果膠酶高產(chǎn)菌株的微波—硫酸二乙酯復(fù)合誘變選育

杜國(guó)軍+田英華+劉曉蘭

摘要：以黑曲霉（Aspergillus niger）HY-D7為出發(fā)菌株，采用微波、硫酸二乙酯（DES）進(jìn)行誘變處理以獲得果膠酶高產(chǎn)突變菌株。首先使用透明圈法進(jìn)行初篩，選育出透明圈直徑與菌落直徑比值有大幅提高的突變株，然后采用固體發(fā)酵法進(jìn)行復(fù)篩，最終篩選出1株果膠酶高產(chǎn)突變株HY-Z40，其酶活性達(dá)到了2 198 U/g，比出發(fā)菌株提高了1.51倍，且遺傳性能穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：黑曲霉；果膠酶；微波；硫酸二乙酯（DES）；誘變

中圖分類號(hào)： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）20-0279-03

果膠酶（pectinase）是能分解果膠質(zhì)的一類含有多種酶的復(fù)合酶，普遍存在于植物果實(shí)和微生物中[1]。果膠酶在食品加工、飼料加工、造紙、環(huán)境保護(hù)和誘導(dǎo)植物抗病性等方面都有很大的應(yīng)用價(jià)值[2]。自然界產(chǎn)果膠酶的菌株很多，主要有曲霉屬、青霉屬、鐮孢屬、克魯維氏酵母及某些兼性厭氧細(xì)菌等[3]。目前國(guó)內(nèi)以黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的報(bào)道較多。天然菌株產(chǎn)果膠酶的活性一般都很低，必須對(duì)其進(jìn)行誘變，才能獲得酶活性較高的菌株，常見的誘變育種方法有物理法、化學(xué)法等。研究表明，采用復(fù)合誘變技術(shù)可以大大提高菌種的產(chǎn)果膠酶能力[4]。

微波是一種高頻電磁波，人們?cè)谖⑸镞z傳育種的研究中，逐漸認(rèn)識(shí)到它作為一種物理誘變劑具有顯著的成效，微波誘變具有正突變率高、效果好、所選育菌株遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[5]。硫酸二乙酯（DES）具有用量小、誘變時(shí)間短、誘變效果好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。因此，本試驗(yàn)以微波及硫酸二乙酯作為誘變方法對(duì)黑曲霉進(jìn)行誘變處理，旨在獲得性能穩(wěn)定、酶活性高的優(yōu)良突變菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger） HY-D7，由齊齊哈爾大學(xué)食品和生物工程學(xué)院生化工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基（PDA） 200 g馬鈴薯去皮，切塊煮沸 30 min，然后用紗布過濾，再加20 g葡萄糖及20 g瓊脂，后加水補(bǔ)足至1 000 mL，pH值自然。0.1 MPa/cm2滅菌 30 min。

1.2.2 平板分離培養(yǎng)基（PDA） 配制方法同“1.2.1”。

1.2.3 固體培養(yǎng)基 將10 g麩皮、0.25 g豆粕、0.35 g NaNO3、0.1 g（NH4）2SO4裝入250 mL三角瓶?jī)?nèi)，按料液比 1 g ∶ 1.5 mL 加入pH值5.0～5.5的水。0.1 MPa/cm2滅菌30 min。

1.2.4 果膠平板培養(yǎng)基 0.1% K2HPO4，0.05% MgSO4，0.3% NaNO3，0.001% Fe2（SO4）3，2.0%瓊脂，0.2%果膠，pH值5.5。0.1 MPa/cm2滅菌30 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 出發(fā)菌株的篩選

1.3.1.1 菌種活化 取1個(gè)斜面保藏的黑曲霉菌種，接種于PDA斜面培養(yǎng)基，36 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。

