水飛薊素抑制草魚肝細胞脂質(zhì)蓄積的作用及其機制研究

蕭培珍 吉 紅 張寶彤 葉元土 孫 健 楊 洲 李雪賢 田晶晶

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院, 楊陵 712100; 2. 北京市營養(yǎng)源研究所水產(chǎn)動物系統(tǒng)營養(yǎng)研究開放實驗室, 北京 100069;3. 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 蘇州 215123)

水飛薊素抑制草魚肝細胞脂質(zhì)蓄積的作用及其機制研究

蕭培珍1吉 紅1張寶彤2葉元土3孫 健1楊 洲1李雪賢1田晶晶1

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院, 楊陵 712100; 2. 北京市營養(yǎng)源研究所水產(chǎn)動物系統(tǒng)營養(yǎng)研究開放實驗室, 北京 100069;3. 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 蘇州 215123)

為探究水飛薊素(Silymarin)對草魚肝細胞脂質(zhì)蓄積的作用及其機理, 體外培養(yǎng)草魚肝細胞, 在用400 μmol/L油酸對其進行蓄脂誘導(dǎo)的同時, 采用不同質(zhì)量濃度的水飛薊素處理24h, 檢測了肝細胞活力、脂質(zhì)蓄積狀況、抗氧化指標和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達狀況。結(jié)果顯示, 水飛薊素質(zhì)量濃度在75—125 μg/mL對草魚肝細胞活力無影響(P＞0.05); 與單獨采用油酸進行蓄脂誘導(dǎo)的油酸組比較, 水飛薊素和油酸共同處理的水飛薊素組中, 隨著水飛薊素質(zhì)量濃度的增加, 肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)含量逐漸降低, 且水飛薊素質(zhì)量濃度在100—150 μg/mL時的肝細胞脂質(zhì)蓄積水平顯著降低(P＜0.05); 與油酸組相比, 100 μg/mL水飛薊素處理組的脂質(zhì)含量以時間依賴性的模式顯著降低(P＜0.05), 還原型谷胱甘肽含量顯著升高(P＜0.05), 脂肪酸合成酶和硬脂酰輔酶A去飽和酶1的mRNA表達量顯著下調(diào)(P＜0.05)。研究表明, 水飛薊素能夠抑制草魚肝細胞脂質(zhì)蓄積, 其作用可能與其抑制脂質(zhì)合成基因的表達有關(guān); 同時, 水飛薊素可能通過提高肝細胞的抗氧化能力發(fā)揮保護肝細胞的作用。

水飛薊素; 脂質(zhì)蓄積; 肝細胞; 草魚; 油酸

飼料油脂不僅能夠為魚體提供能量, 而且是養(yǎng)殖魚類必需脂肪酸的重要來源[1]。研究表明, 提高飼料中脂肪水平能夠節(jié)約蛋白質(zhì), 提高魚體生長性能, 這已成為當前水產(chǎn)飼料配方技術(shù)發(fā)展的主要方向之一[2,3]。然而, 過量的脂肪攝入, 會抑制養(yǎng)殖對象生長, 引發(fā)脂質(zhì)在魚體組織如肝胰臟和腹腔脂肪組織中的過度蓄積, 進而引起魚類出現(xiàn)高脂血癥、脂肪肝和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等癥狀[4—8]。由于飼料能量攝入過多或營養(yǎng)素不平衡導(dǎo)致肝細胞內(nèi)脂質(zhì)過度蓄積, 引起肝細胞脂肪變, 稱為魚類營養(yǎng)性脂肪肝[9]。當前幾乎所有的主要養(yǎng)殖魚類均有發(fā)生脂肪肝的報道, 脂肪肝不僅造成魚體對攝入能量的浪費,而且嚴重威脅著魚類健康[10,11]。因此, 預(yù)防養(yǎng)殖魚類脂肪肝的發(fā)生, 對提高魚類生產(chǎn)性能、改善魚類健康狀況具有重要意義。

