工業(yè)生物過程系統(tǒng)集成優(yōu)化在有機酸生產(chǎn)中的應(yīng)用

田錫煒 ，路飛 ，錢江潮 ，莊英萍 ，夏建業(yè) ，儲炬

1.生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，華東理工大學(xué)，上海 200237 2.國家生化工程技術(shù)研究中心（上海），華東理工大學(xué)，上海 200237

工業(yè)生物過程系統(tǒng)集成優(yōu)化在有機酸生產(chǎn)中的應(yīng)用

田錫煒1，2，路飛1，2，錢江潮1，2，莊英萍1，2，夏建業(yè)1，2，儲炬1，2

1.生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，華東理工大學(xué)，上海 200237 2.國家生化工程技術(shù)研究中心（上海），華東理工大學(xué)，上海 200237

生物基化學(xué)品在人類社會、經(jīng)濟和環(huán)境中的應(yīng)用受到越來越多關(guān)注。工業(yè)生物過程是由高復(fù)雜性生命系統(tǒng)和大規(guī)模性工程系統(tǒng)組成的有機整體，因此實現(xiàn)工業(yè)生物過程的系統(tǒng)集成對提升生產(chǎn)效率和資源利用率以及降低能耗和排放具有非常重要的作用。簡要綜述了當(dāng)前工業(yè)生物過程系統(tǒng)集成的理論、方法和技術(shù)，并重點介紹了其在乳酸和葡萄糖酸鈉工業(yè)生產(chǎn)過程中的應(yīng)用。

工業(yè)生物過程；系統(tǒng)集成；乳酸；葡萄糖酸鈉

大宗化學(xué)品是人類現(xiàn)代工業(yè)和文明的物質(zhì)基礎(chǔ)。中國是全球第一大化工產(chǎn)品生產(chǎn)國，其產(chǎn)業(yè)是國民經(jīng)濟的傳統(tǒng)支柱產(chǎn)業(yè)。隨著石化資源、能源與環(huán)境危機的日益加劇，可再生資源利用和工業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用生產(chǎn)生物基化學(xué)品逐漸成為人類社會、經(jīng)濟和環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的保障。

工業(yè)生物過程是一個由上（菌種）、中（過程優(yōu)化）、下（過程處理）游三個部分組成的集成系統(tǒng)。過程系統(tǒng)集成技術(shù)在提升生產(chǎn)效率、能源資源利用率、污染防治以及降低投資與操作費用等方面具有重要的作用。然而，由于生命系統(tǒng)的高度復(fù)雜性及工業(yè)生物過程的大規(guī)模性，實現(xiàn)工業(yè)生物過程的系統(tǒng)集成要涉及生物學(xué)、工程學(xué)等眾多學(xué)科問題。如何從全局出發(fā)統(tǒng)籌安排，使資源、能源得到最高效和最經(jīng)濟的利用或轉(zhuǎn)化，是實現(xiàn)過程全局、系統(tǒng)優(yōu)化的關(guān)鍵。過去對于工業(yè)生物過程的認識多停留在時空分離狀態(tài)下的孤立系統(tǒng)，例如生物過程參數(shù)的簡易檢測、單一層面細胞表型與環(huán)境的關(guān)系、生物過程的經(jīng)驗式放大等，這都使得研究者們難以把握工業(yè)生物過程中細胞代謝變化的本質(zhì)以及體現(xiàn)在宏觀水平上敏感參數(shù)的響應(yīng)。針對上述問題，研究者們提出結(jié)合生物過程中信息流、物質(zhì)流和能量流，集成開發(fā)生物過程生理代謝特性先進檢測與分析裝備體系[1-3]，建立生物過程菌體生理特性微觀代謝機制研究[4-6]、基于計算流體力學(xué)與細胞反應(yīng)動力學(xué)整合的用于工業(yè)生物過程理性高效放大研究[7-8]、基于物質(zhì)能量耦合的復(fù)雜工業(yè)生物過程多目標(biāo)優(yōu)化算法[9-10]及全生命周期分析研究的新思路、新方法和新技術(shù)，其研究進展已走在世界前列，為我國由“生物制造”邁向“生物智造”提供強有力的保障。通過上述研究技術(shù)平臺，已在多個生物基化學(xué)品，特別是有機酸產(chǎn)品中實現(xiàn)了工業(yè)生物過程系統(tǒng)集成原理及新技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，并取得良好效果。接下來，將重點介紹有機酸產(chǎn)品，乳酸和葡萄糖酸鈉工業(yè)生物過程的系統(tǒng)集成優(yōu)化。

