LncRNA H19與OSF發(fā)生及癌變的關(guān)系

蘇花 周珅玥 郭新程 王海青 李翠 黃建華

LncRNA H19與OSF發(fā)生及癌變的關(guān)系

蘇花 周珅玥 郭新程 王海青 李翠 黃建華

目的探討lncRNA H19在口腔黏膜下纖維性變(OSF)發(fā)生及癌變過程中的表達變化及其意義。方法實時熒光定量PCR技術(shù)分別檢測12 例正常頰黏膜組織、33 例OSF頰黏膜組織、31 例伴OSF頰癌組織中的LncRNA H19的表達水平。結(jié)果LncRNA H19在頰黏膜組織、OSF頰黏膜組織、伴OSF頰癌組織中的相對表達量分別為1.17±0.37、3.44±1.08、8.88±1.78，組間兩兩之間比較，Plt;0.01。結(jié)論LncRNA H19可能參與OSF的發(fā)生及癌變。

口腔黏膜下纖維性變； 癌變； LncRNA H19

口腔黏膜下纖維性變(oral submucous fibrosis，OSF)由Schwartz在1952年首次報道并命名，是一種慢性進行性并且具有癌變傾向的口腔黏膜疾病，主要發(fā)生于印度、巴基斯坦等東南亞地區(qū)，我國主要見于湖南和臺灣2 省[1]。1956 年P(guān)aymaster[2]首次報道OSF具有癌變傾向，之后的研究也證實了類似現(xiàn)象，并被WHO口腔癌前病變研究中心列為癌前狀態(tài)，但報道的癌變率存在較大差異，區(qū)間在2%～8%之間[1]。近年來，針對OSF的具體發(fā)病機制及癌變誘導(dǎo)因素的研究不斷被報道，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)檳榔中的檳榔堿、亞硝基胺和煙草中的尼古丁等致癌成分能夠參與OSF的癌變，然而具體誘變機制仍然不清楚[3-4]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA) 是一類長度大于200 個核苷酸、不具有蛋白質(zhì)編碼功能的轉(zhuǎn)錄本，以往一直被認為是轉(zhuǎn)錄的暗物質(zhì)和副產(chǎn)物[5]。但近年來的研究表明lncRNA在劑量補償效應(yīng)、表觀遺傳調(diào)控、細胞周期調(diào)控和細胞分化調(diào)控等眾多生命活動中發(fā)揮重要作用，其表達紊亂與多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[5-7]。H19 是第一個被發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的lncRNA，僅在胚胎組織中表達，在成年組織中一般不表達，但在組織再生及腫瘤發(fā)生時被重新激活[8]。LncRNA H19的印跡缺失已經(jīng)被認為是癌癥發(fā)生的早期事件，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著非常重要的角色，是繼p53 基因之后在腫瘤分子生物學(xué)上又一重大發(fā)現(xiàn)[9]。目前國內(nèi)外均有大量文獻研究H19在不同疾病和腫瘤中的表達及作用機制[6-7]，OSF作為癌前狀態(tài)，具有一定的癌變傾向，而關(guān)于H19在OSF的發(fā)生及癌變過程中所扮演的角色目前尚無相關(guān)報道。我國湖南省、海南省及臺灣作為世界上口腔黏膜下纖維化及口腔癌發(fā)生率較高的地區(qū)，研究口腔黏膜下纖維化發(fā)生發(fā)展及癌變過程中可能存在的特異性標記分子，為針對性基因治療提供理論基礎(chǔ)具有重要意義。本研究采用實時熒光定量PCR技術(shù)初步研究了H19在正常頰黏膜、OSF、伴有OSF頰癌組織中分子水平的表達，探索H19在OSF發(fā)生及癌變過程中的潛在臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床標本收集

選2014-01～2014-09中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院口腔科及中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院頭頸外科就診及住院的OSF患者及伴OSF頰癌患者共64 例，均未經(jīng)特殊治療、無其他系統(tǒng)疾病，其中口腔黏膜下纖維性變患者33例，伴口腔黏膜下纖維性變頰癌患者31 例(均為患者先出現(xiàn)OSF癥狀,后出現(xiàn)口腔癌變,取其口腔癌變組織部分)，正常口腔頰黏膜組織12 例(均為志愿者，且無煙、檳榔嗜好，無口腔黏膜疾病)，上述標本依次分入OSF頰黏膜組、伴OSF頰癌組和正常頰黏膜組。所有患者均簽署知情同意書，活檢組織標本分2 份，一份固定于10%甲醛溶液中送中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院病理科獲得病理診斷書，另一份于液氮罐中保存。