水飛薊素(Silymarin)是一種黃酮類植物提取物, 從紫花水飛薊(Silybum marianumL.)的干燥果實中提取, 主要由4種黃酮類化合物組成, 包含水飛薊賓A和B (Silibinin A and B)、異水飛薊素賓A和B(Isosilibinin A and B)、水飛薊亭(Silychristin)、水飛薊寧(Silydianin)[12,13]。在哺乳動物上, 水飛薊素具有保護肝臟、抗氧化、抗炎、抗癌等作用[14—16]。在魚類上, 水飛薊素能夠修復(fù)CCl4誘導(dǎo)的鯉肝損傷[17], 降低虹鱒血漿膽固醇含量[18], 抑制斑馬魚的脂質(zhì)蓄積[19]。本研究室前期研究發(fā)現(xiàn), 水飛薊素能夠降低高脂日糧誘導(dǎo)的草魚肝臟脂質(zhì)含量的增加[20]。

草魚(Ctenopharyngodon idellus)屬于草食性魚類, 是我國主要的淡水養(yǎng)殖品種之一, 2015年總產(chǎn)量為5.68×109kg, 占全國淡水魚總產(chǎn)量的20.91%(中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒, 2016)。有學(xué)者指出, 草魚對飼料脂肪的利用能力較低[4,21]。然而, 在實際生產(chǎn)中, 草魚飼料脂質(zhì)水平越來越高, 導(dǎo)致魚體脂肪肝現(xiàn)象頻繁發(fā)生。研究報道, 過量的游離脂肪酸攝入引起肝臟脂質(zhì)過度蓄積, 導(dǎo)致肝細胞出現(xiàn)脂肪變性, 同時過量的游離脂肪酸也是產(chǎn)生脂毒性的重要介質(zhì), 引起細胞受損[22]。因此, 研究草魚脂肪肝防控技術(shù)具有重要的理論和應(yīng)用上的意義。目前, 關(guān)于水飛薊素降脂作用的研究有一些報道[19,23—25], 但評價手段較為單一。在哺乳動物上, 有學(xué)者通過構(gòu)建細胞離體培養(yǎng)體系, 采用游離脂肪酸誘導(dǎo)建立脂肪肝細胞模型, 對一些功能性成分進行篩選[26—30], 在魚類上,杜金梁等[31]用油酸構(gòu)建了建鯉原代脂肪肝細胞損傷模型, 并獲得了澤瀉提取物對油酸誘導(dǎo)的脂肪肝具有保護作用, 而有關(guān)就水飛薊素作用離體評價的研究還未見報道。因此, 本研究采用油酸與水飛薊素共同處理草魚肝細胞的技術(shù)路線, 探討水飛薊素對草魚肝細胞脂質(zhì)蓄積的作用和分子機制, 為養(yǎng)殖魚類脂肪肝的防治和功能性飼料添加劑的開發(fā)提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

M199培養(yǎng)基、胎牛血清和無脂肪酸牛血清白蛋白購自Gibco公司, 水飛薊素、油紅O、MTT和油酸均購自Sigma公司, 二甲亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)、碳酸氫鈉、無水乙醇等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 草魚肝細胞的培養(yǎng)

草魚肝細胞(L8824)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)。將肝細胞置于10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液中, 并于28℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液, 待細胞生長至匯合后, 用于試驗。

1.3 油酸溶液和水飛薊素溶液的配制

油酸用無水乙醇配制成100 mmol/L貯存液, 保存于–20℃, 使用前用2%無脂肪酸牛血清白蛋白的M199培養(yǎng)基將油酸稀釋成10 mmol/L儲備液。之后用10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液配置成400 μmol/L油酸溶液待用。

水飛薊素用DMSO溶液配制成10 mg/mL貯存液, 保存于–20℃, 使用前用10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液配制成不同質(zhì)量濃度(5、25、50、75、100、125、150和200 μg/mL, 簡寫為SM5、25、50、75、100、125、150和200)的水飛薊素工作液待用。

1.4 試驗處理

根據(jù)本實驗室前期研究成果, 選用400 μmol/L油酸處理草魚肝細胞, 作為誘導(dǎo)肝細胞脂肪化的濃度[32]。

試驗組別設(shè)為對照組、油酸組和水飛薊素處理組。其中: 對照組為不經(jīng)任何處理的, 用10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)肝細胞24h, 為正常肝細胞組(Control); 油酸組(OA組)為用含400 μmol/L油酸的培養(yǎng)液培養(yǎng)肝細胞24h; 水飛薊素處理組(SM組)為用含有400 μmol/L油酸并同時添加不同質(zhì)量濃度的水飛薊素的培養(yǎng)液培養(yǎng)肝細胞24h。