1 基于宏觀和微觀代謝分析的乳酸發(fā)酵全局優(yōu)化

乳酸是一種天然存在的有機酸，并成為世界三大有機酸之一。乳酸的用途非常廣泛，涉及食品、化妝品、醫(yī)藥、平臺化學(xué)品等行業(yè)。聚乳酸（PLA）是一種典型的生物基塑料，它具有良好的生物相容性和全降解能力，因此能在自然界中實現(xiàn)碳經(jīng)濟循環(huán)，從而成為理想的綠色高分子材料，這就對全球乳酸市場提出了更大的要求[11-13]。目前全球90%以上的商業(yè)乳酸通過發(fā)酵法來進行生產(chǎn)。

對于乳酸發(fā)酵過程而言，最常見發(fā)酵模式為分批發(fā)酵，過程中不斷補入中和劑將pH控制在合適范圍，直至發(fā)酵過程中葡萄糖完全耗盡。影響乳酸分批發(fā)酵生產(chǎn)效率的因素主要有廉價營養(yǎng)物質(zhì)的替代、中和劑的選擇以及過程供氧水平的調(diào)控。不同氮源及其濃度的選取是提高乳酸生產(chǎn)濃度的有效手段，而且通過合適的廉價氮源來替代昂貴的氮源是實現(xiàn)乳酸經(jīng)濟生產(chǎn)的重要途徑。目前的研究中廣泛地應(yīng)用食品廢棄物、玉米漿、豆粉等廉價氮源來替代酵母粉、蛋白胨、牛肉膏等昂貴氮源[14-15]。中和劑的補入能夠有效控制pH在合適的范圍內(nèi)，有利于微生物的生長和代謝，并降低乳酸以自由酸形式存在的含量，從而提高發(fā)酵效率。氫氧化鈣、氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀、碳酸鈣等都是乳酸發(fā)酵過程中最常使用的中和劑[16-19]。不同的中和劑對于乳酸發(fā)酵效率有著重要的影響，氫氧化鈣被普遍認為較氫氧化鈉和氫氧化銨更有利于菌體生長和生產(chǎn)，這一方面可能與氫氧化鈣補入后造成的滲透壓應(yīng)激較低有關(guān)，另一方面也可能與乳酸鈣作為微溶性物質(zhì)，可緩和發(fā)酵液離子應(yīng)激和自由酸應(yīng)激有關(guān)[20-21]。雖然乳酸生產(chǎn)菌多為兼性厭氧微生物，但是研究表明在乳酸發(fā)酵過程中，供氧水平的控制對其生長和代謝有顯著的影響[22]。高供氧能夠在一定程度上促進菌體生長和乳酸生產(chǎn)，但是往往會伴隨大量副產(chǎn)物的生成，因此控制過程中合適的供氧水平是實現(xiàn)高效生產(chǎn)的重要保證。需要指出的是，上述這些報道多側(cè)重于單輸入單輸出的宏觀研究模式，很少以細胞微觀和宏觀生理代謝特性為基礎(chǔ)來認識發(fā)酵過程的變化。

