生物原料高效轉(zhuǎn)化機制以及調(diào)控規(guī)律研究進展

崔佳琦，元英進，李炳志，張大偉，劉春朝，聞建平

1.天津大學化工學院，天津 300350 2.中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308 3.中國科學院過程工程研究所，北京 100190

生物原料高效轉(zhuǎn)化機制以及調(diào)控規(guī)律研究進展

崔佳琦1，元英進1，李炳志1，張大偉2，劉春朝3，聞建平1

1.天津大學化工學院，天津 300350 2.中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308 3.中國科學院過程工程研究所，北京 100190

非糧原料預(yù)處理過程易產(chǎn)生對發(fā)酵微生物有毒害作用的副產(chǎn)物，其對微生物生長以及目標產(chǎn)物的生產(chǎn)均產(chǎn)生顯著抑制作用。從“生物原料高效轉(zhuǎn)化過程中微生物對抑制物‘應(yīng)激’機制”、“生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化過程調(diào)控體系構(gòu)建”以及“多菌群混合培養(yǎng)過程細胞群體協(xié)同效應(yīng)及調(diào)控機制”三個方面出發(fā)，揭示微生物對生物原料高效轉(zhuǎn)化機制以及調(diào)控規(guī)律，為理性調(diào)控以及構(gòu)建生物原料高效轉(zhuǎn)化體系提供依據(jù)。

生物原料；耐受機制；高效轉(zhuǎn)化；調(diào)控規(guī)律；混菌培養(yǎng)

近年來，以非糧等生物質(zhì)為原料生產(chǎn)潛力巨大、環(huán)境友好的可再生新能源已成為各國學者研究的重點之一。但非糧原料生物利用卻遠遠沒有達到人們的要求，若能將其高效地轉(zhuǎn)化為可利用的能源、食品和化學原料，將會對人類社會的可持續(xù)性發(fā)展起到重要的作用[1]。

目前，非糧原料糖化主要是預(yù)處理和水解，但是在此過程中會產(chǎn)生很多對發(fā)酵微生物有毒害作用的副產(chǎn)物，主要包括呋喃類、酚類及弱酸類化合物等。這些抑制劑會抑制發(fā)酵過程中微生物的生長速率、生物量以及目標產(chǎn)物的產(chǎn)量和產(chǎn)率，對細胞的毒害作用是非常復雜的，具有多層次、多靶點的特征[2-3]。為了消除抑制劑對微生物脅迫作用以及提高非糧原料高效利用，本文首先從生物原料高效轉(zhuǎn)化過程中微生物對抑制物“應(yīng)激”機制出發(fā)，闡述利用多組學方法揭示微生物對抑制劑“應(yīng)激”機制；其次，為提高微生物對底物轉(zhuǎn)化效率，提出構(gòu)建生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化過程調(diào)控體系的方法；最后，敘述采用新型培養(yǎng)策略——多菌群混合培養(yǎng)提高微生物對底物的利用，提高相應(yīng)代謝產(chǎn)物量，并結(jié)合多組學方法揭示細胞群體如何產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)及解析調(diào)控機制。通過對上述三個方面的簡要介紹，旨在為其他研究人員在探索以及解析微生物生物原料轉(zhuǎn)化機制以及調(diào)控規(guī)律方面提供參考與借鑒。

1 生物原料高效轉(zhuǎn)化過程中微生物對抑制物“應(yīng)激”機制

為了解決生物原料低效率轉(zhuǎn)化問題，需先明確生物原料高效轉(zhuǎn)化過程中微生物對抑制物“應(yīng)激”機制。以下著重介紹微生物耐受抑制劑脅迫機制。

1.1 代謝組學解析抑制劑脅迫下微生物“應(yīng)激”機制

通過向米根霉產(chǎn)富馬酸發(fā)酵液中添加不同濃度糠醛，研究其對米根霉產(chǎn)富馬酸以及米根霉代謝產(chǎn)物的影響。文獻報道[4]表明：發(fā)酵起始添加糠醛時，1.0g/L的糠醛對米根霉菌株生長影響較小，但嚴重影響富馬酸的產(chǎn)量；8h添加糠醛時，其對米根霉毒害作用顯著，富馬酸生成基本停止；通過分析不同濃度糠醛脅迫下米根霉代謝輪廓可知，米根霉生長旺盛時添加糠醛，米根霉胞內(nèi)代謝嚴重紊亂，木糖代謝嚴重受阻以及有氧呼吸被抑制，導致細胞生長以及富馬酸產(chǎn)量受到嚴重抑制；同時，也發(fā)現(xiàn)磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇等多不飽和脂肪酸代謝途徑有可能有利于米根霉細胞對糠醛的適應(yīng)性；基于上述組學分析結(jié)果，分別在250mL搖瓶發(fā)酵中外源添加2.4mg卵磷脂、5.4mg肌醇和24μL大豆油，經(jīng)過92h、35℃發(fā)酵，富馬酸產(chǎn)量由5.78g/L分別提高到10.03g/L、10.05g/L和12.13g/L，增幅分別為73.5%、73.8%和110%，驗證了上述組學分析的正確性。

