋪消毒洞巾。取一側(cè)獼猴髂后上棘后上方約0.5cm處為穿刺點(diǎn)，術(shù)者左手拇指、食指固定穿刺部位皮膚，右手持骨髓穿刺針垂直刺入，當(dāng)穿刺針接觸到骨質(zhì)后左右旋轉(zhuǎn)，慢慢鉆入骨質(zhì)當(dāng)阻力消失是即達(dá)到骨髓腔，拔出針芯，連接無(wú)菌肝素化注射器，用適當(dāng)力度緩慢抽吸，抽取骨髓10mL，緩慢加入含有肝素6000U的50mL無(wú)菌離心管中。采集結(jié)束后再次插入針芯，旋轉(zhuǎn)拔出穿刺針，局部再次消毒，用消毒紗布蓋在針孔上，再以膠布加壓包扎。

1.5 獼猴BMSCs原代細(xì)胞分離培養(yǎng) 用含肝素的注射器在無(wú)菌條件下抽取骨髓10～15mL；將細(xì)胞懸液按1:1比例加入到Percoll密度梯度離心(2000r/min,25min)；離心后小心吸出富含有核細(xì)胞的界面層，然后加PBS洗滌1～2次，再次離心，去除上清，用1mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，培養(yǎng)液為內(nèi)含10%FBS[添加青霉素、鏈霉素、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸和NaHCO3]，將此混懸液混勻并接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3d換液1次。待原代細(xì)胞融合達(dá)培養(yǎng)皿底部80%～90%以上時(shí)進(jìn)行傳代。

1.6 獼猴BMSCs傳代培養(yǎng) 先用吸管吸去培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液，PBS洗滌3次后，再加入1mL含有0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液，輕輕晃動(dòng)使消化液蓋滿瓶底，至大多數(shù)細(xì)胞從皿底壁脫落，將其移入37℃孵化箱孵育，20min后，加入含有FBS的培養(yǎng)基1mL終止消化，形成均一的單細(xì)胞懸液，接種到另一培養(yǎng)皿，置于5%CO2、37℃飽和濕度箱中培養(yǎng)，隔天換液。取第3代傳代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.7 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定 分別取第1、3、6、9代獼猴BMSCs，按5×102個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每代BMSCs每天取4個(gè)相重復(fù)孔，加入0.5%MTT溶液20μL，在5%CO2，37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h；4h后棄去培養(yǎng)基，加入100μL二甲基亞砜，均勻搖晃。將酶標(biāo)儀上的波長(zhǎng)設(shè)定為570nm，將細(xì)胞懸液置入酶標(biāo)儀測(cè)量光密度（optical density，OD）值。用MTT 法連續(xù)測(cè)定10d，以細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制BMSCs生長(zhǎng)曲線。

1.8 獼猴BMSCs的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及成骨分化潛能鑒定

1.8.1 獼猴BMSCs的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 觀察第3代BMSCs在培養(yǎng)皿上長(zhǎng)達(dá)皿底80%～90%融合時(shí)，以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，加入配制好的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（10%FBS，0.1μmol·L-1地塞米松、10mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、50mg·L-1維生素 C、50μmol·L-1抗壞血酸鈉)，置于5%CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

1.8.2 細(xì)胞ALP染色 將加與不加成骨誘導(dǎo)液的第3代BMSCs，于培養(yǎng)的第3d、第7d和第14d進(jìn)行ALP染色：先加入ALP固定液固定3min，水洗；然后在濕盒中滴加配置好的ALP孵育液，孵育15～20min，水洗；最后蘇木素染色液復(fù)染5～8min；水洗后鏡檢拍照。

1.8.3 細(xì)胞Von Kossa染色 將加與不加成骨誘導(dǎo)液的第3代BMSCs，于培養(yǎng)的第3d、第7d和第14d進(jìn)行Von Kossa染色，吸干培養(yǎng)基后用丙酮固定30s，三蒸水漂洗2次，自然晾干；每孔根據(jù)Von Kossa染色試劑盒說(shuō)明加入2mL新配制的5%硝酸銀溶液，均勻混合后置于暗室內(nèi)避光30～60min；將培養(yǎng)皿中液體吸干再用雙蒸水反復(fù)沖洗3次，用5%的硫代硫酸鈉孵育2～3min；雙蒸水流水沖洗2min后用核固紅孵育5min；雙蒸水流水沖洗2min后盡快用無(wú)水酒精脫水后觀察拍照。