華東理工大學(xué)以潛在工業(yè)生產(chǎn)菌擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過程為研究對象，從微耗氧發(fā)酵中氧代謝表征與控制難、發(fā)酵效率低等實際工業(yè)問題出發(fā)，重點考察不同氧代謝水平和環(huán)境高滲應(yīng)激對細胞生長和代謝的影響，在全局認識相關(guān)生理特性和作用機制的基礎(chǔ)上，優(yōu)化整個發(fā)酵過程（圖1）。首先，通過過程尾氣質(zhì)譜儀，首次將生理參數(shù)氧攝取速率（OUR）引入到微耗氧發(fā)酵過程中用以定量表征細胞氧代謝水平，從而克服了過去僅依靠操作參數(shù)（轉(zhuǎn)速和通氣量）以及環(huán)境參數(shù)（溶氧DO和氧化還原電位ORP）在微耗氧發(fā)酵氧代謝水平表征應(yīng)用中的缺陷。同時通過宏觀生理代謝分析，結(jié)合微觀代謝物圖譜、代謝流計算、關(guān)鍵酶活性測定等技術(shù)，解析了發(fā)酵過程中氧代謝的作用機制（圖2），表明氧代謝水平在擬干酪乳桿菌生產(chǎn)乳酸過程中主要作用于丙酮酸節(jié)點，而且細胞在生長期和穩(wěn)定期分別主要通過乙酰輔酶A節(jié)點和乙偶姻節(jié)點來平衡胞內(nèi)還原力水平。此外，在上述氧代謝作用機制認識的基礎(chǔ)上，開發(fā)兩階段OUR控制策略，使得L-乳酸產(chǎn)率較全程恒定OUR工藝提高了12.7%[23]。其次，通過宏觀生理代謝特性和發(fā)酵液流變特性相結(jié)合的分析，首次發(fā)現(xiàn)中和劑作用于乳酸發(fā)酵的機制除生成產(chǎn)物造成的滲透壓差異以及離子應(yīng)激差異以外，還與不同中和劑發(fā)酵液影響氣泡大小分布以及氧傳遞速率有關(guān)[24]。最后，針對高糖乳酸發(fā)酵后期乳酸生產(chǎn)顯著抑制等問題，通過宏觀和微觀生理代謝特性以及過程工程控制分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后期環(huán)境高滲應(yīng)激是限制高糖濃度乳酸高效生產(chǎn)的主要因素，而且存在三個關(guān)鍵滲透壓水平影響細胞的生長和代謝。在此基礎(chǔ)上開發(fā)了以滲透壓保護劑和中和劑組合為基礎(chǔ)的過程調(diào)控策略，前者使得階段L-乳酸產(chǎn)率提高42.9%[25]，而后者更是能大大緩解發(fā)酵后期環(huán)境滲透應(yīng)激，從而縮短發(fā)酵時間一半以上，使得L-乳酸產(chǎn)率提高2.21倍[21]。

圖1 基于宏觀和微觀代謝分析的乳酸發(fā)酵全局優(yōu)化

圖2 擬干酪乳桿菌發(fā)酵乳酸過程中氧代謝作用機制

2 工業(yè)葡萄糖酸鈉生產(chǎn)過程的系統(tǒng)集成與優(yōu)化

葡萄糖酸鈉作為一種葡萄糖酸衍生類鹽類物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、清潔劑、建筑等行業(yè)中[26-28]。葡萄糖酸鈉的生產(chǎn)方法主要有三種：催化氧化法、酶法以及微生物發(fā)酵法[29-31]。目前工業(yè)中典型的葡萄糖酸鈉的生產(chǎn)方法是通過在黑曲霉深層發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖酸的過程中不斷加入中和劑NaOH來控制pH，從而在發(fā)酵液中形成葡萄糖酸鈉。

在黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖酸鈉過程中有兩個關(guān)鍵物質(zhì)：葡萄糖和氧氣。葡萄糖和氧氣都是葡萄糖酸生產(chǎn)的關(guān)鍵底物。每催化生成1mol的葡萄糖酸，就需要1mol葡萄糖和0.5mol氧氣。因此實時、在線獲取這兩種物質(zhì)的相關(guān)信息對整個發(fā)酵過程的優(yōu)化具有非常重要的意義。但是目前對于葡萄糖的檢測多為人工離線測定，這就對基于底物和產(chǎn)物濃度的過程調(diào)控策略提出了很大的挑戰(zhàn)。另一方面，發(fā)酵液中氧氣的梯度分布以及整個發(fā)酵設(shè)備的體積氧傳遞系數(shù)會顯著影響整個發(fā)酵的氧氣傳遞速率，從而作用于整個發(fā)酵過程效率。通氣和攪拌轉(zhuǎn)速作為影響氧氣傳遞速率的關(guān)鍵操作參數(shù)經(jīng)常被用于葡萄糖酸鈉發(fā)酵的過程控制，從而提高生產(chǎn)效率[32-34]。但是上述基于操作參數(shù)調(diào)控的發(fā)酵過程優(yōu)化有很大的局限性，往往受到反應(yīng)器設(shè)備、操作環(huán)境等因素的影響，因此在適用性上很難盡如人意。此外，利用黑曲霉發(fā)酵葡萄糖酸鈉是一個利用絲狀真菌發(fā)酵生產(chǎn)的過程。發(fā)酵過程氣液氧傳遞速率主要受以下四個方面影響：①發(fā)酵液以及菌體的物理化學(xué)性質(zhì)，如發(fā)酵液的黏度、發(fā)酵液中各化學(xué)物質(zhì)比例、菌體濃度與菌體形態(tài)等；②發(fā)酵罐的體積形狀，如發(fā)酵罐的直徑、高度、攪拌槳類型等；③發(fā)酵過程操作條件，如壓力、轉(zhuǎn)速、溫度、體積、pH等；④菌體耗氧速率，其影響發(fā)酵液中的DO，影響發(fā)酵液中的氧濃度差[35-36]。通常情況下，絲狀真菌生長從孢子萌發(fā)開始生成菌絲，菌絲之間相互纏繞會生成菌球，這使得絲狀真菌發(fā)酵過程的氧傳遞過程更為復(fù)雜。球狀菌形雖然能夠降低發(fā)酵液的黏度，有利于氣液傳質(zhì)，但是在菌球內(nèi)部，特別是中心區(qū)域由于菌絲過于密集，會導(dǎo)致營養(yǎng)以及氧氣擴散的困難，對發(fā)酵過程不利。而分散的菌絲雖然能夠使細胞與發(fā)酵液中各營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積增加，有利于傳氧[37]?？傮w來說，雖然發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉在理論上和技術(shù)上都取得了很大的進展，但是還是以單一模塊化的研究為主，同時針對工業(yè)葡萄糖酸鈉生產(chǎn)過程的認識仍較為淺顯，這也就進一步限制了實驗室技術(shù)向工業(yè)生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的應(yīng)用。