1.5 MTT法評估水飛薊素對肝細胞活力的影響

采用MTT法, 分別評估了不同質(zhì)量濃度水飛薊素對未加油酸和同時添加油酸的草魚肝細胞活力的影響。具體操作如下:

(1) 將草魚肝細胞均勻接種于96孔板(150 μL/孔), 28℃, 5% CO2培養(yǎng)24h。之后, 更換為含有不同質(zhì)量濃度(5、25、50、100和200 μg/mL)水飛薊素的培養(yǎng)液培養(yǎng)肝細胞24h, 然后MTT法評估水飛薊素對未加油酸的肝細胞活力的影響。

(2) 將草魚肝細胞均勻接種于96孔板(150 μL/孔), 28℃, 5% CO2培養(yǎng)24h。之后, 更換為含有油酸和不同質(zhì)量濃度(75、100、125 μg/mL)水飛薊素的培養(yǎng)液培養(yǎng)肝細胞24h, 然后MTT法評估水飛薊素對添加油酸的肝細胞活力的影響。

MTT法操作步驟為: 細胞經(jīng)上述處理后, 向每孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL), 在28℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h, 吸棄培養(yǎng)液, 用PBS洗1次,吸棄, 每孔加入150 μL DMSO, 于28 ℃孵育10 min,溶解細胞中的甲臢。用Gen5 酶標儀于490 nm波長處測定吸光值, 每組6個重復(fù)。

1.6 油紅O染色提取法及試劑盒法測定細胞甘油三酯含量

將草魚肝細胞均勻接種于96孔板, 根據(jù)1.4方式處理肝細胞后, 吸棄培養(yǎng)基, 每孔用PBS洗2次, 加入10%的甲醛溶液固定30min, PBS洗2次, 加入新鮮配制的油紅O染液浸染15min, 之后用PBS清洗2次,于倒置顯微鏡下觀察細胞內(nèi)脂滴的染色情況, 拍照記錄。之后每孔加入150 μL的異丙醇萃取脂質(zhì), 用Gen5 酶標儀于490 nm波長處測定吸光值。每組6個重復(fù)。

此外, 用甘油三酯試劑盒定量測定細胞內(nèi)甘油三酯含量(北京普利萊基因技術(shù)有限公司), 進一步確定水飛薊素抑制脂質(zhì)積累的質(zhì)量濃度。

1.7 抗氧化指標的檢測

將草魚肝細胞均勻接種于24孔板, 按照1.4方式處理肝細胞后, 吸棄培養(yǎng)基, 胰蛋白酶消化細胞, 待細胞接近圓球形時, 立即加入含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液終止消化, 用移液器反復(fù)輕輕吹打, 收集細胞懸液, 1000 r/min離心5min, 棄上清液, 加PBS吹打均勻, 1000 r/min離心5min, 棄上清液, 收集細胞待用, 用于抗氧化指標測定。

抗氧化指標包括超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)和還原型谷胱甘肽(Reduced glutathione, GSH), 均采用試劑盒進行測定(南京建成生物工程研究所)。細胞蛋白含量用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.8 實時定量PCR檢測脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA的表達

將草魚肝細胞均勻接種于24孔板, 按照1.4方式處理肝細胞后, 吸棄培養(yǎng)基, PBS清洗2次, 提取總RNA, 并反轉(zhuǎn)錄。采用CFX-96實時定量PCR儀(Bio-Rad, USA)測定相關(guān)基因的mRNA表達量。20 μL反應(yīng)體系, 包括: 上下游引物(10 mmol/μL)各0.6 μL、cDNA 1 μL、2×SYBR Premix ExTaqTMII 10 μL、滅菌雙蒸水加至20 μL。反應(yīng)條件是: 95℃,10s; 95℃, 15s; 57℃, 15s; 40個循環(huán)。實時定量檢測基因β-actin、FAS、ACC、SCD1、ATGL、HSL、CPT1的引物序列見表1。在反應(yīng)結(jié)束后, 利用溶解曲線對產(chǎn)物的唯一性進行分析。β-actin作為內(nèi)參,相對定量法比較Ct值(2–ΔΔCt), 計算基因表達量, 并作圖分析, 每組3個重復(fù)。

