矮生沿階草莖尖離體培養(yǎng)及其植株再生

丁久玲+鄭凱

摘要：以矮生沿階草幼嫩莖尖為外植體，進行愈傷組織、叢生芽誘導以及壯苗、生根培養(yǎng)基篩選對比研究，建立矮生沿階草組培快繁體系。結(jié)果表明，采用MS+0.1 mg/L BA+0.1 mg/L KT+1.0 mg/L NAA或MS+0.2 mg/L BA+0.05 mg/L KT+1.0 mg/L NAA，愈傷組織誘導率96%以上，愈傷組織致密、淡黃色；將誘導的愈傷組織接種于MS+25 mg/L BA+0.5 mg/L KT+0.2 mg/L NAA或MS+3.0 mg/L BA+0.05 mg/L KT+0.1 mg/L NAA或MS+2.0 mg/L BA+0.1 mg/L KT+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中，可分化出較多的叢生芽；叢生芽接種于MS+2.5 mg/L BA+0.1～0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基中進行壯苗培養(yǎng)，幼苗生長健壯、色澤良好；適宜矮生沿階草組培苗生根的培養(yǎng)基為 1/4 MS+0. 2 mg/L NAA，外觀表現(xiàn)良好。

關(guān)鍵詞：矮生沿階草；莖尖；離體培養(yǎng)；植株再生

中圖分類號： S688.404+.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0173-03

矮生沿階草（Ophiopogon japonicus f. nanus）是近年來從日本引進的草坪草新品種，為百合科（Liliaceae）沿階草屬（Ophiopogon）多年生常綠草本植物，具耐陰、耐熱、耐寒、常綠等特點，具有較強的觀賞性，可作為四季常綠的草坪地被植物進行開發(fā)利用。隨著對矮生沿階草坪用性狀研究的不斷深入[1]，其作為耐陰植物栽植于風景林下、建筑物遮陽處或復層綠化帶下層越來越受到重視[2]，在國內(nèi)外綠化產(chǎn)業(yè)中的需求日益旺盛，其種苗工廠化繁殖亦受到重視。矮生沿階草繁殖方法有種子繁殖、分株繁殖、組織培養(yǎng)等，種子繁殖速度較慢，分株繁殖易造成繁殖的種苗質(zhì)量不高，組織培養(yǎng)可以加快其繁殖速度，種苗質(zhì)量較高。我國對矮生沿階草的組培快繁研究較少，僅有史清云等、李晶等對其快繁技術(shù)進行了研究，且二者均是以葉片作為外植體[3-4]。筆者對矮生沿階草進行了多年研究，發(fā)表相關(guān)論文數(shù)篇[5-7]。本研究以矮生沿階草幼嫩莖尖為外植體，從愈傷組織的誘導、愈傷組織的分化培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)及生根培養(yǎng)等幾方面進行較為系統(tǒng)的研究，建立矮生沿階草組培快繁體系，為快速繁殖優(yōu)良的矮生沿階草種苗提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的矮生沿階草材料由江蘇綠苑園林建設有限公司苗木基地提供，選取1年生的健壯植株，從其基部將萌發(fā)高度約4 cm的幼芽剝離，將全部葉片和根部剪掉，只留約2 mm莖尖作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 消毒處理 將外植體置于流水下反復沖洗0.5 h，加入適量的洗滌劑浸泡0.5 h，邊浸泡邊振蕩，沖洗干凈后移至超凈工作臺進行下一步的消毒處理。先用75%乙醇浸泡 15 s，之后用0.1% HgCl2消毒5 min，無菌水沖洗外植體5次。用滅菌紙將完全消毒好的外植體表面的水分吸干，待用。

1.2.2 愈傷組織的誘導 將消毒好的矮生沿階草幼嫩莖尖接入誘導培養(yǎng)基上誘導愈傷組織（表1）。每種配方接種18瓶，每瓶接種4個外植體。在無菌室條件下，溫度為（25±2） ℃，黑暗培養(yǎng)，2個月后觀察愈傷組織誘導情況，記錄愈傷誘導率，誘導率=（誘導出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%。

1.2.3 愈傷組織的分化培養(yǎng) 用優(yōu)選的培養(yǎng)基進行愈傷組織的誘導后，把愈傷組織切成2 mm的小塊，接入分化培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)（表2），培養(yǎng)條件為溫度（25±2） ℃、光照度1 500～2 000 lx、光照時間10～12 h/d。每種分化培養(yǎng)基配方接種18瓶，每瓶接種5個愈傷組織小塊。經(jīng)過分化培養(yǎng)后在愈傷組織上萌發(fā)出一定數(shù)量的不定芽，2個月后對分化的不定芽進行觀察和統(tǒng)計，計算分化率，分化率=（分化出芽的材料數(shù)/接種的材料數(shù)）×100%。