1.8.4 獼猴BMSCs流式細(xì)胞儀分析 鏡下觀察正常生長(zhǎng)的第3代獼猴BMSCs細(xì)胞，等到細(xì)胞幾乎完全融合于培養(yǎng)皿底時(shí)，去除培養(yǎng)基；以PBS洗滌細(xì)胞層，再以含0.25%胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖液浸泡5min，使細(xì)胞脫落，制成單細(xì)胞懸液，置于流式管中；調(diào)整待檢測(cè)細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，取 200uL，在4℃下離心（1000r/min）5min；去除上清液，用 1mLPBS洗滌兩次，將細(xì)胞重懸于100uL PBS，孵育2h后檢測(cè)：收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，去上清加1mL1%BSA/PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心棄上清；加1%BSA/PBS緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×106/mL，取500μL至1.5mLEP管中，1000r/min離心5min，去上清；每管各加入4%多聚甲醛0.1mL固定30min，加1%BSA/PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，1000r/min離心5min，去上清，重復(fù)3次；一抗4℃孵育1h；加1%BSA/PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，1000r/min離心5min，去上清，洗滌3次；加Antimouse-CY3熒光二抗，4℃孵育1h，洗滌3次，置于冰上；調(diào)整合適的細(xì)胞濃度，上樣，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 獼猴BMSCs細(xì)胞形態(tài)的觀察 獼猴BMSCs原代細(xì)胞接種48h后首次換液，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞形態(tài)多樣，分布不均勻，常見(jiàn)為圓形、短棒形及梭形等，部分呈巢狀聚集生長(zhǎng)，細(xì)胞向四周延展，培養(yǎng)液中可見(jiàn)少量的透亮圓形血細(xì)胞，第4d貼壁細(xì)胞數(shù)量較多（圖1-A）。第7～9d貼壁細(xì)胞迅速增殖，9d左右細(xì)胞基本長(zhǎng)滿。第1傳代細(xì)胞48h后細(xì)胞基本貼滿培養(yǎng)皿底，細(xì)胞形態(tài)趨于一致（圖1-B），72h后細(xì)胞呈漩渦樣排列（圖1-C）。第2代細(xì)胞生長(zhǎng)情況與第一代基本類似，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度較快，3～4d基本可貼滿培養(yǎng)皿底，細(xì)胞多呈梭形，形態(tài)變化不明顯（圖1-D）。前5代細(xì)胞生長(zhǎng)情況基本類似，第2～5代細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度較第1代快；第6～9代的細(xì)胞增殖速度較慢，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)三角形、長(zhǎng)柱形等不規(guī)則形狀，細(xì)胞體積也較前5代大，第7代之后的細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)空泡出現(xiàn)細(xì)胞凋亡比例增大。

2.2 獼猴BMSCs生長(zhǎng)曲線 運(yùn)用MTT法測(cè)量OD值繪制第 1、3、6、9代獼猴BMSCs生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞在開始培養(yǎng)時(shí)有2d左右的相對(duì)靜止期，第3代和第6代 BMSCs貼壁 3～6d增殖迅速，7d后進(jìn)入平臺(tái)期,細(xì)胞增殖明顯減緩；第1代細(xì)胞及第9代細(xì)胞 1～3d增殖速度較第3、6代細(xì)胞慢，但進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后第1代細(xì)胞增殖加快，第7d進(jìn)入平臺(tái)期后細(xì)胞數(shù)量與第3、6代無(wú)明顯差別，而第9代細(xì)胞對(duì)數(shù)期較其他傳代細(xì)胞縮短，平臺(tái)期細(xì)胞數(shù)量也明顯低于其他三代（P＜0.05）。見(jiàn)圖 2。

圖1 倒置顯微鏡下獼猴BMSCs形態(tài)（100×）Fig.1 Morphological observation of BMSCs（100×）

圖2 獼猴BMSCs各代生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of cells at different generations

2.3 ALP染色 未進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的第3代獼猴BMSCs，在第3d、第7d和第14d時(shí)進(jìn)行ALP染色，鏡下均未見(jiàn)紅色顆粒，ALP染色呈陰性。進(jìn)行成骨誘導(dǎo)后的第3代獼猴BMSCs在誘導(dǎo)3d時(shí)進(jìn)行ALP染色，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中開始出現(xiàn)散在分布的紅色顆粒，已出現(xiàn)ALP染色的陽(yáng)性指征；第7d鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中紅色明顯增多，顏色逐漸加深，細(xì)胞多呈梭形，細(xì)胞間排列緊密；第14d鏡下發(fā)現(xiàn)紅色顏色最深。見(jiàn)圖3。

