低氧調(diào)控EIMD后肌細(xì)胞膜損傷MAPK機(jī)制的探索與驗證

徐 飛，黃巧婷，曹建民，王 平，徐玉明

低氧調(diào)控EIMD后肌細(xì)胞膜損傷MAPK機(jī)制的探索與驗證

徐 飛1，黃巧婷2，曹建民2，王 平1，徐玉明1

目的：探索運(yùn)動性肌損傷（EIMD）后低氧調(diào)控肌細(xì)胞膜損傷的MAPK機(jī)制，并進(jìn)行驗證。方法：健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組、常氧24 h、48 h、72 h組和低氧24 h、48 h、72 h組。大鼠以EIMD運(yùn)動模型進(jìn)行間歇性下坡跑離心運(yùn)動，腹腔注射伊文氏藍(lán)熒光染色劑（EBD），取腓腸肌樣本，用激光共聚焦顯微鏡觀察EBD切片和陽性細(xì)胞率（PRC）評價膜損傷。用RT-qPCR和Western blot測定MAPK的ERK1/2、JUN、p38和BMK1的mRNA表達(dá)、蛋白含量和磷酸化水平。再開展抑制劑實驗以確認(rèn)低氧調(diào)控膜損傷MAPK機(jī)制中的關(guān)鍵信號通路。結(jié)果： EIMD后，低氧與常氧各組均出現(xiàn)明顯膜損傷，低氧各組陽性細(xì)胞率顯著高于常氧各組和對照組（P＜0.01）。低氧組ERK1、p38和BMK1通路的mRNA表達(dá)、蛋白含量和磷酸化水平顯著高于常氧對應(yīng)組（P＜0.05），JNK信號通路蛋白含量和磷酸化水平無顯著變化（P＞0.05）。抑制劑實驗結(jié)果表明，ERK1/2和p38抑制劑組的蛋白含量和磷酸化水平無顯著變化（P＞0.05）。BMK1抑制劑組24 h、48 h的磷酸化水平、陽性細(xì)胞率顯著低于安慰劑對應(yīng)組（P＜0.001），且與對照組無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)論：1）EIMD后低氧明顯加劇膜損傷并造成損傷峰值前移。2）低氧調(diào)控膜損傷主要通過BMK1通路實現(xiàn)，抑制BMK1磷酸化能阻止低氧對膜損傷的加劇作用。BMK1/ERK5通路是低氧調(diào)控EIMD后膜損傷MAPK機(jī)制的關(guān)鍵途徑。

低氧；運(yùn)動性肌損傷；肌細(xì)胞膜；細(xì)胞信號通路；絲裂原活化蛋白激酶

前言

運(yùn) 動 性 肌 損 傷（exercise-induced muscle damage，EIMD）會導(dǎo)致肌纖維微損傷并伴隨延遲性肌肉酸痛（DOMS）癥狀［40］。高原/低氧引起骨骼肌適應(yīng)性萎縮和低氧（缺氧）對肌肉代謝［25，32］及細(xì)胞生物學(xué)功能的影響［25，32］一直是醫(yī)學(xué)和訓(xùn)練學(xué)的研究熱點，但因機(jī)制不明，高原/低氧訓(xùn)練后EIMD的有效恢復(fù)手段一直頗有爭議。有探索性研究發(fā)現(xiàn)，低氧應(yīng)激會影響骨骼肌細(xì)胞肌節(jié)外骨架蛋白的完整性［30，39］，提示，低氧會影響肌細(xì)胞和細(xì)胞膜損傷后修復(fù)過程。Chen等［14］（2016）發(fā)現(xiàn)，骨骼肌特異性LKB1基因敲除鼠在跑臺運(yùn)動后肌肉微損傷炎癥反應(yīng)降低，同期伴隨絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinases，MAPK）活性顯著增加，提示MAPK可能參與肌纖維損傷后的修復(fù)。Kim等［21］（2016）通過培養(yǎng)C2C12骨骼肌細(xì)胞證實MAPK參與了肌細(xì)胞的修復(fù)過程。Gonzalez等［16］（2016）和Nicoll等［27］（2016）通過人體實驗（肌肉活檢）證實了Kim等的結(jié)論。所以，低氧可能通過MAPK信號通路調(diào)控EIMD后肌細(xì)胞的修復(fù)過程。