1.2.4 壯苗培養(yǎng) 由于分化培養(yǎng)出的不定芽幼嫩，有必要進行壯苗培養(yǎng)。將優(yōu)選的分化培養(yǎng)基上分化的不定芽切下接種于壯苗培養(yǎng)基上進行壯苗培養(yǎng)（表3）。每種壯苗培養(yǎng)基配方接種15瓶，每瓶接種4個不定芽（生長一致，高度為5～6 mm）。培養(yǎng)條件：溫度和光照度同愈傷組織的分化培養(yǎng)，光照時間12～15 h/d。1個月后觀察幼苗生長情況。

1.2.5 生根培養(yǎng) 選擇優(yōu)選的壯苗培養(yǎng)基對矮生沿階草的幼苗進行壯苗培養(yǎng)后，把健壯的矮生沿階草無根幼苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)（表4）。每種生根培養(yǎng)基配方接種12瓶，每瓶接種5株生長一致的幼苗，培養(yǎng)條件同上。3周后觀察幼苗根系生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導

不同的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上的產(chǎn)生的愈傷組織有所不同（表1）。幾種培養(yǎng)基中，配方5和配方2的愈傷組織誘導率較高，分別為99%和96%，愈傷組織均表現(xiàn)為致密、淡黃色。其余配方的愈傷組織誘導率較低，為52%～74%，且誘導出的愈傷組織外觀表現(xiàn)不良，黃色或褐色，嚴重影響不定芽的分化。綜上所述，通過適宜的培養(yǎng)基配方可以使矮生沿階草幼嫩莖尖誘導出大量的愈傷組織，且愈傷組織外觀表現(xiàn)良好，誘導矮生沿階草愈傷組織適宜的培養(yǎng)基配方為MS+0.1 mg/L BA+0.1 mg/L KT+1.0 mg/L NAA或MS+0.2 mg/L BA+0.05 mg/L KT+1.0 mg/L NAA，愈傷組織誘導率96%以上，且外觀表現(xiàn)良好。

2.2 分化培養(yǎng)

不同的培養(yǎng)基對愈傷組織進行培養(yǎng)，分化出的不定芽有所不同（表2）。幾種培養(yǎng)基中，配方3的分化率最高，達到92%；其次是配方6和配方5，分化率分別為88%和86%；且3種培養(yǎng)基分化出的不定芽高度和長勢無明顯差異，高度為0.5～0.6 cm，生長健壯。其余配方的分化率較低，生長一般。因此，適宜的培養(yǎng)基可以使愈傷組織分化出較多的不定芽，通過本研究可判定，矮生沿階草愈傷組織分化出較多不定芽的培養(yǎng)基為MS+2.5 mg/L BA+0.5 mg/L KT+0.2 mg/L NAA或MS+3.0 mg/L BA+0.05 mg/L KT+0.1 mg/L NAA或 MS+2.0 mg/L BA+0.1 mg/L KT+0.1 mg/L NAA。在優(yōu)選的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d，將高0.5 cm以上的不定芽從基部剪下，接種至相同的培養(yǎng)基上進行不定芽分化繼代培養(yǎng)。每50 d繼代1次，繼代培養(yǎng)4代后不定芽達到6～7倍，進行壯苗培養(yǎng)。觀察發(fā)現(xiàn)，繼代培養(yǎng)分化的不定芽長勢與愈傷組織分化的不定芽基本一致。endprint

2.3 壯苗培養(yǎng)

不定芽接種于不同的壯苗培養(yǎng)基上表現(xiàn)有所不同（表3）。配方3和配方4幼苗生長最好，高度分別達2.8、2.6 cm，且健壯、色澤深綠色；其次是配方7和配方8，幼苗高度分別為2.0、1.9 cm，但幼苗表現(xiàn)為淡綠色，生長一般；配方5和配方6的幼苗生長最差，高度分別為1.6、1.4 cm，外觀表現(xiàn)為細弱、幼嫩，色澤黃綠色或淡綠色。綜上所述，適宜的壯苗培養(yǎng)基可以使矮生沿階草的不定芽變成健壯、且色澤好的幼苗，由本研究可知，矮生沿階草適宜的壯苗培養(yǎng)基為MS+2.5 mg/L BA+0.1～0.2 mg/L NAA。

2.4 生根培養(yǎng)