華東理工大學(xué)從先進傳感器實時在線檢測關(guān)鍵底物和產(chǎn)物出發(fā)，通過微觀代謝調(diào)控機制的研究，結(jié)合宏觀生理代特性和生物反應(yīng)器流場特性分析以及葡萄糖酸鈉發(fā)酵過程混合模型，建立基于生物過程物質(zhì)能量耦合原理的工業(yè)生物過程的實時監(jiān)控預(yù)報系統(tǒng)，并開發(fā)用于多目標(biāo)優(yōu)化的新算法，從而實現(xiàn)工業(yè)葡萄糖酸鈉發(fā)酵過程的系統(tǒng)集成與優(yōu)化（圖3）。首先，利用傅里葉變換中紅外光譜法結(jié)合衰減全反射（FT-MIR-ATR）分析技術(shù)，建立在線監(jiān)測黑曲霉發(fā)酵過程中底物葡萄糖與產(chǎn)物葡萄糖酸鈉濃度的方法[38]。此外，通過尾氣質(zhì)譜分析技術(shù)，實時在線檢測葡萄糖酸鈉發(fā)酵過程中關(guān)鍵生理參數(shù)OUR、二氧化碳釋放速率（CER）和呼吸商（RQ）。這些檢測技術(shù)的應(yīng)用都為進一步開發(fā)以在線參數(shù)為基礎(chǔ)的過程監(jiān)測提供了有力保障，并建立了以在線OUR、CER和RQ為基礎(chǔ)的實時發(fā)酵過程關(guān)鍵參數(shù)監(jiān)控的方法，成功實現(xiàn)了在線定量監(jiān)控葡萄糖酸鈉轉(zhuǎn)化率以及產(chǎn)率的目標(biāo)[39]。其次，在上述在線參數(shù)監(jiān)測的基礎(chǔ)上，通過在50L發(fā)酵罐中重現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)工藝，發(fā)現(xiàn)了工業(yè)發(fā)酵的限制性因素主要包括培養(yǎng)基營養(yǎng)過剩以及供氧水平的不足。針對上述問題，通過宏觀生理代謝特性分析以及微觀代謝通量分析，開發(fā)了階段性供氧新策略，從而使得分批發(fā)酵周期由34h縮短至19h，轉(zhuǎn)化率也明顯提升[40]。同時，以發(fā)酵過程菌體形態(tài)為切入點，在低菌濃發(fā)酵的條件下，控制分散狀菌絲并不會引起發(fā)酵液黏度的升高，但是能夠很大程度地提高發(fā)酵液中氧氣與菌絲體的接觸面積，從而提高整個發(fā)酵過程的供氧水平，促進生產(chǎn)效率，使得分批發(fā)酵周期由19h進一步縮短至15h[41]。再次，為了克服分批發(fā)酵過程菌體生長時間長、耗糖速率慢、輔助操作時間長等問題，通過開發(fā)帶放工藝，在分批發(fā)酵后期放掉部分發(fā)酵液，加入新鮮培養(yǎng)液，從而使得生產(chǎn)能力提高了一倍。在此基礎(chǔ)上，首次建立利用膜裝置截留菌絲體使其回流至發(fā)酵罐中進行連續(xù)發(fā)酵的新工藝以及利用陶瓷膜裝置建立細胞循環(huán)式膜反應(yīng)器系統(tǒng)，并通過計算流體力學(xué)技術(shù)比較了普通反應(yīng)器以及膜反應(yīng)器的流場變化，確定了膜裝置額外功率輸入對膜反應(yīng)器供氧水平的影響。此葡萄糖酸鈉連續(xù)發(fā)酵新工藝成功實現(xiàn)了發(fā)酵周期達到240h以上，生產(chǎn)速率較優(yōu)化后的分批發(fā)酵過程提高近3倍，轉(zhuǎn)化率進一步提高5.4%，生產(chǎn)能力是分批發(fā)酵4倍的目標(biāo)（圖4）[42]。同時山東福洋生物技術(shù)有限公司已經(jīng)形成了基于連續(xù)發(fā)酵的葡萄糖酸鈉發(fā)酵新工藝和新裝備，從而有效遏制了國外酶制劑公司在國內(nèi)推廣使用酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉時對于關(guān)鍵酶價格的控制和壟斷。最后，一方面面對工業(yè)生物過程高度復(fù)雜性、不確定性、多層次、非結(jié)構(gòu)化等特點，通過使用三層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對機理模型參數(shù)進行建模，同時使用改進的差分進化算法對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)進行優(yōu)化，從而獲得最優(yōu)的過程模型，然后與發(fā)酵過程機理模型進行融合，最后得到葡萄糖酸鈉發(fā)酵過程的混合模型。此過程混合模型可以很好地預(yù)測葡萄糖酸鈉發(fā)酵過程中葡萄糖、葡萄糖酸鈉以及菌體的濃度，因此可以作為葡萄糖酸鈉發(fā)酵過程基礎(chǔ)模型對過程進行控制、優(yōu)化以及監(jiān)控。另一方面，工業(yè)生物過程多目標(biāo)優(yōu)化問題復(fù)雜程度、過程特性各不相同，為了提高工業(yè)生物過程多目標(biāo)優(yōu)化算法的搜索效率和全局優(yōu)化概率，通過提出參數(shù)自適應(yīng)的多目標(biāo)差分進化算法以及在此基礎(chǔ)上進一步開發(fā)的變異策略和參數(shù)共同自適應(yīng)的多目標(biāo)差分進化算法，并將其應(yīng)用于葡萄糖酸鈉生產(chǎn)過程多目標(biāo)優(yōu)化，結(jié)果表明兩種算法優(yōu)化條件下的葡萄糖酸鈉產(chǎn)量與試驗結(jié)果非常接近，進一步顯示了其在工業(yè)生物過程中應(yīng)用的潛力[43-45]。