1.2 代謝組學解析微生物耐受抑制劑相關(guān)途徑以及靶點

通過建立微生物對抑制劑高效耐受馴化策略，并結(jié)合代謝組學方法研究釀酒酵母對抑制劑耐受性相關(guān)途徑以及靶點。釀酒酵母與耐受性相關(guān)代謝物主要包括谷氨酸、5-氧脯氨酸、鳥氨酸、脯氨酸、賴氨酸、甘氨酸、肌醇等，上述代謝物主要分布在脯氨酸合成代謝途徑和肌醇代謝途徑中；同時，通過單敲除釀酒酵母脯氨酸代謝關(guān)鍵基因PRO1、PRO2和肌醇合成關(guān)鍵基因INO1和INM2，可顯著降低菌株對抑制劑的耐受能力；通過外部添加肌醇和脯氨酸，可顯著提升菌株對抑制劑的耐受能力，因而確定脯氨酸和肌醇代謝能夠增強釀酒酵母抑制劑耐受性[5]。

1.3 比較代謝組學解析“壓力大分子”作用下微生物應(yīng)激效應(yīng)

通過向木糖發(fā)酵菌424A（LNH-ST）插入木糖還原酶基因（XR）、木糖醇脫氫酶（XDH）基因以及過表達木酮糖激酶基因（XK），結(jié)合比較代謝組學技術(shù)闡明不同來源抑制因子的作用機制以及解析細胞“壓力大分子”作用下的應(yīng)激效應(yīng)。木糖發(fā)酵菌株中大量積累木糖，表明木糖的吸收不是限制抑制劑環(huán)境下菌株木糖代謝的關(guān)鍵因素。而多元醇木糖醇、甘油和半乳糖醇的含量下降暗示了木糖的分解代謝能力受到抑制，從而限制了木糖利用。同時，木糖代謝階段，木糖發(fā)酵菌株中脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸和谷氨酸的含量顯著下降，而甘露醇大量積累[6]。

1.4 多組學結(jié)合解析抑制劑脅迫下微生物高效轉(zhuǎn)化耦合機制

通過構(gòu)建釀酒酵母對抑制劑耐受能力快速提升馴化策略，并結(jié)合多組學分析方法對響應(yīng)底物抑制性的信號分子進行結(jié)構(gòu)與功能鑒定和定量分析，從微觀水平為生物原料高效轉(zhuǎn)化提供耦合機制。通過建立的快速抑制劑耐受馴化策略，菌株對復合抑制劑耐受能力明顯提升，發(fā)酵周期由141h縮短到21h；利用GC-TOF對微生物馴化過程中的代謝物響應(yīng)進行了定量研究，發(fā)現(xiàn)參與糖酵解途徑的代謝物變化顯著，由糖酵解途徑代謝物衍生的氨基酸在馴化中含量上調(diào)，由三羧酸循環(huán)代謝物衍生的氨基酸在馴化中含量明顯下調(diào)；利用蛋白組學技術(shù)對馴化過程的菌株蛋白變化進行了定量研究，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)最顯著的蛋白的功能類別為細胞代謝、能量、蛋白質(zhì)合成和細胞壓力響應(yīng)；同時，釀酒酵母菌株在抑制劑刺激下，增強了葡萄糖代謝中的糖酵解途徑、乙醇合成途徑以及磷酸無糖途徑，抑制了乙酸和甘油合成途徑[7-8]。

2 生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化過程調(diào)控體系構(gòu)建

構(gòu)建生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化過程調(diào)控體系，是生物質(zhì)原料高效轉(zhuǎn)化的主要部分。深度解析生物產(chǎn)品中的復雜相互聯(lián)系的代謝和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，重新分配生物合成網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點的代謝流和理性補料策略開發(fā)等，對生物基化學品發(fā)展中生物質(zhì)高效利用、產(chǎn)物高效生產(chǎn)及其調(diào)控有著重要的意義。以下著重介紹構(gòu)建生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化過程調(diào)控體系的幾類方法。

