用優(yōu)化高效液相色譜法測(cè)定大棗中蘆丁含量的效果研究

李 環(huán)

（廣東汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 廣東 汕頭 515041）

·論著·

用優(yōu)化高效液相色譜法測(cè)定大棗中蘆丁含量的效果研究

李 環(huán)

（廣東汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 廣東 汕頭 515041）

目的：研究用優(yōu)化高效液相色譜法測(cè)定大棗中蘆丁含量的效果。方法：使用優(yōu)化高效液相色譜法測(cè)定大棗中蘆丁的含量，測(cè)定時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)為：MACHEREY-NAGEL(MN) NUCLEODUR 100-5 C18柱(BATCH2064)，測(cè)定時(shí)的流動(dòng)相為：乙腈-0.05%磷酸（0.15：0.85），流速為：1.0ml/min，波長(zhǎng)為：257nm，柱溫為：40℃。結(jié)果：經(jīng)檢測(cè)，蘆丁的線性范圍為0.05055～0.4044μg，其相關(guān)系數(shù)為r＝0.9987，其加樣回收率為97.06%。上述結(jié)果均符合相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，RSD=1.3%(n=6)。結(jié)論：用優(yōu)化高效液相色譜法測(cè)定大棗中蘆丁含量的效果確切，而且能夠避開(kāi)大棗中糖類成分對(duì)測(cè)量結(jié)果的干擾。

大棗；蘆丁含量；高效液相色譜法；測(cè)定

大棗既是一種常見(jiàn)的食品，又是中醫(yī)常用的藥物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大棗中最有藥用價(jià)值的成分為蘆丁[1,2]。不過(guò)，由于大棗中含有大量的可影響蘆丁測(cè)定結(jié)果的糖類成分，因此如何準(zhǔn)確地測(cè)定大棗中蘆丁的含量一直是藥理學(xué)中的一個(gè)難題。在本次研究中，筆者使用優(yōu)化高效液相色譜法測(cè)定大棗中蘆丁的含量，取得了令人滿意的效果?，F(xiàn)將本次實(shí)驗(yàn)的過(guò)程和結(jié)果報(bào)告如下：

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)用的儀器 本次實(shí)驗(yàn)使用的儀器包括：島津牌LC-10AT型高液相色譜儀、烘箱（WTB-BINDER ZYD04030）、粉碎機(jī)（RT-04）。

1.2 實(shí)驗(yàn)用的試劑和對(duì)照品 本次實(shí)驗(yàn)使用的試劑和對(duì)照品包括：乙醇、正丁醇、磷酸、丙酮（以上試劑均為A.R級(jí)，由廣州化學(xué)試劑廠提供）、蒸餾水、乙腈、甲醇（流動(dòng)相為色譜醇）、大孔吸附樹(shù)脂（D-101凈品型，由廣州市廣聯(lián)津化工有限公司提供）、聚酰胺薄膜（10×20cm，由浙江省臺(tái)州市路橋四青生化材料廠提供）、蘆?。ㄊ|香苷）對(duì)照品（由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)為：0080-9705號(hào)）

1.3 試驗(yàn)用的藥材 本次實(shí)驗(yàn)使用的藥材為大棗（由廣州奇星制藥有限公司提供），其干燥和粉碎的方法為：將大棗切成薄片。將大棗片放入烘箱中進(jìn)行烘烤，烘烤時(shí)的溫度為70℃。待大棗片完全烘干后，將其在干燥的環(huán)境中放置8個(gè)小時(shí)，然后用粉碎機(jī)對(duì)其進(jìn)行粉碎處理。

2 實(shí)驗(yàn)的方法與結(jié)果

2.1 提取溶劑

2.1.1 進(jìn)行水煮提取 精密稱取大棗樣品2g，將其放入250ml的燒杯中，并向燒杯中加入100ml的蒸餾水，然后用大火對(duì)燒杯進(jìn)行加熱，直至燒杯中的溶液沸騰后轉(zhuǎn)為小火煮1.5個(gè)小時(shí)。

2.1.2 進(jìn)行超聲提取 精密稱取大棗樣品2g，將其放入有塞的錐形瓶中，然后向錐形瓶中分別加入100ml濃度為50%的甲醇、100ml濃度為80%的甲醇和100ml濃度為90%的甲醇，并放置1個(gè)小時(shí)，最后對(duì)浸泡好的大棗樣品進(jìn)行30分鐘的超聲提取。

2.1.3 進(jìn)行索氏回流提取 精密稱取大棗樣品2g，將其放入濾紙筒中，用100ml濃度為50%的甲醇對(duì)其進(jìn)行3個(gè)小時(shí)的索氏回流提取，直至大棗樣品的顏色完全消失。

2.1.4 提取的結(jié)果 見(jiàn)圖1和表1。

表1 提取的比較(mg/g)

圖1 不同提取方法及提取溶劑樣品的HPLC色譜圖(該圖由下至上依次為蘆丁對(duì)照品、水煮提取的結(jié)果、超聲提取的結(jié)果和索氏回流提取的結(jié)果)

2.2 進(jìn)行正丁醇抽提 對(duì)大棗樣品溶液進(jìn)行過(guò)濾，提取其中的殘?jiān)Ｏ扔锰崛∪苊较礈爝^(guò)濾后的大棗樣品殘?jiān)?，然后?0ml的蒸餾水對(duì)大棗的殘?jiān)M(jìn)行分次洗滌，將洗滌獲得的溶液放入分液漏斗中，再用水飽和正丁醇對(duì)該溶液進(jìn)行抽提，每次抽提40ml。留取抽提第四次和抽提第五次的溶液，將其分別蒸干并進(jìn)行薄層檢查（進(jìn)行薄層檢查的條件可參考2000年版的《中國(guó)藥典》）。進(jìn)行薄層檢查的結(jié)果顯示，用水飽和正丁醇對(duì)大棗樣品殘?jiān)芤哼M(jìn)行抽提4次后，基本能夠提取出大棗中的蘆丁成分。

