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    白木香結(jié)香樹脂部?jī)?nèi)生真菌的分離及其結(jié)香菌篩選

    2017-11-30 19:28:48黃秋偉王麗萍黃顯雅黃惠芳李慧敏
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年20期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)生真菌

    黃秋偉+王麗萍+黃顯雅+黃惠芳+李慧敏

    摘要:采用平板培養(yǎng)法對(duì)白木香結(jié)香部位內(nèi)生真菌進(jìn)行分離,以沉香主要成分芐基丙酮作為結(jié)香菌的耐藥指標(biāo),采用改進(jìn)的菌塊法進(jìn)行耐藥能力的篩選。結(jié)果表明,從結(jié)香部位分離出11株內(nèi)生真菌,經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子初步鑒定歸于3目4科5屬,其中在數(shù)量上,鐮刀菌屬為優(yōu)勢(shì)種群,其次為木霉屬。經(jīng)芐基丙酮耐藥篩選發(fā)現(xiàn),鐮刀菌屬的G7耐藥水平較高,對(duì)芐基丙酮的劑量變化不敏感,將其選作人工結(jié)香菌,效果有所顯現(xiàn),結(jié)香時(shí)間大為縮短。

    關(guān)鍵詞:白木香;內(nèi)生真菌;芐基丙酮;人工結(jié)香

    中圖分類號(hào): S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2017)20-0285-05

    白木香[ Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg]為瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬(Aquilaria)植物,別稱土沉香、女兒香、莞香,為我國(guó)特有的珍貴藥用樹種,主產(chǎn)于海南、廣東、廣西等?。▍^(qū))。其含黑色樹脂的木質(zhì)部稱為沉香,系《中國(guó)藥典》收載的品種,是目前緊缺的名貴藥材和天然香料,具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘之功效,主治胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等癥狀[1]。目前,由于白木香的野生資源少,生長(zhǎng)周期較長(zhǎng),自然條件下沉香的形成最少也要10年以上的時(shí)間,而且并不是所有的白木香都能形成沉香,所以即使通過人工種植白木香,也很難解決天然沉香產(chǎn)量問題,不能滿足市場(chǎng)需求。健康的白木香并不產(chǎn)生樹脂,據(jù)目前研究表明,沉香形成機(jī)理是健康的白木香樹干在受到損傷或者刺激情況下,其木質(zhì)部細(xì)胞分泌出一種氣味芬芳的防御性黑色樹脂,而這種防御性機(jī)制的引發(fā)主要與白木香受損后的微生物浸染有很大關(guān)系。

    內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)是指生活在健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌,被感染的植物不表現(xiàn)明顯的外在病癥,可通過組織學(xué)方法,從表面嚴(yán)格消毒的植物組織中分離的方法,以及從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增微生物DNA 的方法來證明其內(nèi)生性[2]。對(duì)藥用植物內(nèi)生真菌的研究表明,內(nèi)生真菌與藥用植物在長(zhǎng)期的生活過程中,形成了互惠互利的共生關(guān)系,不但可以自身合成與宿主植物相類似活性成分,還具有促進(jìn)宿主植物合成活性成分的能力。對(duì)于促進(jìn)結(jié)香的內(nèi)生真菌首先在一定程度上對(duì)沉香活性成分具有耐受性。沉香的成分比較復(fù)雜,主要成分有三大類:倍半萜、2-苯乙基色酮類物和芳香族化合物,芐基丙酮、對(duì)甲氧基芐基丙酮是沉香芳香族化合物的代表性成分。近年來,我國(guó)珍稀瀕危藥用植物內(nèi)生真菌及其活性成分的研究成為了藥物開發(fā)的熱點(diǎn),國(guó)內(nèi)外從多種藥用植物內(nèi)生真菌中篩選出各種生理活性成分陸續(xù)見有報(bào)道,且發(fā)現(xiàn)有一些活性成分具有與宿主植物相同或相似的生理活性[3]。因此,當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究較多的是關(guān)于沉香內(nèi)生真菌分離及其次生代謝產(chǎn)物活性成分,而對(duì)于促進(jìn)結(jié)香的內(nèi)生菌研究報(bào)道仍較少。本研究對(duì)已結(jié)香的沉香部分進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離和鑒定,選用芐基丙酮作為試驗(yàn)條件對(duì)分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行結(jié)香耐藥性篩選,并通過人工結(jié)香試驗(yàn),篩選出對(duì)白木香結(jié)香具有良好促進(jìn)作用的菌株,為加快天然沉香的結(jié)香周期奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 植物材料 白木香樣品于2014年7月采自廣西壯族自治區(qū)靈山縣武利鎮(zhèn)魚良村當(dāng)?shù)匾恢陿潺g為100年白木香古樹。因古樹比較高大,根系深入地底,所以根部及葉片的組織樣品難以取得,取材部位為莖部的天然結(jié)香樹脂部分。白木香樣品采集后于48 h內(nèi)進(jìn)行表面消毒。取樣的樹種經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所鑒定白木香。