2.1 理性提高微生物相關(guān)代謝產(chǎn)物量

① 通過構(gòu)建基因組尺度動態(tài)代謝網(wǎng)絡(luò)模型（GSDFBA）并偶聯(lián)MOMA算法，GS-MDFBA成功鑒定出三類能夠顯著提升FK506產(chǎn)量的靶點。其中HTΔgcdh-tktB/msdh/ask菌株的FK506產(chǎn)量最高，達到（126.61 ± 4.66）mg/L，較原始菌株提升了1.29倍[9]；通過利用GC-MS、LC-MS等研究手段動態(tài)對比菌體在兩種不同培養(yǎng)條件下不同的代謝狀態(tài)及FK506合成水平，并結(jié)合理性補料策略，F(xiàn)K506產(chǎn)量由251mg/L提高到405mg/L[10]。

② 通過13C平行標記實驗、基元模式分析以及Flux Design算法預(yù)測了提高子囊霉素產(chǎn)量的靶基因。采用組合基因操作方法：在敲除pyc基因的基礎(chǔ)上進一步擴增fkbO基因，獲得了工程菌株TD-ΔpycfkbO，在優(yōu)化發(fā)酵條件下，子囊霉素最終產(chǎn)量達到610 mg/L[11]。

③ 通過構(gòu)建合成L-苯丙氨酸的E. coli HD-1，并結(jié)合在體外粗酶基礎(chǔ)上滴加純酶得出單個酶絕對濃度的方法，從而構(gòu)建得到簡單、有效的體外多酶反應(yīng)體系，通過在出發(fā)菌株中過表達AroA，L-苯丙氨酸產(chǎn)量在48 h達到了62.47g/L[12]。

2.2 系統(tǒng)代謝工程理性調(diào)控微生物產(chǎn)異丁醇產(chǎn)量

圍繞“還原力代謝角度的基因組尺度模型-預(yù)測靶點—實驗驗證”的系統(tǒng)代謝工程改造策略，研究通過調(diào)控生物轉(zhuǎn)化過程中關(guān)鍵基因以及調(diào)控因子對微生物產(chǎn)相關(guān)代謝產(chǎn)物的影響。通過基因組尺度網(wǎng)絡(luò)模型，聯(lián)合代謝通量平衡分析方法和最小代謝調(diào)控分析方法，模擬預(yù)測得出還原力調(diào)節(jié)靶點——甘油醛-3-磷酸到1，3-二磷酸甘油酸的代謝反應(yīng)；利用異源gapN通路，并采用5個不同強度的人工組成型啟動子精細調(diào)控該通路NADPH合成，在最強啟動子BBa_J23100調(diào)控下獲得最佳異丁醇合成菌株LA09，其胞內(nèi)NADPH/NADP比值在對數(shù)生長期和穩(wěn)定生長期分別提高到0.67和0.64，還原力調(diào)節(jié)驅(qū)動代謝流再分配，使乙醇和乳酸產(chǎn)量下降至1.32g/L和6.08g/L，分別比出發(fā)菌株LA02降低了17.5%和51.7%，而異丁醇產(chǎn)量得以提高了2.21倍至8.68g/L[13]。

2.3 正調(diào)控LysR家族調(diào)控因子FkbR1及其靶基因提高FK520產(chǎn)量

通過正調(diào)控LysR家族調(diào)控因子FkbR1以及靶基因手段，對生物轉(zhuǎn)化過程中關(guān)鍵調(diào)控因子進行改造，增強關(guān)鍵基因以及蛋白/酶表達水平，進而提高FK520產(chǎn)量。試驗結(jié)果表明fkbR1基因敲除菌株DfkbR1中FK520產(chǎn)量比出發(fā)菌株FS35降低了67.5%；fkbR1基因過表達菌株OfkbR1中FK520產(chǎn)量達到了421.7mg/L，比FS35提高了33.5%；通過RT-PCR分析FK520的合成基因，fkbE、fkbF、fkbS、fkbU在OfkbR1菌株的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，在DfkbR1菌株中下調(diào)，因此FkbR1正調(diào)控fkbE、fkbF、fkbS、fkbU的表達。下一步通過體外EMSA分析和體內(nèi)ChIP分析，確定了調(diào)控因子FkbR1直接結(jié)合fkbE和fkbF的啟動子，確定fkbE靶基因，由此可以得出調(diào)控因子FkbR1直接調(diào)控靶基因fkbE的轉(zhuǎn)錄。在此理性指導下，通過基因工程手段研究靶基因fkbE對FK520產(chǎn)量的影響，靶基因fkbE對FK520合成起著重要作用，且其參與乙基丙二酰輔酶A的合成，在FK520合成中具有關(guān)鍵作用[14]。