2.3 進(jìn)行上柱試驗(yàn)（D101）

2.3.1 進(jìn)行洗脫液極性的比較 將大棗樣品上柱后，分別用60ml的蒸餾水、60ml濃度為30%的乙醇、60ml濃度為50%的乙醇和60ml濃度為80%的乙醇對(duì)其進(jìn)行洗脫處理，并收集每種洗脫液。對(duì)每種洗脫液都進(jìn)行蒸干處理，然后用1ml的甲醇對(duì)每種洗脫液的殘?jiān)M(jìn)行溶解，并對(duì)溶解液進(jìn)行聚酰胺薄層檢查。檢查的結(jié)果為：用濃度為50%的乙醇進(jìn)行洗脫處理時(shí)大棗中蘆丁的斑點(diǎn)最清晰（為兩個(gè)斑點(diǎn)），用濃度為30%的乙醇和濃度為80%的乙醇進(jìn)行洗脫處理時(shí)大棗中蘆丁的斑點(diǎn)隱約可見(jiàn)。因此，可將濃度為50%的乙醇作為洗脫大棗樣品的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3.2 進(jìn)行洗脫液體積的比較 將大棗樣品上柱，分別用60ml的蒸餾水、60ml濃度為50%的乙醇、50ml濃度為50%的乙醇和40ml濃度為50%的乙醇對(duì)其進(jìn)行洗脫處理，并收集每種洗脫液。對(duì)每種洗脫液都進(jìn)行蒸干處理，然后用1ml的甲醇對(duì)每種洗脫液的殘?jiān)M(jìn)行溶解，并對(duì)溶解液進(jìn)行聚酰胺薄層檢查。檢查的結(jié)果為：用60ml濃度為50%的乙醇進(jìn)行洗脫處理時(shí)大棗中蘆丁的斑點(diǎn)最清晰。

2.4 進(jìn)行流動(dòng)相和柱溫的比較 本次實(shí)驗(yàn)先使用甲醇-0.5%磷酸(0.32：0.48)作為流動(dòng)相，將柱溫調(diào)節(jié)至38℃后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果未能獲得大棗樣品的色譜峰。然后，本次實(shí)驗(yàn)使用乙腈-0.05%磷酸（0.15：0.85）作為流動(dòng)相，將柱溫調(diào)節(jié)至40℃后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果獲得了大棗樣品的色譜峰。

2.5 進(jìn)行線性關(guān)系考察 精密稱取適量的蘆丁對(duì)照品，用甲醇將其配制成濃度為0.2022mg/ml的對(duì)照品溶液。精密稱取蘆丁對(duì)照品溶液2ml，將其放入20ml的量瓶中，用甲醇對(duì)其進(jìn)行定溶，然后對(duì)其色譜峰面積（A）和濃度（c）進(jìn)行線性關(guān)系考察。進(jìn)行線性關(guān)系考察的回歸方程為：C=-3.543621×10-3+6.7052×10-7A，r=0 .9987。結(jié)果顯示，蘆丁對(duì)照品的線性范圍為：0.05055-0.4044μg。

2.6 進(jìn)行精密度試驗(yàn) 取蘆丁對(duì)照品溶液(20.22ug/ml)10μl，對(duì)其連續(xù)進(jìn)行8次的進(jìn)樣處理，然后計(jì)算8次進(jìn)樣時(shí)蘆丁對(duì)照品溶液峰面積的平均值，結(jié)果為：319916。RSD＝1.3%(n=8)。

2.7 進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn) 稱取大棗樣品12g，將其平均分成6份，對(duì)每份大棗樣品進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)，具體的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)的結(jié)果

2.8 進(jìn)行回收率試驗(yàn) 稱取大棗樣品6g，將其平均分成6份，將每份樣品加入到5ml濃度為（15.96μg/ml）的蘆丁對(duì)照液中，然后對(duì)其進(jìn)行回收率試驗(yàn)。具體的結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 進(jìn)行回收率試驗(yàn)的結(jié)果

3 討論

本次研究的結(jié)果說(shuō)明，用優(yōu)化高效液相色譜法測(cè)定大棗中蘆丁含量的效果確切，而且能夠避開(kāi)大棗中糖類成分對(duì)測(cè)量結(jié)果的干擾。不過(guò)，為了進(jìn)一步提高用優(yōu)化高效液相色譜法測(cè)定大棗中蘆丁含量的效果，筆者認(rèn)為，在使用此方法測(cè)定大棗中蘆丁含量時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①不要將沒(méi)經(jīng)過(guò)用水飽和正丁醇抽提的大棗樣品直接上柱，否則會(huì)影響大棗樣品色譜峰的峰形。②在進(jìn)行索氏回流提取的過(guò)程中，應(yīng)在濾紙筒中鋪墊少許的棉花，以免導(dǎo)致大棗樣品粉末隨甲醇回流入燒杯中。③在用不同濃度的乙醇對(duì)大棗樣品進(jìn)行洗脫處理時(shí)，應(yīng)盡量放慢洗脫的速度，以免因乙醇中產(chǎn)生氣泡而導(dǎo)致大孔樹(shù)脂發(fā)生斷層，從而影響洗脫的效果。

[1]樊君,呂磊,尚紅偉.大棗的研究與開(kāi)發(fā)進(jìn)展[J].食品科學(xué),2003,24(4):161-163.

[2]王朝周,程秀民.薄層掃描法測(cè)定槐米中蘆丁含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2004,10(4):21-22.

R282.5

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2095-7629-（2017）3-0001-02