    1.1.2 主要儀器及試劑 徠卡DM2500型光學(xué)顯微鏡;DYY-6C雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀;伯樂GEL DOCXR全自動(dòng)凝膠成像儀;德國(guó)Biometra Tprofessional 96梯度PCR儀;LRH-250GB光照恒溫培養(yǎng)箱;日本三洋MLS-3780高壓蒸汽滅菌器;離心柱型真菌基因組DNA提取試劑盒,由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn);PCR產(chǎn)物純化及回收試劑盒,由BIOMIGA公司生產(chǎn);Taq PCR master mix試劑,由上海捷瑞生物工程有限公司生產(chǎn);芐基丙酮試劑,由Sigma-aldrich公司生產(chǎn);吐溫80,由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。

    1.1.3 所用培養(yǎng)基 白木香內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15 g,硫酸鏈霉素100 mg,氯霉素 100 mg,蒸餾水1 000 mL,pH值為7.0;純化培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基);白木香培養(yǎng)基:未結(jié)香白木香碎木塊(7年樹齡)100 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 000 mL,pH值為7.0;液體PDA培養(yǎng)基。

    上述培養(yǎng)基所用的馬鈴薯與白木香均煮沸30 min后,4層紗布過濾,再補(bǔ)水至1 000 mL,滅菌條件為121 ℃,18 min,硫酸鏈霉素與氯霉素均在培養(yǎng)基冷卻至50~60 ℃時(shí)加入。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 內(nèi)生真菌的分離與純化 內(nèi)生真菌的分離采用組織塊平板培養(yǎng)法[4-5],用于分離的白木香天然結(jié)香木塊材料采用自來水沖洗1遍,并將腐爛的木質(zhì)部去除,然后切割成 5 cm×5 cm的木塊,依次用75%乙醇洗1 min,無菌水漂洗1次,5%次氯酸鈉溶液漂洗5 min,無菌水漂洗4次。消毒后的材料置于無菌的干燥濾紙上吸干水分,用無菌手術(shù)刀刮去木塊表面組織,并切成1 cm×1 cm的小塊置于分離培養(yǎng)基上,采用三角形法,每個(gè)平板放置3個(gè)小塊,以最后一次沖洗的無菌水0.1 mL涂板作為陰性對(duì)照,來檢驗(yàn)表面消毒是否徹底。28 ℃恒溫培養(yǎng)直到出現(xiàn)菌落,從菌落邊緣挑取菌絲接種于純化培養(yǎng)基上,經(jīng)反復(fù)轉(zhuǎn)接純化后的菌株轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基的試管斜面,于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 內(nèi)生真菌的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定利用肉眼觀察分離菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征;采用真菌學(xué)插片培養(yǎng)法和水滴裝片法,利用光學(xué)顯微鏡鏡檢觀察,根據(jù)菌落形態(tài)特征(包括菌落大小、顏色、表面特征和質(zhì)地等)和顯微形態(tài)特征(包括菌絲和孢子等)參考文獻(xiàn)[6]對(duì)白木香結(jié)香樹脂部位的分離菌株進(jìn)行初步鑒定。endprint

    分子鑒定先采用液氮研磨,試劑盒提取方法制備真菌總DNA。真菌樣品采取的是菌膜培養(yǎng)法,具體參考陳亮等的研究[7],從活化好的PDA平板中挑取1接種環(huán)菌絲,放入25 mL PDA液體培養(yǎng)基于26 ℃搖瓶培養(yǎng)24 h,充分混勻后,在靜止培養(yǎng)5~7 d形成菌膜,然后挑取菌膜放入研缽,加入液氮并快速研磨成粉末,將粉末分成2份分裝于2.5 mL離心管,一份于-80 ℃保存?zhèn)溆茫环萦糜贒NA提取,提取操作按照試劑盒方法進(jìn)行。PCR擴(kuò)增采用真菌rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′,正向)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′,反向)擴(kuò)增分離菌株的rDNA ITS區(qū)。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35次;72 ℃溫育10 min。PCR產(chǎn)物利用BIOMIGA公司生產(chǎn)的純化回收試劑盒純化,純化后的產(chǎn)物由深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行核酸測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過NCBI的BLAST進(jìn)行序列的同源性檢索比對(duì)。