2.4 理性調(diào)控策略實現(xiàn)底物利用最大化、殘?zhí)亲钚』?/h3>

通過不同強度啟動子理性調(diào)控釀酒酵母異源木糖吸收模塊表達強度，以研究微生物對木糖利用最大化、殘?zhí)菨舛茸钚』膯栴}。文獻報道[15]表明：通過以釀酒酵母密碼子偏好為準的基因序列調(diào)控優(yōu)化，構(gòu)建獲得異源木糖吸收模塊，并采用不同強度正向調(diào)控啟動子優(yōu)化了異源木糖吸收模塊表達強度，進而增加木糖的吸收利用，進一步強化釀酒酵母宿主中磷酸戊糖途徑的多個關(guān)鍵基因表達；同時，輔以不同強度適應(yīng)性馴化手段，增強菌株對代謝底物的適應(yīng)以及利用能力，以達到菌株對底物中糖類物質(zhì)的高效利用，實現(xiàn)了底物利用最大化、殘?zhí)亲钚』?，達到了木糖高效代謝之目的。

3 多菌群混合培養(yǎng)過程細胞群體協(xié)同效應(yīng)及調(diào)控機制

能源和環(huán)境危機越來越受到各國政府的重視，因此可再生能源和循環(huán)經(jīng)濟成為各國政府工作的重要內(nèi)容。近年來，多菌群混合培養(yǎng)被廣泛應(yīng)用于能源、醫(yī)藥等領(lǐng)域產(chǎn)品生成過程中，并取到了豐碩的研究成果。以下著重介紹混菌培養(yǎng)過程細胞群體協(xié)同效應(yīng)及調(diào)控機制。

3.1 解析混菌培養(yǎng)進化對生產(chǎn)能力影響機制

通過構(gòu)建混菌培養(yǎng)體系，并結(jié)合代謝組學、蛋白質(zhì)學方法研究混菌培養(yǎng)進化對生產(chǎn)能力影響的機理 。文獻報道[16-18]表明：酮古龍酸桿菌和蠟狀芽孢桿菌共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)混菌體系在適應(yīng)性進化過程中通過協(xié)同作用快速進化達到穩(wěn)定狀態(tài)；同時，發(fā)現(xiàn)混菌培養(yǎng)的協(xié)同作用對單菌影響顯著，單菌的生長能力顯著增強，對培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)能力增強；小菌的產(chǎn)酸能力有明顯增強，而大菌的產(chǎn)孢能力減弱；利用代謝組學建立代謝物傳遞和代謝模型，發(fā)現(xiàn)大小菌的混合菌群培養(yǎng)的協(xié)同作用主要通過三個階段完成：①營養(yǎng)的搜索和攝入，大菌的蛋白合成增加；②小菌的蛋白降解和氨基酸轉(zhuǎn)運能力增強；③大菌提供小菌更多氨基酸和嘌呤增強小菌的氧化和能量再生。同時，利用蛋白質(zhì)組學建立大小菌相互作用模型，揭示了增強混菌產(chǎn)2-酮古龍酸增加的原因：①大菌產(chǎn)孢相關(guān)蛋白降低；②大菌多肽轉(zhuǎn)運蛋白增強；③小菌氨基酸合成能力增強。

3.2 混菌培養(yǎng)揭示底物與終產(chǎn)物調(diào)控變化規(guī)律

通過對釀酒酵母木糖代謝模塊進行調(diào)控，研究混菌培養(yǎng)發(fā)酵體系提高乙醇產(chǎn)量，降低葡萄糖和木糖殘留的變化規(guī)律。通過建立混菌培養(yǎng)發(fā)酵體系，包含了兩種釀酒酵母：一種是含有木糖代謝調(diào)控模塊的釀酒酵母（SyBE005，其通過基因工程手段進行不同強度正向調(diào)控啟動子優(yōu)化，增加釀酒酵母異源木糖吸收模塊表達強度，增強釀酒酵母對木糖的吸收利用），另一種是耐受抑制劑能力較強的釀酒酵母[19]。利用這種新型的混菌體系，按照1∶1的接種比例，總共7.5 g/L接種量進行同步糖化共發(fā)酵。葡萄糖在0～12h被迅速消耗利用轉(zhuǎn)化成乙醇，并一直保持在低濃度水平（低于5g/L），而木糖的利用并沒有顯著的提升（剩余的木糖濃度為15.8g/L），這表明在混菌體系中葡萄糖的利用得到了很大的提升，乙醇的濃度也從41.2g/L提升到了54.0g/L；為了進一步降低發(fā)酵體系中木糖的殘留，調(diào)節(jié)了混菌體系中兩菌的接種比例，木糖利用菌與抑制劑耐受菌接種比例為10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5和1∶10時，發(fā)酵體系中殘余的木糖濃度分別為10.2g/L、10.1g/L、12.1g/L、15.8g/L、18.2g/L、20.8g/L和22.7g/L。從上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當糖利用菌與抑制劑耐受菌接種比例為10∶1時獲得了最佳發(fā)酵效果，此時木糖殘余僅10.2g/L，發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇濃度達到57.9g/L，相比于單菌發(fā)酵體系，乙醇濃度提高了16.1g/L[19]。