細(xì)胞外刺激通過MAPK途徑將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)及核內(nèi)而影響細(xì)胞增殖、發(fā)育、老化及凋亡等生物學(xué)反應(yīng)［20，31］。MAPK通過整合不同受體系統(tǒng)有關(guān)的信號和（或）通過核轉(zhuǎn)位激活下游底物而起樞紐作用［20］，其主要涉及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38以及大絲裂原活化蛋白激酶1/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（BMK1/ERK5）①此通路在文獻(xiàn)中有BMK1/ERK5、BMK1和ERK5 3種表述方式，為簡練表達(dá)并與ERK1/2通路區(qū)別，本文采用BMK1表述。但在引用文獻(xiàn)內(nèi)容時，尊重并保留原文獻(xiàn)中BMK1/ERK5或ERK5的表述。4條信號通路［20，31］。有研究已發(fā)現(xiàn)，大運(yùn)動量和（或）大強(qiáng)度間歇訓(xùn)練［4，7，16，17］、抗阻運(yùn)動［13］、耐力訓(xùn)練［6，8，9］均可激活MAPK通路，離體（in vitro）實驗也發(fā)現(xiàn)，MAPK激活與肌細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)［14，21，29，32］。但EIMD后是否激活MAPK通路，以及低氧是否通過MAPK通路調(diào)節(jié)EIMD后肌細(xì)胞和膜損傷的修復(fù)情況，目前未見報道。一項有價值的研究發(fā)現(xiàn)，選擇性抑制MAPK家族的MEK1/2信號通路，能通過影響低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）而調(diào)控IGF-1的濃度和活性［34］。這搭建了研究低氧通過MAPK調(diào)控肌細(xì)胞生物學(xué)功能的橋梁。但MAPK涉及的4條信號通路包含復(fù)雜的信號級聯(lián)反應(yīng)，若能夠明確低氧通過MAPK調(diào)控EIMD后肌細(xì)胞和細(xì)胞膜損傷的具體途徑，對于理解低氧調(diào)控EIMD的機(jī)制、改進(jìn)高原/低氧訓(xùn)練方法、探索有效恢復(fù)手段和提高訓(xùn)練效果均有參考價值。所以，本研究通過大鼠EIMD模型，研究EIMD后低氧對細(xì)胞膜通透性的影響，探索低氧調(diào)控EIMD膜損傷效果及與MAPK各信號通路的關(guān)系。再通過測定抑制MAPK各信號通路對膜損傷的影響，明確MAPK信號通路中有關(guān)低氧調(diào)控EIMD后膜損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)與分組

1.1.1 低氧觀察實驗

56只8周齡雄性SD大鼠，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料分籠飼養(yǎng)，室溫22±2℃，相對濕度30%～60%。自由飲食進(jìn)水，12/12 h光照/熄燈模擬晝夜交替。大鼠隨機(jī)分為7組：安靜對照組（C），運(yùn)動后常壓常氧（Normoxia）休息24 h組（N24）、48 h組（N48）、72 h組（N72）以及運(yùn)動后常壓低氧（Hypoxia）24 h組（H24）、48 h（H48）、72 h組（H72）。

1.1.2 抑制劑實驗

72只8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為9組，除空白對照組（B組）外，其余各組注射MAPK各信號通路的抑制劑（Inhibitor，I-）或安慰劑（Placebo，Pl-），每一抑制劑或安慰劑組分為運(yùn)動后低氧24 h、48 h組（分別為I-ERK 24 h和48 h組、I-BMK1 24 h和48 h組、I-p38 24 h和48 h、Pl-24 h和48 h組）。

1.2 實驗標(biāo)本制備

1.2.1 低氧EIMD動物模型制備

除C組外的各組大鼠在常氧下進(jìn)行為期4天的適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，待恢復(fù)后依據(jù)經(jīng)典的大鼠骨骼肌損傷模型［10］，在常壓低氧環(huán)境（氧濃度為12.7%）進(jìn)行間歇性下坡跑運(yùn)動（離心運(yùn)動）。運(yùn)動參數(shù)：在－16°坡度以26.8 m/min速度運(yùn)動5 min×10組，組間間歇1 min。

1.2.2 伊文氏藍(lán)（Evans blue dye，EBD）鑒定膜損傷

各組大鼠處死前24 h腹腔注射EBD（Sigma，USA）熒光染色劑，觀察膜通透性變化以鑒別損傷模型。EBD注射前經(jīng)Millex-GP 0.22 μm過濾器（Millipore，Bedford，MA，USA）滅菌，劑量為1 mg EBD/0.1 mL PBS（pH7.4）/10 g體重。預(yù)實驗結(jié)果顯示，大鼠運(yùn)動后細(xì)胞膜通透性改變，24 h、48 h尤為明顯，成功模擬離心運(yùn)動導(dǎo)致的骨骼肌損傷。

1.2.3 抑制劑注射

先將抑制劑（Selleck，USA）溶解于配好的10% DMSO中，現(xiàn)配現(xiàn)用。抑制劑各組大鼠運(yùn)動后即刻進(jìn)行腹腔注射（安慰劑組注射載體DMSO）。然后置于低氧環(huán)境恢復(fù)，48 h組在低氧24 h后再注射一次，抑制劑抑制的信號通路和劑量見表1。

表1 本研究MAPK信號通路抑制劑使用情況Table 1 The Usage Discritption of Inhibitors of the MAPK Related Signaling Pathway

1.2.4 取材與處理

用2%的戊巴比妥鈉（2.3 mL/kg）腹注麻醉，迅速分離左側(cè)腓腸肌內(nèi)側(cè)頭，留取表層中段肌纖維，切塊凍存。再分離右側(cè)腓腸肌，于冰上切取3×3×5 mm3，OCT包埋后用液氮預(yù)冷的正己烷（－70℃）速凍，錫紙包裹好后放入液氮，以備制作冷凍切片。