圖 3 BMSCs ALP染色結(jié)果（100×）Fig.3 BMSCs alkaline phosphatase staining results（100×）

2.4 Von Kossa染色 未進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的第3代獼猴BMSCs，不管在第3d、第7d和第14d時(shí)進(jìn)行Von Kossa染色，鏡下未見(jiàn)黑色的礦化物沉積，Von Kossa染色呈陰性。進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的第3代獼猴BMSCs在第3d進(jìn)行Von Kossa染鏡下也無(wú)黑色礦化結(jié)節(jié)；第7d染色后鏡下出現(xiàn)密集的黑色沉積樣結(jié)節(jié)，散裝分布，大小不均一，提示有鈣樣基質(zhì)產(chǎn)生；第14d染色后鏡下黑色結(jié)節(jié)樣物質(zhì)明顯增大，數(shù)量增多，顏色加深。見(jiàn)圖4。

圖 4 BMSCs Von Kossa染色結(jié)果（200×）Fig.4 BMSCs Von Kossa staining results（200×）

2.5 流式細(xì)胞術(shù)鑒定 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析正常生長(zhǎng)的第3代獼猴BMSCs表面標(biāo)志表達(dá)情況，測(cè)得CD44表達(dá)率為98.20%，CD105表達(dá)率為95.01%，呈強(qiáng)陽(yáng)性；而CD34表達(dá)率為1.38%、CD45表達(dá)率分別為3.30%，呈陰性，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定結(jié)果。見(jiàn)圖5。

3 分 析與討論

圖5 流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果Fig.5 Flow cytometry analysis results

近年來(lái),隨著現(xiàn)代干細(xì)胞工程研究的發(fā)展，研究者們已成功地分離了大鼠、小鼠、兔、狗和牛的骨髓BMSCs,而人BMSCs的研究則成為學(xué)者們研究的重點(diǎn)。但是,由于生物醫(yī)用材料準(zhǔn)許運(yùn)用于人體內(nèi)必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的原因,使得目前人BMSCs在體內(nèi)研究方面受到一定限制。獼猴是在進(jìn)化中接近于人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物,將其運(yùn)用于組織工程研究能夠模擬人體的內(nèi)部環(huán)境,為組織工程最終運(yùn)用于臨床打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。但是獼猴因價(jià)格昂貴，其BMSCs的分離技術(shù)的研究相對(duì)較少。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs的分離技術(shù)和方法主要有以下4種[4-5]：免疫磁珠法、流式細(xì)胞儀分離法、密度梯度離心法和全骨髓貼壁法。然而應(yīng)用流式細(xì)胞儀分離法或免疫磁珠法,對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高,骨髓需求量大，分離過(guò)程會(huì)影響細(xì)胞的活性，甚至導(dǎo)致細(xì)胞完全失去活性[6]；而使用percol1分離液梯度離心的方法是將BMSCs和造血干細(xì)胞分離開來(lái),但是其分離液存在一定的細(xì)胞毒性對(duì)細(xì)胞的活性有影響[7]。所以本實(shí)驗(yàn)采用的是全骨髓貼壁培養(yǎng)法，是利用了BMSCs能貼壁生長(zhǎng)而造血系干細(xì)胞不能貼壁生長(zhǎng)的特性，再通過(guò)多次更換細(xì)胞培養(yǎng)液的方法將懸浮的造血細(xì)胞去除從而獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行BMSCs原代細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和純化[8]。

實(shí)驗(yàn)中對(duì)全骨髓貼壁分離法分離所得的BMSCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果顯示：獼猴原代BMSCs培養(yǎng)48h時(shí)出現(xiàn)貼壁，第7～10d貼壁細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)皿，成熟的BMSCs細(xì)胞多呈梭型，多呈漩渦樣或魚群樣分布，且呈聚集生長(zhǎng)的趨勢(shì)。以1:3比例傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)方式基本一致，其增殖的速度明顯高于原代細(xì)胞，培養(yǎng)3～4d可基本貼滿培養(yǎng)皿底部。第6代以后的BMSCs在多次的傳代實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖速度明顯減緩，且細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)三角形、多邊形及不規(guī)則形，若繼續(xù)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)部則出現(xiàn)空泡狀，考慮細(xì)胞開始老化、凋亡。對(duì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)觀察情況分析，表明其與BMSCs的特性相符[9-10]。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，CD44的表達(dá)率為98.20%、CD105的表達(dá)率為95.01%，均呈強(qiáng)陽(yáng)性，而CD34的表達(dá)率為為1.38%、CD45的表達(dá)率為3.30%，均呈陰性。研究證實(shí)CD44作為鑒定BMSCs的表面抗原已得到較多的共識(shí)[11]；而CD105也已被證明同時(shí)存在于BMSCs和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，是人類內(nèi)皮細(xì)胞增殖的最理想指示劑[12]；另外研究表明CD45和CD34均存在于造血系細(xì)胞中[13]。本實(shí)驗(yàn)中CD45和CD34在BMSCs的分離培養(yǎng)中呈陰性，基本排除了造血干細(xì)胞及白細(xì)胞等對(duì)BMSCs的分離和提純的干擾。因此，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明其符合BMSCs的生物學(xué)特性。