1.9 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤(Mean±SE)表示。采用SPSS18.0軟件中的單因素方差分析(Oneway ANOVA)以及Duncan氏多重比較,t-檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。顯著水平為P＜0.05, 極顯著水平為P＜0.01。

表1 實時定量PCR引物序列Tab. 1 Primers used in real-time quantitative PCR

2 結(jié)果

2.1 水飛薊素對草魚肝細胞活力的影響

首先評估了水飛薊素對未加油酸的草魚肝細胞活力影響(圖1), 結(jié)果顯示, 與對照組比較, 水飛薊素質(zhì)量濃度在25—100 μg/mL時顯著增加了細胞活力(P＜0.05), 而在5和200 μg/mL時均與對照組無顯著差異(P＞0.05)。

進一步評估了水飛薊素和油酸共同處理草魚肝細胞24h后, 對肝細胞活力的影響(圖2), 結(jié)果顯示, 與對照組比較, 油酸組(OA組)顯著提高了肝細胞活力(P＜0.05)。與油酸組(OA組)比較, SM75、SM100組均顯著提高了細胞活力(P＜0.05), 而SM125組無顯著影響(P＞0.05)。這表明水飛薊素質(zhì)量濃度在75—125 μg/mL并同時添加400 μmol/L油酸對草魚肝細胞活力無抑制作用。

2.2 水飛薊素對草魚肝細胞脂質(zhì)蓄積的抑制作用

采用不同質(zhì)量濃度的水飛薊素和油酸處理草魚肝細胞24h后, 通過油紅O染色對細胞形態(tài)進行了觀察(圖3A), 隨著水飛薊素質(zhì)量濃度的增加, 草魚肝細胞內(nèi)紅色脂滴含量呈現(xiàn)出減少的趨勢, 且脂滴變小, 顏色變淺。同時, 用油紅O染色提取比色法定量分析細胞內(nèi)脂質(zhì)含量(圖3B), 結(jié)果顯示, 與對照組比較, 油酸組(OA組)的脂質(zhì)含量顯著增加(P＜0.05)。與油酸組(OA組)比較, SM5組的脂質(zhì)含量顯著增加(P＜0.05), 之后隨著水飛薊素質(zhì)量濃度的增加, 肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)含量逐漸降低, 且水飛薊素質(zhì)量濃度在100—150 μg/mL時的脂質(zhì)含量顯著降低(P＜0.05)。

進一步用甘油三酯試劑盒定量檢測肝細胞甘油三酯含量(圖4), 結(jié)果顯示水飛薊素100 μg/mL處理肝細胞24h后, 肝細胞內(nèi)甘油三酯含量顯著低于油酸組(OA組), 但高于對照組(P＜0.05); 油酸組(OA組)肝細胞內(nèi)甘油三酯含量則顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.3 水飛薊素對草魚肝細胞脂質(zhì)蓄積抑制作用的時間依賴關(guān)系

研究了水飛薊素對草魚肝細胞脂質(zhì)蓄積抑制作用的時間依賴關(guān)系(圖5)。選擇質(zhì)量濃度為100 μg/mL的水飛薊素處理肝細胞, 油紅O染色提取比色法定量分析細胞脂質(zhì)含量(圖5B)。結(jié)果顯示, 與油酸組(OA組)相比, 隨著水飛薊素處理時間的延長, 在12h時肝細胞脂質(zhì)含量出現(xiàn)顯著降低(P＜0.05), 在18h和24h時肝細胞內(nèi)脂質(zhì)含量均極顯著降低(P＜0.01)。油紅O染色后光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)(圖5A), 隨著水飛薊素處理時間的延長, 在同一時間點肝細胞內(nèi)的紅色脂滴少且顏色淺于油酸組。