1.3 測試指標(biāo)與方法

1.3.1 細(xì)胞膜完整性

Leica冰凍切片機(jī)（CM 1850，Germany）將EBD染色組織塊切出6 μm厚度樣本，熒光顯微鏡568 nm檢測。激光共聚焦顯微鏡（Leica sp8，Germany）觀察EBD切片，測量左、右、上、下、中部5個視野，用IPP 6.0光密度分析軟件（USA）統(tǒng)計EBD陽性率細(xì)胞（Positive Ratio of Cells，PRC），鑒別肌纖維細(xì)胞膜完整性改變的范圍及程度。1.3.2 Western blot（WB）

預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑（磷酸化蛋白需同時加入磷酸酶抑制劑）。蛋白抽提前加入0.1 mol/L PMSF母液，稱取組織重量后加入裂解液，電動勻漿完成后在冰上孵育20 min以13 000 r/min 4℃離心20 min，取上清分裝保存待測。用BCA法測定勻漿液蛋白濃度。據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量，配制對應(yīng)濃度分離膠和濃縮膠，樣品上樣量20 μg/孔進(jìn)行電泳。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，完成后用麗春紅染色劑對膜染色。隨后將膜完全浸沒于3% BSA-TBST中，室溫輕搖30 min，加稀釋后的一抗（兔多抗）室溫孵育。第2天室溫孵育后洗膜，稀釋二抗加膜反應(yīng)后晾干拍照，處理條帶并計算IOD值，β-tubulin（鼠單抗）為內(nèi)參。

1.3.3 實時熒光定量RT-qPCR

RT-qPCR法檢測MAPK相關(guān)通路核心分子mRNA表達(dá)，PCR擴(kuò)增引物（Invitrogen公司）序列（5’ to 3’）：p38上下游引物（115 bp）分別為AGTCCTATCCACGCACCTCA、GTCCCGTTTCCTGCACCAC；BMK1上 下 游 引 物（108 bp）分 別 為TCTCCAGACTGCCCCTTCCACTA、CCAGATGGGAAGTAAGGCAGAAC；JNK上 下 游 引物（114 bp）分 別 為TATGATTTCTAGCCTCTCACCT、TCTATAACCCAAGAGGCACGAC；ERK1上 下 游 引 物（177 bp）分別為CATTGTTCAGGACCTCATGGAGACG、CAGGTGGTGTTGATAAGCAGATTGG；ERK2上 下游 引 物（137 bp）分 別 為TGGAGCTGGACGACTTAC、GACACCGACATCTGAACG；內(nèi) 參GAPDH上 下 游引 物（138 bp）分 別 為TGGAGTCTACTGGCGTCTT、TGTCATATTTCTCGTGGTTCA。用超純RNA試劑盒（CWbio，Cat#CW0581）提取組織樣本總RNA，取5μL RNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，DNaseⅠ試劑盒（CWbio，Cat#CW2090）對RNA殘留基因組DNA進(jìn)行消化處理，HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒（CWbio，Cat#CW0744）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，ABI7500型熒光定量PCR儀，2﹣△△CT法進(jìn)行相對定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 EIMD動物模型鑒定

除C組肌纖維無明顯EBD染料侵入外，低氧和常氧組急性離心運(yùn)動后出現(xiàn)明顯EBD陽性纖維（圖1A）。低氧各組與常氧對應(yīng)組之間PRC有顯著差異（P＜0.01），N48組骨骼肌陽性細(xì)胞率（PRC）達(dá)峰值（20.50±7.20）；而低氧組峰值（21.00±7.69）高于常氧組（P＞0.05），峰值出現(xiàn)時間（24 h）①EBD注射時間點為運(yùn)動后即刻。早于常氧組（48 h）。說明，低氧造成膜損傷時間提前。H72組的PRC停留在H48組水平，顯著高于N72組和C組水平，N72組（3.17±1.72）接近C組水平（P＞0.01）。

圖1 EIMD后低氧暴露對膜損傷的影響Figure 1. Effect of Hypoxia on Sarcolemma Injury after EIMD

2.2 EIMD后低氧加劇膜損傷時MAPK各信號通路基因表達(dá)、蛋白含量和磷酸化水平的變化

雙因素方差分析結(jié)果如表2所示，MAPK各信號通路蛋白含量和磷酸化的Western blot測試結(jié)果如圖2所示。當(dāng)交互作用顯著時，考察低氧或暴露時間的單一因素對MAPK通路的作用沒有意義，故須區(qū)分低氧在時間因素的不同水平（24 h、48 h和72 h）作用的大小。結(jié)果顯示，除p-BMK1外，MAPK各通路相關(guān)指標(biāo)低氧×暴露時間的交互作用不顯著，與本實驗考察低氧作為主要因素（主效應(yīng)）影響MAPK各信號通路的研究假設(shè)相符。所以，除分析低氧對BMK1磷酸化的影響采用簡單效應(yīng)分析外，其他指標(biāo)只考察低氧的主效應(yīng)。

表2 低氧與暴露時間對MAPK信號通路的交互效應(yīng)Table 2 Interaction of Hypoxia and Exposure Time on MAPK Signaling Pathways

圖2 低氧對EIMD后MAPK信號通路核心分子蛋白含量和磷酸化變化 （Western blot結(jié)果）Figure 2. Changes of Protein Content and Phosphoylation of MAPK Signal Pathway after EIMD by Western Blot