ALP是成骨細(xì)胞的一種外酶，它的表達(dá)活性是成骨細(xì)胞分化的一個(gè)明顯特征[14]，其活性的高低可反映細(xì)胞的成骨分化能力[15]，也是鑒定成骨細(xì)胞的分化標(biāo)志[16]，在BMSCs的體外鈣化中ALP起著關(guān)鍵作用，如果ALP失去活性，鈣化也將停止[17]。實(shí)驗(yàn)中對(duì)第3代獼猴骨髓BMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)后的第3d進(jìn)行ALP染色，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中央出現(xiàn)散在分布的紅色顆粒，并且隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增多顏色也逐漸加深；第14d鏡下發(fā)現(xiàn)紅色較前增多，且顏色也較前加深，結(jié)果表明定向誘導(dǎo)BMSCs后分化為成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞。有研究指出，ALP最先出現(xiàn)在BMSCs中央，其生長(zhǎng)受到中央細(xì)胞密集接觸的抑制，當(dāng)BMSCs誘導(dǎo)分化后ALP的mRNA表達(dá)增高，12d達(dá)到頂峰[18]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Von Kossa染色是鑒定鈣結(jié)節(jié)的經(jīng)典方法，而鈣結(jié)節(jié)的形成為成骨細(xì)胞特有，故其成為鑒定成骨分化和確定細(xì)胞外基質(zhì)礦化的產(chǎn)用方法，是利用了硝酸銀與鈣鹽的化學(xué)發(fā)應(yīng)形成銀鹽，在強(qiáng)光或紫外光下生成可見(jiàn)的金屬銀，鈣沉積陽(yáng)性的細(xì)胞呈黑色，并呈現(xiàn)粉紅色的細(xì)胞質(zhì)和紅色的核[19-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的第3代獼猴BMSCs，Von Kossa染色呈陰性，且不隨時(shí)間而改變；進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的第3代獼猴BMSCs在第7d Von Kossa染色后鏡下出現(xiàn)黑色沉積樣結(jié)節(jié)，呈散在分布、大小不一，提示有鈣樣基質(zhì)產(chǎn)生；第14d Von Kossa染色后鏡下出現(xiàn)的黑色沉積結(jié)節(jié)樣物質(zhì)較前明顯增大、數(shù)量增多、顏色加深。根據(jù)上述兩種染色方法的結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALP出現(xiàn)較早，可以認(rèn)為其對(duì)BMSCs成骨分化的敏感度較高，對(duì)BMSCs的成骨分化進(jìn)行早期鑒定提供依據(jù)，而Von Kossa染色對(duì)成骨細(xì)胞具有相對(duì)特異性，因此，可以推測(cè)獼猴BMSCs在成骨誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)下可以向成骨細(xì)胞方向分化，具有良好的成骨分化潛能。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了全骨髓貼壁分離法可以分離培養(yǎng)純度較高的獼猴骨髓BMSCs，通過(guò)體外分離、培養(yǎng),觀察了BMSCs細(xì)胞體外的生長(zhǎng)傳代方式及其生物學(xué)特性,并通過(guò)對(duì)獼猴BMSCs進(jìn)行ALP染色及Von Kossa染色顯示了其具有良好的成骨分化潛能，證實(shí)了獼猴骨髓BMSCs是組織工程骨中理想的種子細(xì)胞，為下一步運(yùn)用該細(xì)胞與三維打印制備高分子（二氧化鋯/羥基磷灰石）多孔支架材料共培養(yǎng)構(gòu)新型建組織工程人工骨修復(fù)骨缺損研究奠定基礎(chǔ)[21]。

[1] Fridenstein A,Piatetskii S,Petrakova KV.Osteogenesis in transplants of bone marrow cells[J].Arkh Anat Gistol Embriol,1969,56(3):3-11.