把健壯的矮生沿階草無根幼苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)（表4）。運用配方5對幼苗進行生根培養(yǎng)時，根系生長最好，長度達1.8 cm，外觀表現(xiàn)為健壯、白色，且平均根數(shù)達到5.7條/株；其次是配方4，根系長度為1.5 cm，外觀表現(xiàn)為較健壯、淡黃色，平均根數(shù)為2.8根/株；其他配方的培養(yǎng)出的組培苗根系長度較短，生長一般、色澤淡黃色或黃褐色。矮生沿階草根系生長的好壞直接影響組培苗移栽成活率的高低，應選擇健壯、長度長、具有白色根系的組培苗進行栽培。綜上所述，適宜的生根培養(yǎng)基利于矮生沿階草的幼苗根系的萌發(fā)和生長，由本研究可知，矮生沿階草適宜的生根培養(yǎng)基為1/4MS+0.2 mg/L NAA。

3 討論與結(jié)論

關(guān)于沿階草屬組培方面的研究較多，其中以葉片為外植體誘導愈傷組織者居多，以莖尖為外植體誘導愈傷者的較少。目前，僅有別運清等[8]、鄭志仁等[9]分別以湖北麥冬的莖尖和黑麥冬帶莖尖的幼嫩莖段為外植體的報道。本研究以矮生沿階草的幼嫩莖尖為外植體，為沿階草屬植物的莖尖離體培養(yǎng)提供一定的依據(jù)。

不同的植物器官誘導愈傷組織，其培養(yǎng)基有所不同。以葉片為外植體篩選誘導愈傷組織的培養(yǎng)基的研究中，日本矮生沿階草的培養(yǎng)基是MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L KT+0.1 mg/L NAA[3]，山麥冬理想的培養(yǎng)基是MS+1.5 mg/L 2，4-D+0.4 mg/L BA+1.0 mg/L NAA[10]。以莖尖為外植體篩選誘導愈傷組織的培養(yǎng)基的研究中，湖北麥冬在MS+2.0 mg/L BA+0.2～0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基中能完成愈傷組織的誘導[8]，黑麥冬誘導愈傷組織的培養(yǎng)基[9]與湖北麥冬的相似。這些研究表明植物器官誘導愈傷組織需要細胞分裂素和生長素共同作用，且二者比例應適當，本研究得出了與此一致的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)矮生沿階草莖尖愈傷組織的誘導需要細胞分裂素（BA和KT）和生長素（NAA）的共同作用，二者的比例為0.2～0.25 ∶ 1.0，即需要較低含量的細胞分裂素和較高含量的生長素。本研究以莖尖為外植體誘導愈傷組織，適宜的培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L BA+0.1 mg/L KT+1.0 mg/L NAA或MS+0.2 mg/L BA+0.05 mg/L KT+1.0 mg/L NAA，與別運清等的研究結(jié)果[8-9]有一定的差異，這可能是植物材料本身造成的，本研究采用的是矮生沿階草，而后者采用的是湖北麥冬和黑麥冬。

前人研究表明，色澤淡黃或淡綠色、質(zhì)地緊密的愈傷組織易分化誘導出不定芽，而色澤發(fā)黃或褐色、質(zhì)地疏松的愈傷組織嚴重影響不定芽的分化[11-12]。本研究利用誘導率較高的培養(yǎng)基培養(yǎng)出的愈傷組織色澤淡黃、結(jié)構(gòu)致密，適宜誘導分化出大量的不定芽。

對于愈傷組織的分化培養(yǎng)，亦需要細胞分裂素和生長素的共同作用，與愈傷組織誘導相反，愈傷組織分化需要較高含量的細胞分裂素和較低含量的生長素。通過本研究可知，使矮生沿階草愈傷組織分化出較多不定芽的培養(yǎng)基為MS+2.5 mg/L BA+0.5 mg/L KT+0.2 mg/L NAA或MS+3.0 mg/L BA+0.05 mg/L KT+0.1 mg/L NAA或MS+2.0 mg/L BA+0.1 mg/L KT+0.1 mg/L NAA。這與別運清等的研究結(jié)果[8-9]一致。從篩選出的分化培養(yǎng)基中分析，細胞分裂素的類型亦影響不定芽的分化，高含量的BA和低含量的KT利于分化出不定芽，而BA含量較低和KT含量較高時則不利于不定芽的分化。

經(jīng)過壯苗培養(yǎng)的幼苗用生根培養(yǎng)基培養(yǎng)1個月后可進行煉苗移栽，經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)經(jīng)1/4 MS+0.2 mg/L NAA生根培養(yǎng)基培養(yǎng)的組培苗其成活率高，達95%，而其他生根培養(yǎng)基培養(yǎng)出的組培苗其成活率低，約為36%～65%，這與組培苗根系的數(shù)量、色澤、和長度等有一定的關(guān)系。根系健壯、色澤嫩白、數(shù)量多的幼苗移栽成活率高。

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