2.2.1 ERK1/2通路的變化

低氧各組與常氧各組ERK1/2 mRNA表達(dá)無顯著差異（P＞0.05），H24組ERK1蛋白含量顯著低于N24組（分別為0.93±0.13和1.26±0.28，P＝0.041，圖3C），H24組磷酸化水平低于N24組（分別為0.64±0.48和1.53±1.17，P=0.067，圖3B），接近統(tǒng)計顯著性差異的臨界值。ERK2的蛋白含量和磷酸化水平無顯著差異（P＞0.05，圖3D、F）。

2.2.2 JNK通路的變化

H24組JNK的mRNA表達(dá)顯著低于N24組（分別為0.19±0.19和0.60±0.45，P＝0.032），隨后低氧和常氧趨于一致。但各組JNK蛋白含量、磷酸化水平均無顯著性差異（圖4）。

2.2.3 p38通路的變化

H48組p38的mRNA表達(dá)顯著低于N48組（分別為0.91±0.19和1.15±0.19，P＝0.024）。低氧與常氧各組p38蛋白量并無顯著差異（P＞0.05，圖5B），但H24組、H48組p38磷酸化水平低于常氧對應(yīng)組，接近統(tǒng)計顯著性差異臨界值（分別為P＝0.068，P＝0.065，圖5C）。

圖3 低氧對EIMD后ERK1/2的mRNA、蛋白表達(dá)和磷酸化水平的影響Figure 3. The Changes of Gene Expression of MAPK in Four Major Signaling Pathways

圖4 低氧對EIMD后JNK的mRNA、蛋白表達(dá)和磷酸化水平的影響Figure 4. Effects of Hypoxia on the Protein Content of MAPK Signal Pathway

圖5 低氧對EIMD后p38的mRNA、蛋白表達(dá)和磷酸化水平的影響Figure 5. Changes of Phosphorylation of Key Molecules of MAPK Signal Pathway

2.2.4 BMK1/ERK5通路的變化

雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)低氧與暴露時間交互效應(yīng)顯著（P＝0.040，表2），所以固定暴露時間的3個水平（24 h、48 h和72 h），分別檢驗低氧對BMK1的簡單效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：BMK1的mRNA表達(dá)與常氧組無顯著差異（P＞0.05）。低氧各組p-BMK1低于常氧各組，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。H48組p-BMK1顯著 低 于N48組（分別為0.82±0.17和1.43±0.68，P＝0.009，圖6C）。

2.3 抑制劑對低氧暴露后MAPK各信號通路蛋白含量和磷酸化水平的影響

2.3.1 蛋白含量

抑 制 劑 對ERK1/2、p38和BMK1通 路 的 蛋 白含量均無顯著影響（圖7A），對BMK1蛋白（分別為1.325±1.764和0.834±0.293，P＝0.345）和p38蛋白（分別為0.677±0.430和0.981±0.182，P＝0.086）有所抑制，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖6 低氧對EIMD后BMK1的mRNA、蛋白表達(dá)和磷酸化水平的影響Figure 6. Changes of Phosphorylation of Key Molecules of MAPK Signal Pathway

2.3.2 磷酸化水平

BMK1抑制效果顯著，抑制劑組24 h、48 h磷酸化均顯著低于安慰劑組（分別為P＝0.035，P＝0.043，圖7A），ERK1/2、p38的磷酸化無顯著變化。

2.4 抑制BMK1/ERK5通路對膜損傷的影響

激光共聚焦鏡觀察到，抑制劑組（I-）和空白對照組（B）肌纖維排列整齊、紋路清晰，無明顯EBD染料侵入。安慰劑（Pl-）24 h、48 h組EBD染料侵入明顯（圖7B）。BMK1通路抑制后膜損傷減輕，說明細(xì)胞膜通透性和完整性改變，出現(xiàn)明顯膜損傷。陽性細(xì)胞率（圖7C）：Pl-24 h（0.019±0.025）與Pl-48 h組（0.114±0.037）PRC有顯著差異（P＜0.001）；I-24 h（0.016±0.018）和I-48 h（0.009±0.013）組顯著低于Pl-24 h（0.194±0.025，P＜0.001）和Pl-48 h組（0.194±0.025，P＜0.001），I-24 h組和I-48 h組PRC與B組無顯著差異。

圖7 抑制MAPK各信號通路的效果及其對膜損傷的影響Figure 7. The Effects of Inhibitor on MAPK Signaling Pathways and Its In fl uence on Sarcolemma Injury

3 討論

3.1 EIMD后低氧加劇膜損傷

已證實離心運(yùn)動會導(dǎo)致骨骼肌出現(xiàn)微損傷［24，28，33］，細(xì)胞膜損傷是骨骼肌微損傷的重要標(biāo)志之一［26］。激光共聚焦顯微鏡觀測到低氧、常氧各組出現(xiàn)明顯的EBD陽性纖維（圖1A），證實肌細(xì)胞膜完整性受到破壞，說明本研究采用的EIMD運(yùn)動模型造成大鼠肌纖維損傷，與經(jīng)典研究模型［10］的效果一致。因為，EBD與血清蛋白結(jié)合形成的伊文氏藍(lán)-白蛋白復(fù)合物是經(jīng)典示蹤劑，在胞內(nèi)大量出現(xiàn)則表明肌膜完整性受損、肌纖維損傷［18］。PRC結(jié)果也證實，EIMD模型造成明顯的膜損傷，常氧組膜損傷恢復(fù)時程與經(jīng)典研究證實的離心運(yùn)動所致肌肉微損傷（EIMD或DOMS）的時程特征一致。但本研究發(fā)現(xiàn)，低氧48 h和72 h組仍顯著低于常氧組和對照組（圖1B），說明低氧顯著影響EIMD后膜損傷的恢復(fù)、加劇了膜損傷。