    1.2.3 內(nèi)生真菌的芐基丙酮耐受性篩選試驗(yàn) 初篩:將保存于試管斜面的菌種轉(zhuǎn)接于新鮮的PDA培養(yǎng)基中,于26 ℃培養(yǎng)活化以作為供試菌。配制白木香培養(yǎng)基,待培養(yǎng)基冷卻到50~60 ℃,往培養(yǎng)基里滴加0.10%(體積分?jǐn)?shù),下同)吐溫80作為乳化劑,然后選取體積分?jǐn)?shù)為0.08%加入沉香主要成分之一的芐基丙酮,快速混勻后倒平板。內(nèi)生真菌對(duì)芐基丙酮具有耐受能力的初步篩選采用菌餅法,先用6 mm的打孔器在接有活化好的內(nèi)生真菌的PDA平板上打出直徑約為6 mm的圓形菌餅,然后用滅菌接種針各挑取1塊圓形菌餅置于含芐基丙酮的白木香培養(yǎng)基平板中央,同時(shí)以置于不含芐基丙酮的白木香培養(yǎng)基作為對(duì)照,每個(gè)處理和對(duì)照均設(shè)置3次重復(fù),置于26 ℃下恒溫避光培養(yǎng)4 d后,觀察真菌的生長(zhǎng)狀況,以菌圈直徑(包括菌餅)作為耐受性指標(biāo),計(jì)算芐基丙酮對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率,選取對(duì)芐基丙酮具有耐受性的菌株進(jìn)行復(fù)篩,生長(zhǎng)抑制率的計(jì)算公式如下:

    菌絲生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-6 mm)×100%。

    復(fù)篩:設(shè)置含芐基丙酮0.10%、0.12%、0.14% 3個(gè)體積分?jǐn)?shù)梯度的白木香平板,并將具有耐受性的菌株轉(zhuǎn)接于含藥平板中,轉(zhuǎn)接方法與初篩試驗(yàn)中菌餅轉(zhuǎn)接法一致,置于 26 ℃ 下恒溫避光培養(yǎng)7 d后,觀察真菌的生長(zhǎng)狀況,以菌落長(zhǎng)勢(shì)及菌圈直徑(包括菌餅)作為耐受能力指標(biāo),并通過菌絲生長(zhǎng)抑制率濃度曲線,選取對(duì)芐基丙酮耐受能力較強(qiáng)的菌株作為結(jié)香菌。

    所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并計(jì)算對(duì)照組與處理組、處理組與處理組間的顯著性差異。

    1.2.4 結(jié)香菌人工結(jié)香的初步試驗(yàn) 將篩選出來的菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上活化,挑取活化后的菌絲(連同培養(yǎng)基)轉(zhuǎn)接到裝有500 mL液體PDA培養(yǎng)基的1 L三角瓶中,于26 ℃、120 r/min 的條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d。液體培養(yǎng)物先后經(jīng)慢速濾紙及0.45 μm微孔濾膜抽濾,收集濾液,得到菌體發(fā)酵液 4 ℃ 備用。選取7~8年樹齡的白木香作為試驗(yàn)植株,在離地面50 cm處用電鉆打孔,之后將含有發(fā)酵液的注射袋的注射頭插入孔隙,吊帶注射一段時(shí)間,觀察孔隙口邊緣是否漏液及注射袋是否脹袋,以判別液體是否成功注射入樹體中。接菌注射3個(gè)月后,通過觀察注射孔徑位置是否變色,并取其部分材料進(jìn)行燃燒試驗(yàn),觀察其燃燒狀況,來初步判定結(jié)香狀況。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 白木香樹脂部?jī)?nèi)生真菌的分離與鑒定結(jié)果