[2] 馮萬(wàn)文,萊浙軍,李小民,等.細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)種子細(xì)胞特征及體內(nèi)成軟骨活性[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008,12(3):442-446.FENG Wanwen,LAI Zhejun,LI Xiaomin,et al.Characteristics of co-culture of autogenic bone marrow mesenchymal stem cells with chondrocytes as seed cells and in vivo chondrogenic activity[J].ournal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research,2008,12(3):442-446.

[3] Ozdal-Kurt F,Tu lu I,Vatansever HS，et al.The effect of autologous bone marrow stromal cells differentiated on scaffolds for canine tibial bone reconstruction[J].Biotech Histochem,2015,90(7):516-528.

[4] Beeravolu N,McKee C,Alamri A,et al.Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta[J].J Vis Exp,2017,3(122):1-13.

[5] 馬釗,胡向東,費(fèi)琦,等.家兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞離心法分離培養(yǎng)和鑒定[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2015,12(16):1330-1332.MA Zhao,HU Xiangdong,FEI Qi,et al.Study on isolation and cultivation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells through gradient centrifugation[J].Journal of Clinical and Experimental Medicine，2015,12(16):1330-1332.

[6] Ferrin I,Beloqui I,Zabaleta L,et al.Isolation,Culture,andExpansion ofMesenchymalStem Cells[J].Methods Mol Biol,2017,190(21):177-190.

[7] Martin D,Xu J,Porretta C, et al.Neurocytometry:Flow Cytometric Sorting of Specific Neuronal Populations from Human and Rodent Brain[J].ACS Chem Neurosci,2017,8(2):356-367.

[8] Goldberg A,Mitchell K,Soans J,et al.The use of mesenchymal stem cells for cartilage repair and regeneration:a systematic review[J].Orthop Surg Res,2017,12(1):39.

[9] 汪群力,裴國(guó)獻(xiàn),曾憲利,等.成年恒河猴骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2004,6(7):12-14.WANG Qunli,PEI Guoxian,ZENG Xianli,et al.Culture of the BMSCs of adult rhesus in vitro[J].Chinese Journal of Orthopaedic Trauma,2004,6(7):12-14.

[10]佟雁翔,馮衛(wèi),蘇依拉其木格,等.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)后表面MHC抗原的表達(dá)[J].中國(guó)組織工程研究,2015,15(32):5108-5112.TONG Yanxiang,FENG Wei,SUyilaqimuge,etal.MHC antigen expression on the surface of bone marrow stromal stem cells after directional induction in vitro[J].Chinese JournalofTissue Engineering Research,2015,15(32):5108-5112.

[11]De SC,Meyer E,Gr VDW,et al.Markers of stemness in equine mesenchymal stem cells:a plea for uniformity[J].Theriogenology,2011,75(8):1431-1443.

[12]Kern S,Eichler h,Stoeve J,et al.Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow,umbilical cord blood,or adipose tissue[J].Stem cells,2006,24(5):1594-1301.

[13]FAN Wenshuai,LI Jinghuan,WANG Yiming,et al.CD105 promotes chondrogenesis of synovium-derived mesenchymal stem cells through Smad2 signaling[J].Biochemical and biophysical research communications,2016,474(2):152.

[14]Deans RJ,Moseley AB.Mesenchymal stem cells:biology and potential clinical uses[J].Exp hematol,2000,28(8):875-884.

[15]張英,袁月,孫富麗.成骨細(xì)胞胞內(nèi)胞外堿性磷酸酶含量比較[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,40(10):874-876,884.ZHANG Ying,YUAN Yue,SUN Fuli.Comparison between the Extracellular and Intracellular Alkaline Phosphatase Level of the Primary Cultured Osteoblast Cells[J].Journal of China Medical University,2011,40(10):874-876,884.

[16]宋擇眾.通過(guò)檢測(cè)堿性磷酸酶和骨鈣素2的表達(dá)水平定量分析組織工程骨成骨影響因素[D].濟(jì)南：山東大學(xué),2015:25-32.SONG Zezhong.Quantitative analysis of factors influencing tissue-engineered bone formation by detecting the expression levels of alkaline phosphatatase and bone-carboxyglutamate protein 2[D].JiNan,Shan Dong University,2015:25-32.

[17]Kruppke B,Farack J,Wagner AS3,et al.Gelatine modified monetite as abone substitute material:An in vitro assessment of bonebiocompatibility[J].Acta Biomater,2016,1(32):275-285.