3.2 EIMD后低氧加劇膜損傷時MAPK各信號通路變化

3.2.1 ERK1/2通路與膜損傷的關(guān)系

ERK1/2對細(xì)胞增殖有重要意義［20］。ERK1/2通路中，Raf與Ras等上游分子結(jié)合，選擇性激活MEK1/2，活化的MEK識別“Thr-X-Thr”模序激活ERK入核后再激活NF-κB和Stat等轉(zhuǎn)錄因子，抑制PPAR和EGFR等的磷酸化，使細(xì)胞從G0進(jìn)入G1期［20］。目前，運(yùn)動激活ERK1/2通路并無爭議，但ERK1/2 mRNA表達(dá)結(jié)果不同，張雪等［9］（2010）證實，急性運(yùn)動和耐力運(yùn)動都可激活ERK1/2信號通路，但ERK1/2mRNA表達(dá)無顯著改變。另有研究發(fā)現(xiàn)，7周耐力訓(xùn)練使24 h和48 h ERK1/2蛋白量顯著增高，ERK2 mRNA表達(dá)增加［2］。而低氧對ERK1/2通路的影響尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧組ERK1/2 mRNA無顯著變化，但蛋白含量和磷酸化降低，說明EIMD后低氧抑制ERK1/2通路的激活，結(jié)合圖1低氧加劇膜損傷的證據(jù)，認(rèn)為低氧抑制ERK1/2通路活性與加劇膜損傷之間存在關(guān)聯(lián)（相關(guān)而非因果）。Sutton等［34］發(fā)現(xiàn)，低氧激活低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1），通過抑制ERK1/2及其上游激酶MEK1/2活性而下調(diào)IGF-1的表達(dá)和活性，提示，該信號通路參與肌細(xì)胞的增殖。分析認(rèn)為，本研究和Sutton等的研究中，低氧激活HIF-1并無爭議，都發(fā)現(xiàn)低氧抑制ERK1/2通路的活性，不同的是，本研究發(fā)現(xiàn)ERK1/2抑制與膜損傷有關(guān)，而Sutton等證實ERK1/2活性降低影響了IGF-1，所以，兩項研究關(guān)于低氧抑制ERK1/2通路活性的結(jié)果是一致的，但去向不同。所以需要更有力的證據(jù)來確認(rèn)ERK1/2活性降低與膜損傷的關(guān)系。

3.2.2 JNK通路與膜損傷的關(guān)系

JNK信號通路是細(xì)胞正常與疾病狀態(tài)的重要調(diào)節(jié)靶點［20］，MAPKJNK的磷酸化水平是關(guān)注的焦點。有研究發(fā)現(xiàn)，耐力訓(xùn)練誘導(dǎo)小鼠心臟重塑過程中JNK mRNA在0～7天內(nèi)無顯著變化，JNK蛋白含量在72 h后顯著降低［8］。其實Boppart等［11］早期就已發(fā)現(xiàn)一次性離心運(yùn)動后即刻JNK蛋白活性改變，運(yùn)動后6 h恢復(fù)至安靜水平，但他們也明確指出，其研究只能證實JNK蛋白活性改變與離心運(yùn)動有關(guān)。雖然上述研究的運(yùn)動刺激和肌肉類型（心?。?］和骨骼肌［11］）不同，但JNK信號通路作用的機(jī)制相同。Boppart等指出，JNK的磷酸化水平是更有說服力的指標(biāo)［11］。在此基礎(chǔ)上，曹師承等［1］（2009）研究不同時長運(yùn)動影響胰島素受體信號改變的MAPK機(jī)制，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動后24 h JNK mRNA表達(dá)顯著增加，但24 h和48 h JNK的蛋白總量和磷酸化無顯著差異。本研究中，常氧組JNK的結(jié)果證實了Boppart等［11］和曹師承等［1］的研究發(fā)現(xiàn)（常氧和低氧各組JNK mRNA、蛋白含量和磷酸化與對照組相比，圖4），但低氧組JNK mRNA表達(dá)顯著增加、蛋白含量和磷酸化水平并無顯著差異，說明JNK通路并非低氧調(diào)控EIMD膜損傷的主要通路。因為JNK磷酸化是激活其直接上游激酶MKK4/7的關(guān)鍵［20］，但本研究未發(fā)現(xiàn)低氧對JNK磷酸化有顯著抑制或激活效應(yīng)，而JNK mRNA表達(dá)顯著增加有可能與其他因素（如miRNA-350表達(dá)增加［8］）以不完全互補(bǔ)形式結(jié)合從而抑制JNK蛋白表達(dá)有關(guān)［15］。