    本次研究采用組織塊平板分離法,經(jīng)過多次分離純化后,從白木香的樹脂形成部位分離獲得11株內(nèi)生真菌,根據(jù)PDA平板上的分離次序、形態(tài)及培養(yǎng)特征依次進(jìn)行菌株編號(hào)G1、G2,…,G11。經(jīng)過顯微形態(tài)觀察及分子鑒定,將分離得到的內(nèi)生真菌初步鑒定為3目4科5屬,相關(guān)分離結(jié)果見表1。分離的5個(gè)菌屬依次為鐮刀菌屬、木霉屬、毛色二孢屬、絲孢屬、黏孢屬。其中,鐮刀菌屬有5株,占分離菌株數(shù)的45%,為結(jié)香部位的優(yōu)勢(shì)菌群;木霉屬有3株,占分離菌株數(shù)27%;其余屬各有1株,各占分離菌株數(shù)的9%。在觀察鑒定試驗(yàn)中,鐮刀菌屬與木霉屬培養(yǎng)特征比較明顯。鐮刀菌屬在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)前期產(chǎn)生大量的白色氣生菌絲,并呈現(xiàn)棉絮狀,培養(yǎng)后期不產(chǎn)生色素或者產(chǎn)生黃色、紅色等色素,分生孢子梗主要單生,分生孢子呈鐮刀形或卵圓形;木霉屬在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)前期氣生菌絲為白色,生長(zhǎng)密集呈網(wǎng)叢狀,培養(yǎng)后期菌絲轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色或黃色,分生孢子梗呈二叉狀或三叉狀分枝,分生孢子球形。

    2.2 內(nèi)生真菌耐藥菌的篩選

    2.2.1 內(nèi)生真菌芐基丙酮初篩結(jié)果 由表2可知,芐基丙酮對(duì)所分離的11株菌均產(chǎn)生了不同程度的抑制作用。從對(duì)比差異來看, 鐮刀菌屬的內(nèi)生真菌有3株的對(duì)照組與處理組表現(xiàn)出極顯著性差異;2株的對(duì)照組與處理組無明顯差異,分別是G7與G8,說明這2株菌受芐基丙酮的影響較小,耐受能力較為明顯。木霉屬的內(nèi)生真菌有2株表現(xiàn)出顯著性差異,1株為極顯著差異。其余3個(gè)屬的內(nèi)生真菌均表現(xiàn)極顯著差異。從菌落生長(zhǎng)抑制率效果來看,鐮刀菌屬的5株真菌所受抑制率各不相同,抑制率由小到大排列,依次為G7毛色二孢屬>絲孢屬,抑制率分別為64.02%、53.54%、48.01%,抑菌值與鐮刀菌屬和木霉屬的大多數(shù)真菌相比相差較大,說明這3個(gè)菌屬的耐受能力較弱。綜合上述兩方面考慮,初篩試驗(yàn)選取G7、G8、G9、G10這4株真菌作為芐基丙酮的耐受菌,由圖1可知,4株內(nèi)生真菌耐藥試驗(yàn)及分生孢子的顯微形態(tài)。

    2.2.2 內(nèi)生真菌芐基丙酮復(fù)篩結(jié)果 將初篩得到的4株真菌再次進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn),由表3可知,各個(gè)菌的對(duì)照組與處理組生長(zhǎng)情況相差明顯,且總體趨勢(shì)是隨著芐基丙酮體積分?jǐn)?shù)提高,抑制生長(zhǎng)的效果越明顯。在0.08%芐基丙酮處理中沒有顯著性差異鐮刀菌屬的G7、G8,在體積分?jǐn)?shù)提高到0.10%后,與對(duì)照組相比也出現(xiàn)了極顯著性差異。然而,鐮刀菌各個(gè)體積分?jǐn)?shù)處理間的菌落生長(zhǎng)狀況均沒有明顯差別;木霉屬的各個(gè)體積分?jǐn)?shù)處理間均表現(xiàn)出了顯著性差異,甚至有些處理還出現(xiàn)了極顯著性差異,說明這2株木霉屬真菌對(duì)芐基丙酮變化量較敏感。此外,由圖2可知,在0.10%、0.12%、014%培養(yǎng)條件下,木霉屬的整體抑制率是低于鐮刀菌屬的,但從抑制率的增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)分析,木霉屬增長(zhǎng)幅度波動(dòng)性較大,尤其是體積分?jǐn)?shù)0.14%時(shí),與0.12%抑制率相比,增長(zhǎng)幅度達(dá)到了約 15.00%,說明木霉屬的G9、G10等2株真菌對(duì)于高濃度芐基丙酮耐受能力較低;鐮刀菌屬的增長(zhǎng)幅度比較平緩,各個(gè)濃度的增長(zhǎng)幅度基本維持在2.00%~5.00%,G7各個(gè)體積分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)幅度較為均等,且抑制率水平較其他2株鐮刀菌屬真菌要低一些,說明該菌的芐基丙酮耐受能力水平較高,因此選用G7作為人工接菌結(jié)香的結(jié)香菌源。