圖1 水飛薊素對草魚肝細胞活力的影響(平均值±標準誤, n=6)Fig. 1 Effect of silymarin on the viability of grass carp hepatocytes (mean±SE, n=6)

圖2 水飛薊素和油酸共同處理24h對草魚肝細胞活力的影響(平均值±標準誤, n=6)Fig. 2 Effect of silymarin and oleic acid on the viability of grass carp hepatocytes (means±SE, n=6)

2.4 水飛薊素對草魚肝細胞抗氧化能力的影響

結(jié)果表明(圖6), SM100組的GSH含量顯著高于油酸組(OA組)(P＜0.05), 但與對照組無差異(P＞0.05); 油酸組(OA組)的GSH含量低于對照組, 但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)(圖6B)。SOD活性在對照組、油酸組(OA組)和SM100組間均無顯著差異(P＞0.05)(圖6A)。

2.5 水飛薊素對草魚肝細胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的影響

與對照組相比(圖7), 油酸組(OA組)SCD1的mRNA表達量顯著上調(diào), 而ATGL、HSL和CPT1的mRNA表達量則顯著下調(diào)(P＜0.05); 油酸組(OA組)FAS的mRNA表達量呈增加趨勢, 但與對照組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。與油酸組(OA組)比較,SM100組的FAS和SCD1的mRNA表達量均顯著下調(diào)(P＜0.05)。SM100組的ACC、ATGL、HSL、CPT1的mRNA表達量與油酸組相比呈降低趨勢, 但均無顯著差異(P＞0.05)。

3 討論

3.1 水飛薊素對肝細胞活力的影響

在哺乳動物上, 體外建立脂肪肝細胞模型, 進行外源性活性功能成分篩選, 是一種常用研究手段,而在魚類上的相關(guān)研究報道較少。Okamoto等[26]用0.1和1 mmol/L油酸培養(yǎng)HepG2 24h, 成功造成肝細胞脂肪變性。Ricchi等[27]用0.66和1.32 mmol/L油酸成功誘導(dǎo)3種肝細胞系(HepG2, WRL-68和HuH-7細胞)脂肪變性。本研究室用油酸成功誘導(dǎo)了草魚肝細胞脂質(zhì)蓄積, 即油酸濃度在400 μmol/L培養(yǎng)24h時能夠促進草魚肝細胞脂質(zhì)蓄積且有利于增強細胞活力[32]。因此, 本研究選用400 μmol/L油酸用于誘導(dǎo)草魚肝細胞脂質(zhì)蓄積。MTT和油紅O染色法提取脂質(zhì)結(jié)果顯示油酸組的細胞活力和脂質(zhì)含量均顯著高于對照組, 表明400 μmol/L油酸能夠增加草魚肝細胞的活力并誘導(dǎo)脂質(zhì)蓄積, 進一步證實了上述研究結(jié)果。有研究報道指出, 水飛薊素(30 μmol/L)和水飛薊賓(100 μmol/L)對原代培養(yǎng)的大鼠肝細胞產(chǎn)生損傷作用[33]。Venkataramanan等[34]報道0.25 mmol/L (48h)水飛薊素對原代培養(yǎng)的人肝細胞活力無抑制作用, 而水飛薊素在0.5 mmol/L (48h)時對細胞活力產(chǎn)生抑制作用。Zhang等[35]用水飛薊素(100 μmol/L)和棕櫚酸(200 μmol/L)共同處理HepG2和BRL-3A細胞, 發(fā)現(xiàn)添加水飛薊素后能夠降低棕櫚酸對細胞的毒性作用。在本研究中, 水飛薊素處理未加油酸的肝細胞結(jié)果表明, 水飛薊素質(zhì)量濃度在5—200 μg/mL時對細胞活力無抑制作用,且25—100 μg/mL時能夠增強細胞活力。進一步分析水飛薊素和油酸共同處理草魚肝細胞結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)水飛薊素質(zhì)量濃度在75—125 μg/mL并同時添加400 μmol/L油酸對肝細胞活力無抑制作用。