3.3 混菌培養(yǎng)揭示細胞群協(xié)同生長效應(yīng)

通過建立熱纖梭菌與嗜熱解糖梭菌混菌共培養(yǎng)體系，研究混菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)氫氣和有機酸過程中混菌協(xié)同生長效應(yīng)。熱纖梭菌7072與嗜熱解糖梭菌869共培養(yǎng)促進產(chǎn)氫，當嗜熱解糖梭菌869與熱纖梭菌7072的接種比例為0.25∶1時，氫氣產(chǎn)量達到61.97mL/g玉米秸稈，優(yōu)于單培養(yǎng)；通過胞外底物成分分析，可知共培養(yǎng)促進了玉米秸稈中纖維素和半纖維素的利用，這主要是熱纖梭菌生長過程中形成的復合纖維素酶系，能夠?qū)⒔斩捴械牟糠掷w維素和半纖維素水解成為單糖或糊精，有利于共培養(yǎng)產(chǎn)氫過程；胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物分析，可知共培養(yǎng)體系中嗜熱解糖梭菌的接種比例增加時，發(fā)酵液中丁酸的生成量迅速增加，而乙醇和乙酸的濃度稍有降低，并且在所有接種比例的共培養(yǎng)發(fā)酵液中均沒有檢測到乳酸，乙醇生成量的降低和乳酸的消失是嗜熱厭氧梭菌共培養(yǎng)氫氣產(chǎn)量提高的主要原因[20]。

4 展 望

基于上述機理以及機制，未來主要工作將圍繞：①利用已闡明的微生物耐受抑制劑脅迫機制，通過理性構(gòu)建或修飾微生物相應(yīng)代謝途徑增強其對抑制劑耐受能力，達到微生物高效利用非糧原料之目的；②將構(gòu)建生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化過程調(diào)控體系方法，廣泛應(yīng)用于工業(yè)微生物高產(chǎn)相應(yīng)代謝產(chǎn)物過程中，驗證其方法是否具有高效性以及普適性；③根據(jù)已有的混菌培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)建原理以及機制，將其廣泛應(yīng)用于能源、醫(yī)藥以及化工原料生產(chǎn)過程中，以到達原料低投入、產(chǎn)物高產(chǎn)出之目的。

Efficient transformation mechanism and regulation for biofeeds: a review

CUI Jiaqi1，YUAN Yingjin1，LI Bingzhi1，ZHANG Dawei2，LIU Chunchao3，WEN Jianping1
1. School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300350, China 2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China 3. Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China

The pretreatment process of non-grain raw materials can produce byproducts that have harmful effects on microorganisms. Byproducts also have a signi fi cant inhibitory effect on microbial growth and target product production.This paper aims to state the stress mechanism of microorganisms in the process of high efficiency transformation for biofeeds, the way to construct the regulation system in the biomass ef fi cient conversion process and the synergistic effect and regulation mechanism in the co-culture, which reveal the efficient transformation mechanism and regulation for biofeeds, aiming to provide basis for rational regulation and construction high ef fi ciency conversion system to utilize the biofeeds.

biofeeds; tolerance mechanism; ef fi cient transformation; regulation; co-culture

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.06.008

聞建平，教授，研究方向：生物反應(yīng)工程。2004 年，獲得首屆“教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”資助。在Biotechnology for Biofuels、Biotechnology and Bioengineering、Bioresource Technology等國際期刊發(fā)表SCI論文100 多篇。E-mail：jpwen@ tju.edu.cn

崔佳琦，博士研究生，研究方向：生物反應(yīng)工程。E-mail：cuijiaqi2015@126.com

工業(yè)生物過程高效轉(zhuǎn)化與系統(tǒng)集成的科學基礎(chǔ)研究（2013CB733600）；生物原料高效轉(zhuǎn)化機制與調(diào)控規(guī)律（2013CB733601）