[18]Mechiche Alami S,Gangloff SC,Laurent-Maquin D,et al.Concise Review:In Vitro Formation of Bone-Like Nodules Sheds Light on the Application of Stem Cells for Bone Regeneration[J].Stem Cells Transl Med,2016,5(11):1587-1593.

[19]孫崇然,劉恩重.Von Kossa染色的方法改進(jìn)[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,40(1):70-71.SUN Chongran,LIU Enzhong.Improved method of von Kossa staining[J].Journal of Harbin Medical University,2006,40(1):70-71.

[20]Bonewald LF,Harris SE,Rosser J,et al.Von Kossa staining alone is not sufficient t to confirm that mineralization in vitro represents bone formation[J].Calcified Tissue International,May 2003,72(5):537-547.

[21]邵榮學(xué),全仁夫,王拓,等.復(fù)合骨髓間質(zhì)干細(xì)胞和BMP-2的HA/ZrO2泡沫陶瓷修復(fù)獼猴腰椎椎體缺損[J].中華骨科雜志,2016,36(19):1243-1253.SHAO Rongxue,QUAN Renfu,WANG Tuo,et al.Novel porous gradient HA/ZrO2 engineering bone carrying gelatin/chitosan slow-release hydrogel loading BMP-2 and BMSCs repair vertebra defect in rhesus macaque[J].Chinese Journal of Orthopaedics,2016,36(19):1243-1253.

Studies on the Extraction,Isolation,Culture and Biological Characteristics of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells(BMSCs)from Macaca Mulatta

QIU Rui,TANG Chengkun,SHAO Rongxue,et al Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)

[Objective]BMSCs were cultured in vitro and cultured in vitro.To study the growth and proliferation characteristics of osteoblasts.[Methods]The growth status of BMSCs was studied by whole bone marrow adherence method.The growth curve of BMSCs was observed and the growth curve was drawn by MTT method.The biological characteristics of BMSCs were identified by flow cytometry;In vitro osteogenic induction culture medium(containing 0.1umol·L-1dexamethasone,10mmol/ β -glycerophosphate,10%FBS,50umol·L-1sodium ascorbate,vitamin C 50mg·L-1),the cells were subjected to ALP,Von Kossa staining assay to identify their potential for osteogenesis induction.[Results]The original BMSCs of Rhesus monkey bone marrow were adhered for 48 hours,and the adherent cells were basically covered with Petri dishes from 7th to 10th day.The mature BMSCs cells were mostly shuttle type,mostly swirling or fish-like distribution and aggregated trend;The growth curve of monkey BMSCs showed that the cells had a relatively stationary phase of about 2 days at the beginning of culture,3 to 6 days of rapid growth,logarithmic growth,7 days later into the plateau,cell proliferation was slown down.Flow cytometry results showed:CD44 and CD105 expression was 98.20%and 95.01%respectively,was strongly positive,while the expression rates of CD34 and CD45 were 1.38%and 3.30%respectively;ALP staining was performed on the third day after osteogenesis of bone marrow BMSCs in the third generation.It was found that the red particles scattered in the center of the cells appeared and gradually increased with the prolongation of induction time.The results showed that BMSCs induced differentiation of osteoblasts and osteoblasts in osteoblasts,and the results showed that BMSCs could differentiate into osteoblasts and osteoblasts;Osteoblast-induced third-generation monkeys BMSCs,Von Kossa staining was negative and did not change with time;Osteogenic induction of the third generation of rhesus monkey BMSCs on the 7th day after Von Kossa staining showed black deposition-like nodules,scattered in the distribution of different sizes,suggesting that calcium-like matrix production;On the 14th day,Von Kossa stained with microscopic increased black nodular samples,and the number increased,the color was deepened.[Conclusion]BMSCs derived from bone marrow adherence method have strong ability to proliferate in vitro and can induce osteoblast differentiation in osteoblast inducer medium,and have good osteogenic differentiation potential.Rhesus monkey bone marrow source BMSCs is the ideal cell seed for bone tissue engineering.

bone marrow mesenchymal stem cells；cultured in vitro；cell biological feature;induced differentiation；osteoblasts;tissue engineering

R282

A

1005-5509（2017）11-0847-08

10.16466/j.issn1005-5509.2017.11.001

浙江省重大科技專項(xiàng)（2014C13SA190012）

Fund project:Great sci-tech special program in Zhejiang Province（2014C13SA190012）

全仁夫，E-mail：spinequan@yahoo.com

2017-05-17）