    2.3 人工結(jié)香試驗(yàn)初步結(jié)果

    經(jīng)發(fā)酵液注射過后的白木香樹木,先出現(xiàn)掉葉枯枝的假死現(xiàn)象,后經(jīng)過一段適應(yīng)期長(zhǎng)出新枝嫩葉。用砍刀將菌種發(fā)酵液注射孔及其周圍的表皮去掉后,肉眼觀察發(fā)現(xiàn)孔洞周圍的木質(zhì)部已經(jīng)發(fā)黑變色,變色方向主要是向兩端縱向延伸。變色部分的剖面面積約為1.0 cm×3.5 cm,通過旋轉(zhuǎn)取樣器深入取樣,深入樹干9.0 cm取出,發(fā)現(xiàn)取樣器的頂端帶有小部分白色木質(zhì)組織,表明變色樹脂的橫向深度約為9.0 cm。將取出的黑色木塊組織肉眼觀察無腐化爛木現(xiàn)象,且經(jīng)燃燒試驗(yàn)后無異味黑煙,而是白色帶有淡香的煙氣。初步認(rèn)為,變色樹脂部分為沉香,所篩選的耐藥菌可以促進(jìn)結(jié)香,圖3為注射菌液后的白木香生長(zhǎng)及切面狀況。

    3 討論

    內(nèi)生真菌普遍存在于植物中,但不同的植物體內(nèi)分離到的內(nèi)生真菌種類和數(shù)量有差別,即使是同一種植物,也會(huì)因生境、品種和年齡等不同而分離出不同的內(nèi)生真菌,加上不同的表面消毒程序和分離培養(yǎng)條件及污染控制,也會(huì)造成一定的差異。本試驗(yàn)從白木香的結(jié)香樹脂部位分離得到11株真菌,顯示內(nèi)生真菌多樣性較低。同時(shí),在分離數(shù)量上,鐮刀菌屬為結(jié)香部位的優(yōu)勢(shì)屬,這些結(jié)果與已報(bào)道的白木香內(nèi)生真菌相比較,既有差異又有相似。張秀環(huán)等從樹齡為7年的白木香健康部位和樹脂形成部位共分離出42株內(nèi)生真菌,其中健康部位15株,樹脂形成部位27株,結(jié)香部位真菌分布優(yōu)于健康組織,此外,該研究還發(fā)現(xiàn)枝頂孢霉屬為健康部位優(yōu)勢(shì)菌屬,青霉屬為結(jié)香部位優(yōu)勢(shì)菌屬[8]。王磊等對(duì)不同樹齡白木香和不同的組織部位進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離鑒定,共分離得到50株真菌,但不同樹齡及組織得到的真菌數(shù)量各不相同,從樹齡分布來看,5年樹齡分離數(shù)量最多,30年樹齡次之,10月樹齡最少。他們還發(fā)現(xiàn),在不同健康組織(根、莖、葉)和結(jié)香組織分離得到的真菌數(shù)量上,健康組織33株,結(jié)香部位17株,健康組織分布優(yōu)于結(jié)香部位,而分離出來的鐮刀菌全部位于結(jié)香樹脂部位,是該部位的優(yōu)勢(shì)種群[9]。造成這種真菌數(shù)量種群差異性和結(jié)香種群優(yōu)勢(shì)專一性的原因可能是植物不同部位的微環(huán)境不同,如化學(xué)成分等內(nèi)在因素,以及種植環(huán)境條件外在因素影響了內(nèi)生真菌的浸染和多樣性。