3.2.3 p38通路與膜損傷的關(guān)系

已證實骨骼肌的適應(yīng)性與p38/NF-κB信號通路有關(guān)［4，20］。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧對p38 mRNA的影響與膜損傷后PRC的變化趨勢一致（圖5A、圖1B）。因為p38是肌細(xì)胞分化過程的重要調(diào)節(jié)劑，阻斷p38α/β后，肌肉特異性基因表達(dá)和肌細(xì)胞融入肌管過程均受阻［4］。急性運(yùn)動后p38短期內(nèi)被激活、24 h即恢復(fù)正常［35］，本研究中，常氧運(yùn)動p38mRNA與磷酸化變化與前人的結(jié)果［4，35］較為一致，而低氧顯著抑制p38 mRNA表達(dá)和磷酸化激活，抑制谷值出現(xiàn)在EIMD后48 h（圖5C），提示，p38通路與膜損傷關(guān)系密切。王今越等［4］發(fā)現(xiàn)，大強(qiáng)度運(yùn)動后腓腸肌質(zhì)量丟失，p38蛋白含量無顯著變化，但p38磷酸化顯著增加，這從另一角度支持了本研究結(jié)果。王今越等采用的大強(qiáng)度運(yùn)動與本研究采用的離心運(yùn)動模型均能導(dǎo)致膜損傷，因為運(yùn)動強(qiáng)度是膜損傷的重要誘因（大強(qiáng)度離心運(yùn)動更甚）［10，11，22］，且其研究與本研究所取樣的肌肉（腓腸?。?、測試方法（WB、RT-qPCR）相同，故筆者認(rèn)為兩項研究有關(guān)p38的結(jié)果可以相互印證。綜上，本研究觀察到低氧加劇膜損傷（圖1）的同時p38磷酸化受到顯著抑制，提示，p38 MAPK通路可能是低氧調(diào)控EIMD后膜損傷的重要途徑。

但需注意的是：1）雙因素方差分析結(jié)果顯示p38通路活性改變并無顯著的低氧×?xí)r間的交互效應(yīng)（表2），說明p38蛋白含量顯著降低（圖5B）、p38磷酸化下降接近顯著性差異臨界值（圖5C）是低氧主效應(yīng)所致。綜合考慮樣本量（n＝8）和隨機(jī)誤差等可能的影響，并參考前人研究［20］（p38有4類亞型，無法確認(rèn)測得p38蛋白含量和磷酸化的變化能涵蓋其4類亞型），筆者認(rèn)為尚不能完全確認(rèn)EIMD后低氧加劇膜損傷與p38信號通路無關(guān)。2）MAPK通路級聯(lián)信號中，雖然JNK和p38通路的激活因素和生物學(xué)作用近似，但二者的上游激酶［20］和調(diào)節(jié)機(jī)制［41］均有不同，多項動物［12，22］和人體［35，38］研究以及綜述結(jié)論［36］表明，運(yùn)動后p-JNK和p-p38變化趨勢并不相同。本研究中，除低氧組JNK mRNA表達(dá)高于常氧組外（圖4A），p38、p-p38和雙因素方差分析結(jié)果均顯示JNK與低氧調(diào)控EIMD膜損傷無直接相關(guān)，所以，后續(xù)抑制劑實驗納入p38而不納入JNK通路進(jìn)行驗證。

3.2.4 BMK1/ERK5通路與膜損傷的關(guān)系

BMK1/ERK5是MAPK家族最晚發(fā)現(xiàn)的一條非典型信號通路，相關(guān)研究較少。但此通路的酶作用底物是轉(zhuǎn)錄因子肌細(xì)胞增強(qiáng)因子（MEF2C），MEF2C蛋白與BMK1碳端結(jié)合，其轉(zhuǎn)錄活性在被磷酸化后顯著增強(qiáng)［29］。Li等［23］（2016）研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長因子（IGF）和機(jī)械生長因子（MGF）顯著增加的平滑肌肥大者的BMK1 mRNA呈高表達(dá)，證實早期綜述中指出的ERK5是MAPK途徑中運(yùn)動誘導(dǎo)骨骼肌基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制重要組成部分的觀點［37］。本研究發(fā)現(xiàn)，EIMD后大鼠BMK1 mRNA顯著下調(diào)（低氧和常氧組運(yùn)動后48 h、72 h均顯著低于對照組基線值），低氧組BMK1蛋白量下降、磷酸化水平顯著低于常氧組（圖6），說明低氧抑制BMK1通路的活性，但仍需要進(jìn)一步確認(rèn)。比較好的方案是通過抑制或激活BMK1的活性，再觀察其信號通路級聯(lián)反應(yīng)變化。因為蛋白磷酸化（包括脫磷酸化）在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中對細(xì)胞能感受、放大和整合外界信號、識別并結(jié)合受體等方面起更關(guān)鍵的作用［6，20］。Luo等［25］（2016）指出，MAPK的4條信號通路對低氧/缺血性腎?。℉ypoxic/Ischemic Nephropathy）病理反應(yīng)有所不同，新近研究證實，ERK5信號通路在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起傳遞和放大信號的作用［25，32］。結(jié)合低氧加劇膜損傷時BMK1活性受抑制的初步證據(jù)，提示，BMK1通路可能是低氧調(diào)節(jié)EIMD后膜損傷的重要途徑。