1.2 材料

Trizol(美國 Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(立陶宛 Fermentas)，SYBR Green PCR Master Mix(美國 ABI)，Tris、瓊脂糖、DEPC水(美國 Sigma),引物由南京金斯瑞公司合成。其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取 正常頰黏膜組織、OSF頰黏膜組織和伴有OSF的頰癌組織從液氮中取出后，迅速在液氮下研磨組織標本，使用Trizol法對研磨后的組織進行RNA抽提，按說明書操作要求抽提總RNA，用紫外分光光度儀測定RNA A260和A280的吸光度值。RNA純度=A260/A280，實驗中比值均在1.8～2.0之間，表明樣本純度較好，無明顯污染。進一步采用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的質(zhì)量。

1.3.2 cDNA 反轉(zhuǎn)錄合成 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取1 μg RNA，依次加入反應(yīng)試劑，以終體積20 μl反應(yīng)體系進行 cDNA 反轉(zhuǎn)錄合成。反應(yīng)程序為：65 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，70 ℃ 5 min。反應(yīng)產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實時熒光定量檢測 參照SYBR Green PCR Master Mix(美國 ABI)試劑盒說明書，采用7900HT Fast Real-Time PCR儀( 美國ABI)進行qRT-PCR反應(yīng)檢測組織中l(wèi)ncRNA H19的表達水平。H19上游引物序列：5'-CCGTCTCCACAACTCCAACCAG-3'，下游引物序列5'-TCAAAGCCTCCACGACTCTGTTT-3'。使用GAPDH作為內(nèi)參基因，GAPDH的上游引物序列：5'- CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3'，下游引物序列：5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'。反應(yīng)條件: 95 ℃ 10 min, 1 個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環(huán)。上機反應(yīng)后的數(shù)據(jù)先用內(nèi)參基因GAPDH進行標化，并用2-ΔΔCT值來表示lncRNA H19的相對表達水平。每個樣本檢測均重復(fù)3 次，取其平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

以上數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)處理，首先用完全隨機方差分析分析，得出有差異以后，再用Dunnet-t檢驗進行兩組之間的比較，Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實時熒光定量PCR檢測H19基因的表達水平

正常頰黏膜組織、OSF頰黏膜組織和伴有OSF的頰癌組織中均檢測到H19基因的表達，經(jīng)正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布(Pgt;0.05)。正常頰黏膜、OSF頰黏膜組織和伴有OSF的頰癌組織中H19基因的相對表達量分別為1.17±0.37，3.44±1.08，8.88±1.78(圖 1～3)。

圖 1 H19在正常頰黏膜中的表達水平

2.2 H19基因在OSF組織、OSF癌變組織和正常頰黏膜組織中的表達情況

采用Dunnet-t檢驗進行兩兩之間的統(tǒng)計比較，結(jié)果顯示，H19基因在伴有OSF的頰癌組織較OSF頰黏膜組織中的表達水平明顯升高(Plt;0.01)，其在OSF頰黏膜組織中的表達水平比正常頰黏膜組織中的表達水平也明顯升高(Plt;0.01)(圖 4)，且H19基因在正常頰黏膜、OSF頰黏膜組織中和伴有OSF的頰癌組織中的相對表達量成升高趨勢。

圖 2 H19在OSF頰黏膜組織中的表達水平

圖 3 H19在伴OSF頰癌組織中的表達水平

圖 4 3 組樣本中H19相對表達量的比較

3 討 論

LncRNA H19是最早發(fā)現(xiàn)的一種長鏈非編碼RNA，定位于人染色體llpl5.5區(qū)。在正常組織內(nèi)，H19為母系等位基因表達，父系等位基因沉默的印跡基因。印跡基因表達異常，包括印跡獲得(gain of imprinting，GOI)和印跡丟失(loss of imprinting，LOI)，可引起一系列生理病理改變甚至腫瘤的發(fā)生。研究表明，H19在多種腫瘤中都存在異常表達，異常表達的H19能夠影響腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、細胞增殖分化、血管形成等生理過程從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。而對人類口腔黏膜及其癌前病變的lncRNA 表達圖譜分析[11]，發(fā)現(xiàn)了超過60% lncRNA(325 種)在癌組織中存在異常表達，其中包括lncRNA H19，但尚無相關(guān)功能研究報道。

口腔黏膜下纖維化作為一種癌前狀態(tài)，具有一定的癌變能力。因此，尋找能夠指示導(dǎo)致口腔黏膜下纖維病變的特異性標記分子，對預(yù)防口腔黏膜下纖維性變的發(fā)生及癌變具有重要意義。近年來的研究發(fā)現(xiàn)成纖維細胞，尤其是肌成纖維細胞在OSF的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[12]。異常表達的H19基因在纖維化的發(fā)生過程中的相關(guān)研究已有報道，如章杰等[13]首次報道了H19 的過量表達與瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖密切相關(guān)，下調(diào)H19的表達可以抑制mTOR 和 VEGF 的產(chǎn)生，從而抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖。而H19基因在不同階段的口腔病理狀態(tài)的表達水平及其與OSF發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系目前還未見報道。