    鐮刀菌屬[10](Fusarium Link)是重要的菌物類群,是人類發(fā)現(xiàn)的重要植物病原菌之一,自然界中兼寄生或腐生生活。該屬真菌可侵染多科植物(茄科、豆科、禾本科、蘭科、松科、錦葵科、藜科、葫蘆科、十字花科、蕓香科和百合科等)引起苗枯、穗腐、根腐、莖腐、穗軸腐爛、冠腐和植物種子、塊莖的腐爛等癥狀[11]。此外,有些鐮刀菌還可直接侵染動(dòng)物和人類引起嚴(yán)重的疾??;有些可分解纖維素、降解有機(jī)物,有助于自然界的物質(zhì)循環(huán);有些可寄生在昆蟲或其他真菌上,作為生防菌被利用;有的在一定培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生激素,用于刺激動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[12]。此外,鐮刀菌屬一般的分類鑒定主要是以大小分生孢子形態(tài)、培養(yǎng)性狀等形態(tài)學(xué)特征建立的形態(tài)學(xué)種,但由于該菌屬會(huì)因?yàn)槠浞诸愋誀钜鬃兦也环€(wěn)定,造成種內(nèi)分化和顯著差異,這給實(shí)際鑒定帶來許多困難。本次試驗(yàn)分離得到的5株鐮刀菌,相似菌種為腐皮鐮刀菌,但菌落在培養(yǎng)基上面的次生代謝產(chǎn)物(如色素有無及色澤)彼此不同,觀察形態(tài)有些有共同特征(如菌落生長(zhǎng)大小、孢子著生方式),也有些結(jié)構(gòu)有明顯差異(如孢子大?。┖湍推S基丙酮能力的差異,這些可能都是由種內(nèi)分化造成的。在耐藥性篩選試驗(yàn)中,看似同種的5株鐮刀菌,各自的耐芐基丙酮能力及抗藥水平均有差異,導(dǎo)致這些差異的發(fā)生極有可能是由于種內(nèi)分化,從而使菌體內(nèi)的微結(jié)構(gòu)及代謝功能發(fā)生改變。對(duì)于鐮刀菌的結(jié)香效果,一些文獻(xiàn)上也有所報(bào)道。例如,Tabata等利用包括三線鐮孢(Fusarium trifosfrium)在內(nèi)的5種鐮刀菌進(jìn)人工結(jié)香試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)通過接種能產(chǎn)生沉香[13]。Kazzaz等通過對(duì)印尼沉香樹的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),鐮刀菌(F. laseritum)能促進(jìn)白木香結(jié)香[14]。這些結(jié)果都與本次研究結(jié)果一致,說明鐮刀菌對(duì)于開發(fā)白木香的結(jié)香技術(shù)有著重要作用,尤其是耐芐基丙酮藥性的鐮刀菌。

    此外,由于沉香成分復(fù)雜,芐基丙酮只是其中的主要成分之一,有些真菌可能不耐芐基丙酮,但會(huì)對(duì)其他沉香成分有著協(xié)同促進(jìn)作用。本試驗(yàn)分離得到1株毛色二孢屬真菌,韓曉敏等研究發(fā)現(xiàn)的與其同屬的可可毛色二孢菌類發(fā)酵液對(duì)白木香產(chǎn)生沉香主要成分-倍半萜有著誘導(dǎo)促進(jìn)作用,而且發(fā)酵液產(chǎn)物成分里面也出現(xiàn)了與沉香倍半萜類相一致的成分[15]。因此,筆者認(rèn)為分離出來的毛色二孢屬也很有可能具備這一誘導(dǎo)作用,并產(chǎn)生倍半萜類化合物,但其本身對(duì)芐基丙酮耐受力較差。因此,還須對(duì)侵染結(jié)香的沉香組織進(jìn)行物理提取及GC-MS檢測(cè),來分析其內(nèi)在成分與天然結(jié)香的成分差異,以及多個(gè)菌屬之間優(yōu)化搭配,發(fā)揮協(xié)同作用來促進(jìn)結(jié)香,提高結(jié)香品質(zhì)。endprint

    4 結(jié)論

    本次研究從結(jié)香部位分離出11株內(nèi)生真菌,并從中篩選出1株耐芐基丙酮內(nèi)生菌,將該菌通過發(fā)酵培養(yǎng)后,對(duì)白木香進(jìn)行人工的菌液注射侵染結(jié)香,一段時(shí)間后得到變色木質(zhì)組織,經(jīng)過初步驗(yàn)證,具備沉香的表觀性質(zhì),且形成周期比自然形成時(shí)間要短很多,說明所選耐藥菌對(duì)促進(jìn)白木香結(jié)香、加快結(jié)香時(shí)間有良好的效果,因而耐芐基丙酮能力可以作為篩選人工結(jié)香菌的重要指標(biāo)之一,且方法可行。

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