綜上，本實驗結(jié)果初步證實：低氧使大鼠EIMD后陽性細(xì)胞率顯著升高，加劇細(xì)胞膜損傷并使峰值前移。MAPK主要信號通路中，JNK通路與膜損傷無直接相關(guān)，低氧可能通過ERK1/2、p38和BMK1/ERK5通路調(diào)控EIMD后的膜損傷。所以，本研究在此基礎(chǔ)上開展抑制劑實驗以驗證低氧調(diào)控膜損傷的確切機(jī)制。

3.3 抑制劑對低氧暴露后MAPK各信號通路蛋白含量和磷酸化水平的影響

已證實低氧及多種生長因子可激活BMK1/ERK5通路［19，31］，但通過抑制劑驗證此通路對肌纖維和細(xì)胞膜損傷機(jī)制的研究尚未見報道。He等［19］（2016）發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)p38、ERK1/2磷酸化顯著增強(qiáng)、刺激干細(xì)胞增值，而抑制劑能顯著降低磷酸化水平和干細(xì)胞增值，說明低氧通過MAPK信號通路調(diào)控干細(xì)胞增殖。本研究亦用同樣的理路：發(fā)現(xiàn)EIMD后低氧加劇細(xì)胞膜損傷，同時觀察到低氧顯著抑制ERK1/2、p38和BMK1通路活性。抑制劑實驗結(jié)果表明，MAPK下3條通路中只有BMK1通路呈現(xiàn)出顯著的抑制效果（BMK1磷酸化水平顯著降低，圖6C）。新近研究證實，運(yùn)動刺激雄激素分泌和骨骼肌蛋白合成伴隨MAPK通路蛋白表達(dá)和磷酸化水平均增加，其中磷酸化水平是關(guān)鍵［6］。本研究也發(fā)現(xiàn)BMK1磷酸化是抑制劑起作用的關(guān)鍵，提示，BMK1磷酸化是低氧加劇膜損傷的關(guān)鍵。因為磷酸化的主要作用是變構(gòu)蛋白以激活蛋白的活力（酶活力），而磷酸化除了變構(gòu)及激活作用外，還能夠與其他蛋白形成蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)基因。蛋白復(fù)合體形成后會進(jìn)一步促進(jìn)蛋白磷酸化，循環(huán)并擴(kuò)增刺激細(xì)胞的信號，最終入核發(fā)揮生物學(xué)功能［3，5］。所以，BMK1可能是低氧調(diào)控EIMD后MAPK膜損傷機(jī)制的關(guān)鍵信號通路，但仍需驗證抑制BMK1通路對膜損傷的影響，才能確認(rèn)BMK1的作用。

需注意的是，BMK1和p38蛋白含量降低雖無統(tǒng)計學(xué)意義，但統(tǒng)計結(jié)果接近統(tǒng)計顯著性臨界值（P＝0.086，圖7A）。雖然本研究排除p38通路是低氧調(diào)控EIMD后MAPK膜損傷機(jī)制的關(guān)鍵信號通路，但筆者認(rèn)為需謹(jǐn)慎看待此結(jié)果。因p38有α、β1/2、γ、δ 4類亞型，本研究選用了針對p38最廣譜的抑制劑Losmapimod，該抑制劑能有效抑制分布最廣的p38 α和β兩種亞型（目前還沒有能涵蓋p38所有亞型的抑制劑）。所以，雖然可能性較小，但本實驗p38的結(jié)果理論上仍存在假陽性錯誤的可能。此外，實驗中大鼠需注射抑制劑和EBD（48 h組注射2次，表1），致抑制劑用量和抑制效應(yīng)受限。筆者預(yù)實驗曾嘗試梯度增加劑量，但大鼠死亡率過高，無法完成實驗。理論上而言，這也可能對抑制劑效應(yīng)有影響。所以，將來的研究需進(jìn)一步驗證并確認(rèn)p38 MAPK調(diào)控膜損傷的效果。

3.4 抑制BMK1/ERK5通路對膜損傷的影響

抑制BMK1后，EBD切片結(jié)果顯示，抑制劑組（I-）和空白對照組（B）肌纖維排列整齊、肌細(xì)胞無明顯EBD染料侵入，而安慰劑組EBD侵入明顯（圖7B），說明抑制BMK1減輕了膜損傷。安慰劑組PRC顯著高于抑制劑組和對照組（抑制劑組PRC與B組相當(dāng)，P＜0.05，圖7C），說明未抑制BMK1的安慰劑組膜的通透性和完整性改變，膜損傷程度顯著高于BMK1抑制劑組。這不僅印證了圖1的研究結(jié)果，還證實BMK1通路活性改變與低氧加劇膜損傷直接相關(guān)。分析認(rèn)為，BMK1/ERK5通路對應(yīng)MAPK家族有3個對應(yīng)順序激活成分，其中，MEKK2/3被G蛋白偶聯(lián)受體激活后再激活MEK5，MEK5是BMK1/ERK5唯一的特異性上游激酶［20］。本實驗所用抑制劑BIX02188是MEK5的選擇性抑制劑、還同時抑制ERK5催化活性，對MEK1/2，ERK2和JNK2均無抑制性，能針對性地抑制BMK1通路活性。PRC結(jié)果證實，抑制劑主要通過抑制BMK1磷酸化（圖7A）而顯著降低陽性細(xì)胞率。目前尚未見低氧調(diào)控ERK5與肌細(xì)胞膜損傷的研究，僅Rovida等［32］發(fā)現(xiàn)，沉默RNA技術(shù)（siRNA）敲減ERK5后，抑制ERK5活性能限制肝癌細(xì)胞增值并增加細(xì)胞在G0/G1期比例，且沉默ERK5能阻止低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和細(xì)胞骨架重塑。雖然此研究與本研究不直接相關(guān)，但低氧抑制ERK5對細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能與本研究發(fā)現(xiàn)的低氧抑制ERK5活性的效應(yīng)類似（圖6）。本研究證實，抑制BMK1/ERK5通路活性可阻止EIMD后低氧對膜損傷的加劇作用，也提示，此通路是EIMD后低氧調(diào)控膜損傷的關(guān)鍵機(jī)制。另外，目前關(guān)于抑制ERK5活性的研究多是癌細(xì)胞有關(guān)的離體實驗，用以確認(rèn)ERK5的生物學(xué)功能并作為新的治療和藥物靶標(biāo)［14，21，29，32］，結(jié)論已比較明確。本研究開展的在體抑制劑研究，保留了體內(nèi)神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的綜合調(diào)控作用，更適于考察運(yùn)動、低氧條件下BMK1/ERK5通路的作用機(jī)制。