本研究從3 個不同階段的口腔病理狀態(tài)著手，通過反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR檢測了正常頰黏膜組織、OSF頰黏膜組織和伴有OSF的頰癌組織中3 個不同階段H19的表達水平，結(jié)果表明，H19的表達在3 個不同階段的口腔病理狀態(tài)呈逐漸增高的趨勢，H19基因在伴有OSF的頰癌組織較OSF頰黏膜組織中的表達水平明顯升高，其在OSF頰黏膜組織中的表達水平比正常頰黏膜組織中的表達水平也明顯升高，表明H19和口腔黏膜纖維化的發(fā)生及癌變有一定的聯(lián)系，提示H19具有成為口腔黏膜下纖維性變發(fā)生發(fā)展及癌變的生物標記物的可能，為其后續(xù)的實驗研究及相關(guān)臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),研究將進一步探討H19在口腔黏膜下纖維化發(fā)生發(fā)展及癌變過程中的生物學(xué)功能及其作用機制，明確其表達升高的原因及其與OSF的預(yù)后之間的關(guān)系。

綜上所述，H19在OSF組織和伴有OSF的頰癌組織表達明顯上調(diào)，提示H19可能參與了OSF的發(fā)生及癌變，可作為口腔黏膜下纖維性變的潛在生物標記物，其具體的機制有待進一步深入研究。

[1] 陳謙明.口腔黏膜病學(xué)[M]. 4版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2012:127-130.

[2] Paymaster JC. Cancer of the buccal mucosa; a clinical study of 650 cases in Indian patients[J]. Cancer,1956,9(3):431-435.

[3] 高義軍,凌天牖,尹曉敏,等.檳榔堿及尼古丁對口腔角質(zhì)形成細胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達的影響[J]. 中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,2007,42(1):26-30.

[4] 李輝莉,方廠云,蘇征. 檳榔堿對口腔黏膜成纖維細胞微絲骨架及膠原吞噬的影響[J]. 實用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2013, 29(6): 816-819.

[5] 王艷紅,劉宗才,闞云超,等.長片段非編碼RNA及其功能研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(13): 6641-6643.

[6] 李靈,宋旭.長鏈非編碼RNA在生物體中的調(diào)控作用[J]. 遺傳,2014,36(3):228-236.

[7] 李琪兒,葉國良,郭俊明.lncRNA:腫瘤分子診斷中的一顆新星[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2014,30(3): 233-240.

[8] Gabory A，Jammes H，Dandolo L．The H19 locus: Role of an imprinted non-coding RNA in growth and development[J]．Bioessays,2010,32(6):473-480.

[9] 楊季紅,程樹杰.IGF-2和H19與腫瘤關(guān)系的研究進展[J].河北醫(yī)藥,2011, 33(18): 2836-2839.

[10]Rancourt RC, Harris HR, Barault L, et al. The prevalence of loss of imprinting of H19 and IGF2 at birth[J]. FASEB J,2013,27(8):3335-3343.

[11]Gibb EA, Enfield KS, Stewart GL, et al. Long non-coding RNAs are expressed in oral mucosa and altered in oral premalignant lesions[J]. Oral Oncol,2011,47(11):1055-1061.

[12]Angadi PV, Kale AD, Hallikerimath S. Evaluation of myofibroblasts in oral submucous fibrosis: Correlation with disease severity[J]. J Oral Pathol Med，2011,40(3):208-213．

[13]章杰,李文芳,王芳,等.長鏈非編碼RNA H19對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響[J].實用中西醫(yī)結(jié)合臨床, 2013, 13(9): 1-9.

(收稿： 2016-12-24 修回： 2016-01-21)

TherelationshipofLncRNAH19withtheoccurrenceandthecarcinogenesisofOSF

SUHua,ZHOUShenyue,GUOXincheng,WANGHaiqing,LICui,HUANGJianhua.

410013Changsha,DepartmentofStomatology,thirdXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,China

Objective: To study the significance of H19 gene in the progress from normal mucosa through oral submucous fibrosis(OSF) to carcinogenesis.MethodsReal-time fluorescent quantitative PCR technique was used to detect LncRNA H19 expression level in 12 cases of normal buccal mucosa tissue, 33 cases of OSF buccal mucosa tissue and 31 cases of buccal carcinoma with OSF.ResultsThe relative expression levels of LncRNA H19 in normal buccal mucosa tissues, OSF buccal mucosa tissue and buccal carcinoma with OSF tissue were 1.17±0.37, 3.44±1.08 and 8.88±1.78 respectively(between each 2 groups,Plt;0.01).ConclusionH19 may involve the occurrence and canceration of OSF.

Oralsubmucousfibrosis(OSF);Carcinogenesis;LncRNAH19

2015 湖南省保健專項資金科研課題( 編號: B2015-05)

410013 長沙，中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院口腔科

郭新程E-mail: guoxinchengf3@126． com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.020