圖3 工業(yè)葡萄糖酸鈉生產(chǎn)過程的系統(tǒng)集成與優(yōu)化

圖4 不同生產(chǎn)模式下葡萄糖酸鈉生產(chǎn)能力

3 總結(jié)與展望

工業(yè)生物過程系統(tǒng)集成研究中表現(xiàn)出時空變化特性及菌種細胞與環(huán)境非孤立系統(tǒng)的過程特征，如何解決包括生命科學(xué)在內(nèi)的高度分支研究與全局優(yōu)化的矛盾，在海量數(shù)據(jù)中尋找過程集成的關(guān)鍵參數(shù)是實現(xiàn)生物過程全局優(yōu)化的重點。目前，針對工業(yè)生物過程先進在線傳感技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用、微生物發(fā)酵過程中細胞微觀代謝特性研究，基于流場與微生物細胞生理特性結(jié)合的放大新策略開發(fā)，基于物質(zhì)能量耦合的復(fù)雜工業(yè)生物過程多目標(biāo)優(yōu)化算法及全生命周期分析方面，均建立了相應(yīng)的關(guān)鍵技術(shù)平臺，并且已經(jīng)在一部分有機酸產(chǎn)品實現(xiàn)了系統(tǒng)集成原理應(yīng)用和技術(shù)開發(fā)，后續(xù)有望將其進一步擴展至其他產(chǎn)品，從而實現(xiàn)生物基化學(xué)品工業(yè)生產(chǎn)的過程系統(tǒng)集成。

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Application of systematic integration of industrial bioprocess on organic aicd production

TIAN Xiwei1，2，LU Fei1，2，QIAN Jiangchao1，2，ZHUANG Yingping1，2，XIA Jianye1，2，CHU Ju1，2
1.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science Technology, Shanghai 200237, China 2.National Center of Bio-engineering amp; technology, East China University of Science Technology, Shanghai 200237, China

Biomass-based chemicals attract more and more attentions on human society, economy and environment. The industrial bioprocess is an integrated system of a highly complex life system and a large-scale engineering system, thus achieving systematic integration of industrial bioprocess plays an important role on improving production ef fi ciency and resource ultilization, as well as reduing energy consumption and waste discharge. This review summarized current threoy,method and technology of systematic integration of industrial bioprocess, then the applications on industrial lactate and sodium gluconate production were highlighted.

Industrial bioprocess; systematic integration; lactate; sodium gluconate

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.06.011

莊英萍，博士，研究員，博導(dǎo)，教授?，F(xiàn)任華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院院長，國家生化工程技術(shù)研究中心（上海）主任，“863”生物和醫(yī)藥領(lǐng)域工業(yè)生物技術(shù)主題專家，中國微生物學(xué)會第十屆理事會常務(wù)理事，生化過程模型化與控制專業(yè)委員會主任委員，上海市微生物學(xué)會副理事長。長期來主要從事發(fā)酵過程的優(yōu)化與放大研究，在生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室和工程中心研究團隊中，形成了圍繞生物過程優(yōu)化與放大的理論、方法與裝備，包括發(fā)酵過程生理狀態(tài)參數(shù)在線多尺度相關(guān)分析、微觀與宏觀相結(jié)合優(yōu)化、生理代謝特性與流程特性相結(jié)合的放大等關(guān)鍵技術(shù)，并在數(shù)十個品種的工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)品中成功應(yīng)用。近年獲國家科技進步二等獎3項、發(fā)表SCI論文90余篇，獲授權(quán)發(fā)明專利26項。E-mail：ypzhuang@ecust.edu.cn

田錫煒，男，博士后。主要從事過程組學(xué)方法調(diào)控和優(yōu)化微生物發(fā)酵生產(chǎn)有機酸、氨基酸和抗生素的研究，以第一作者或共同作者在SCI期刊發(fā)表論文14篇。E-mail：xiweitian@ecust.edu.cn

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）項目“工業(yè)生物過程系統(tǒng)集成原理”（2013CB733605）