4 結(jié)論

低氧導(dǎo)致大鼠EIMD后陽性細(xì)胞率顯著升高，造成細(xì)胞膜損傷加劇和峰值前移。抑制BMK1/ERK5通路可阻止低氧對膜損傷的加劇作用，說明此通路是低氧調(diào)控EIMD后膜損傷的關(guān)鍵機(jī)制。

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Exploration and Veri fi cation of MAPK Mechanism of Hypoxia Regulates Sarcolemma Injury after EIMD

XU Fei1，HUANG Qiao-ting2，CAO Jian-min2，WANG Ping1，XU Yu-ming1

Objective：To investigate and verify the effects of hypoxia on sarcolemma injury，and regulated mechanism by mitogen-activated protein kinases （MAPK） after exercise-induced muscle Damage （EIMD）. Methods：The male SD rats were randomly divided into control group，normoxia （24，48 and 72h group） and hypoxia group （24，48 and 72h group）. Rats were experienced intermittent downhill running according to EIMD model. And Rats were treated with intraperitoneal injection of Evans blue dye （EBD） after downhill running. Gastrocnemius muscle sample was isolated quickly and prepared to analyze. The positive ratio of cells （PRC） was observed by fl uorescence microscope.To explore the hypoxia regulating mechanism of MAPK signal pathways in sarcolemma injury after EIMD，the mRNA，protein content and phosphylation of ERK1/2，JUN，p38 and BMK1 were tested by RT-qPCR and Western blot. Subsequently，inhibitor experiment was carried out so as to con fi rm the sarcolemma injury regulation mechanism of MAPK signal pathways in hypoxia.. Results：After EIMD，hypoxia and normoxia groups suffered a signi fi cant sarcolemma injury. The PRC showed a signi fi cant difference between hypoxia groups and normoxia groups （P＜0.01）. The mRNA，protein expression and phosphorylation of ERK1，p38 and BMK1 in hypoxia groups were signi fi cantly higher than those in normoxia groups （P＜0.05）. In addition，protein expression and phosphorylation of JNK had no signi fi cant change （P＞0.05）. The results of inhibitor experiment showed no signi fi cant changes of phosphorylation and PRC in inhibitor group （P＞0.05）. However，phosphorylation and PRC in inhibitor 24 h and 48 h BMK1 groups were signi fi cantly lower than placebo group （P＜0.001）.And there were no signi fi cant difference between BMK1 inhibitor groups and placebo group （P＞0.05）.Conclusions：1） The hypoxia exacerbates sarcolemma injury and causes the peak value shift forward after EIMD. 2） Inhibition of BMK1 phosphorylation can prevent sarcolemma injury. BMK1/ERK5 is the key signal pathway of MAPK mechanism in hypoxia regulates sarcolemma injury after EIMD.

hypoxia；exercise-induced muscle damage （EIMD）；sarcolemma injury；cell signal pathway；mitogen-activated protein kinase （MAPK）

1000-677X（2017）11-0063-09

10. 16469/j. css. 201711008

G804.7

A

2016-12-15；

2017-11-07

浙江省自然科學(xué)基金面上項目（LY18C110002）；國家自然科學(xué)基金資助項目（31271276）；杭州市社科優(yōu)秀青年人才培育計劃資助項目（2017RCZX40）。

徐飛，男，副教授，博士，主要研究方向為低氧生理學(xué)，運(yùn)動技能學(xué)習(xí)的神經(jīng)生理機(jī)制，E-mail：feixueka@qq.com；曹建民，男，教授，博士，主要研究方向為運(yùn)動生物化學(xué)、運(yùn)動營養(yǎng)學(xué)；徐玉明，男，教授，博士，主要研究方向為低氧生理學(xué)，E-mail：xuyuming110@126.com。

1.杭州師范大學(xué) 體育與健康學(xué)院，浙江 杭州 310036；2.北京體育大學(xué)，北京 100084

1.Hangzhou Normal University，Hangzhou 311136，China；2.Beijing Sport University，Beijing 100084，China.