1.3.1.2 制備孢子懸液 取1支活化的斜面，加入無菌水洗下孢子，轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠及無菌水的三角瓶中，振蕩使孢子分散，制成均勻的孢子懸液，調(diào)整孢子濃度為106 CFU/mL。

1.3.1.3 平板分離 對(duì)菌懸液進(jìn)行系列稀釋，使其濃度分別為105、104、103、102 CFU/mL，并分別涂布于果膠平板培養(yǎng)基上，36 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d。

1.3.1.4 菌株的篩選 向平皿中加入5 mL碘液，靜止2 min即可見清晰的透明圈，將碘液倒出，加入5 mL生理鹽水 10 min，將剩余碘液沖洗干凈，選取透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，并分別進(jìn)行固體發(fā)酵，選取酶活性高的作為出發(fā)菌株。

1.3.2 誘變處理

1.3.2.1 微波誘變處理 取36 ℃恒溫培養(yǎng)5 d的出發(fā)菌種斜面，用0.9%生理鹽水洗下孢子，在盛有適量玻璃珠的錐形瓶?jī)?nèi)充分振蕩形成單孢子懸液，調(diào)整孢子濃度為 106 CFU/mL。吸取制得的孢子懸液，注入底部平整的平皿中，每個(gè)平皿的懸液量為10 mL，將盛有單孢子懸液的平皿置于微波爐中，微波爐的功率調(diào)為700 W，脈沖頻率為 2 450 Hz[6]，處理時(shí)間分別設(shè)為0、5、10、15、20、25、30、35、40 s，對(duì)孢子懸液進(jìn)行微波處理。分別從各個(gè)處理時(shí)間的平皿中取出菌懸液作適當(dāng)稀釋，吸取0.1 mL涂布于分離平板培養(yǎng)基，每個(gè)濃度涂布3個(gè)平板。將平皿用黑牛皮紙包裹以避光，置于36 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，菌落長(zhǎng)好后（約4 d）記數(shù)。

1.3.2.2 硫酸二乙酯誘變處理 取36 ℃恒溫培養(yǎng)5 d的篩選好的菌種斜面，轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠、無菌水的三角瓶中，振蕩使孢子分散，制成均勻的孢子懸液，調(diào)整孢子濃度為 106 CFU/mL。用體積分?jǐn)?shù)為0.621%的硫酸二乙酯溶液對(duì)孢子懸液進(jìn)行處理，在處理5、10、15、20 min后，加入0.3 mL 2.0% Na2S2O3溶液終止反應(yīng)。吸取0.1 mL經(jīng)不同時(shí)間硫酸二乙酯處理的菌懸液，作適當(dāng)稀釋并涂布于分離平板培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度涂布3個(gè)平板。將平皿用黑牛皮紙包裹以避光，置于36 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，菌落長(zhǎng)好后（約4 d）記數(shù)。

1.3.3 致死率曲線的繪制 選擇致死率為70%～80%時(shí)的處理時(shí)間作為微波及硫酸二乙酯的處理時(shí)間，相關(guān)計(jì)算公式：

1.3.4 突變株的篩選

1.3.4.1 突變株的初篩 方法同“1.3.1.4”節(jié)。

1.3.4.2 突變株復(fù)篩 將初篩所獲得的菌株進(jìn)行固體發(fā)酵，每株5個(gè)平行，36 ℃培養(yǎng)72 h后，按干基的25倍（質(zhì)量體積比）分別向培養(yǎng)基中加入蒸餾水浸提3 h，4層紗布過濾，得粗酶液。將其適當(dāng)稀釋，分別測(cè)定各菌株的果膠酶活性，選取果膠酶活性高的菌株。endprint

1.3.5 果膠酶活性的測(cè)定方法 采用3，5-二硝基水楊酸法[7]，底物為0.4%果膠溶液（pH值4.0），取0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液于比色管中，加入2 mL底物溶液，45 ℃水浴反應(yīng) 30 min，加入3，5-二硝基水楊酸（DNS）溶液煮沸5 min，冷卻，定容至25 mL，520 nm 處測(cè)定吸光度。酶活性定義：上述條件下1 min分解果膠生成1 μmol半乳糖醛酸所需的酶量為1個(gè)酶活性單位（U）。

1.3.6 突變株遺傳穩(wěn)定性的測(cè)定 將復(fù)篩獲得的正突變株連續(xù)傳代5代，采用固體發(fā)酵法考察菌株的產(chǎn)酶特性。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波處理時(shí)間的選擇

各種誘變劑有不同的劑量表示方法，劑量一般指作用強(qiáng)度和作用時(shí)間的乘積。微生物誘變劑的相對(duì)劑量可用相對(duì)致死率來表示。誘變劑的劑量與微生物的致死率在一定范圍內(nèi)成正比，即劑量越高，致死率也越高，在殘存細(xì)胞中變異幅度也大；反之劑量越低，致死率也越低，在殘存細(xì)胞中變異幅度也小。合適的劑量既能擴(kuò)大變異幅度，又能促使變異移向正變范圍。所以，合適的誘變劑劑量的選擇對(duì)于微生物的誘變育種是十分必要的。在誘變育種工作中，比較傾向于較低的劑量，致死率在70%～80%之間的高產(chǎn)菌株誘變效果較好。從圖1可以看出，黑曲霉HY-D7的微波誘變最適處理時(shí)間為15 s。

2.2 微波誘變結(jié)果

將HY-D7制成單孢子懸液經(jīng)微波誘變處理15 s后，涂布于果膠平板培養(yǎng)基上，36 ℃培養(yǎng)4～5 d，用透明圈法篩選出酶活性有顯著提高的突變株，部分結(jié)果見表1。

將初篩獲得的正向突變株分別接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步復(fù)篩，最后篩選出1株高產(chǎn)果膠酶菌株HY-E61，HY-E23的產(chǎn)酶活性也較高，部分結(jié)果見表2、圖2、圖3。

2.3 硫酸二乙酯處理時(shí)間的選擇

從圖4可以看出，由于致死率在70%～80%之間菌株的誘變效果好，因此黑曲霉HY-E61的硫酸二乙酯最適處理時(shí)間為15 min。

2.4 硫酸二乙酯誘變結(jié)果

首先用體積分?jǐn)?shù)為0.621%的硫酸二乙酯處理黑曲霉HY-E61孢子懸液15 min，然后用2.0% Na2S2O3溶液來終止誘變處理， 再然后將誘變后的孢子懸液涂布于果膠平板培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)4～5 d，最后用透明圈法篩選出酶活性有明顯提高的突變株HY-Z21、HY-Z40，部分結(jié)果見表3、圖5、圖6。

將初篩所得的正突變株分別接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基作進(jìn)一步復(fù)篩，結(jié)果見表4，最后篩選出1株高產(chǎn)果膠酶的菌株HY-Z40。

2.5 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)突變株HY-Z40進(jìn)行傳代培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)5代，每代菌株進(jìn)行固體發(fā)酵，測(cè)定它們的酶活性。從圖7可以看出，突變株HY-Z40傳代5次后，果膠酶活性都較高且產(chǎn)酶性狀穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以黑曲霉HY-D7作為出發(fā)菌株，采用微波及化學(xué)試劑硫酸二乙酯作為誘變劑處理黑曲霉孢子懸液，利用透明圈法進(jìn)行初篩，用固體發(fā)酵法進(jìn)行復(fù)篩，最后得到高產(chǎn)果膠酶的突變株HY-Z40，其產(chǎn)果膠酶活性達(dá)2 198 U/g，是出發(fā)菌株產(chǎn)果膠酶活性的2.51倍。經(jīng)過連續(xù)5代的斜面培養(yǎng)，突變菌株HY-Z40產(chǎn)果膠酶活性穩(wěn)定。

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