3.2 水飛薊素對肝細胞脂質(zhì)蓄積的抑制作用及其調(diào)控機制

圖3 油紅O染色法評估水飛薊素對草魚肝細胞脂質(zhì)蓄積的影響(平均值±標準誤, n=6)Fig. 3 Effects of silymarin on intracellular lipid accumulation in grass carp hepatocytes (mean±SE, n=6)

水飛薊素是一種黃酮類植物提取物, 具有保護肝臟和緩解胰島素耐受, 影響糖脂代謝的作用[36—38]。在大鼠上發(fā)現(xiàn), 水飛薊素降低了高脂血癥或CCl4誘導(dǎo)增加的大鼠血液總脂質(zhì), 甘油三酯和膽固醇含量[25,39]。Zhang等[35]用水飛薊素與棕櫚酸共同處理BRL-3A和HepG2細胞, 發(fā)現(xiàn)水飛薊素抑制了細胞脂質(zhì)蓄積。在本實驗中, 水飛薊素顯著降低了油酸誘導(dǎo)草魚肝細胞中甘油三酯的蓄積, 這與我們先前在體研究中發(fā)現(xiàn)的水飛薊素能夠降低高脂日糧誘導(dǎo)增加的草魚肝脂含量結(jié)果一致[20], 表明水飛薊素對草魚肝細胞脂質(zhì)蓄積具有抑制作用, 有利于保護肝臟。此外, 時間依賴關(guān)系結(jié)果表明, 隨著水飛薊素處理肝細胞時間的延長, 抑制脂質(zhì)蓄積的效果顯著。

本研究進一步分析了水飛薊素對肝細胞脂質(zhì)蓄積抑制的調(diào)控機制。乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase, ACC)和脂肪酸合酶(Fatty acid synthase, FAS)是調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成的關(guān)鍵限速酶[40,41],硬脂酰輔酶A去飽和酶1(Stearoyl-CoA desaturases 1, SCD1)是軟脂酸去飽和合成單不飽和脂肪酸的調(diào)控酶[42]。甘油三酯脂酶(Adipose triglyceride lipase, ATGL)和激素敏感酶(Hormone-sensitive lipase, HSL)是調(diào)控甘油三酯水解的關(guān)鍵酶[43]。肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(Carnitine palmitoyltransferase 1,CPT1)是影響線粒體脂肪酸β-氧化的限速酶[44]。在本研究中, 與對照組相比, 油酸組脂質(zhì)分解相關(guān)基因(ATGL、HSL、CPT1)的mRNA表達量顯著下調(diào),而脂質(zhì)合成基因SCD1的mRNA表達量顯著上調(diào),同時FAS的mRNA表達量呈增加趨勢, 表明油酸能夠抑制肝細胞中脂質(zhì)分解, 促進脂質(zhì)合成, 這可能是導(dǎo)致肝細胞脂質(zhì)增加的主要原因[28]。黃酮可降低非酒精性脂肪肝大鼠的肝臟脂質(zhì)蓄積, 其抑制作用與抑制脂質(zhì)合成有關(guān)[45]。在體研究指出, 水飛薊素可降低高果糖日糧飼喂大鼠的FAS基因表達量[37]。在本研究中, 與油酸組比較, 水飛薊素處理組的FAS和SCD1基因表達量顯著下調(diào), 表明水飛薊素可能通過下調(diào)肝細胞內(nèi)脂質(zhì)合成來抑制脂質(zhì)蓄積, 這可能是導(dǎo)致肝細胞內(nèi)甘油三酯含量降低, 改善油酸誘導(dǎo)肝細胞脂肪蓄積的主要原因。

圖4 水飛薊素對草魚肝細胞甘油三酯含量的影響(平均值±標準誤, n=3)Fig. 4 Effect of silymarin on triacylglycerol (TG) contents in grass carp hepatocytes (mean±SE, n=3)

3.3 水飛薊素對肝細胞抗氧化能力的影響

圖5 水飛薊素對草魚肝細胞脂質(zhì)蓄積的時間依賴關(guān)系(平均值±標準誤, n=6)Fig. 5 Effect of silymarin on lipid accumulation in grass carp hepatocytes for 0, 4h, 8h, 12h, 18h or 24h (mean±SE, n=6)

圖6 水飛薊素對草魚肝細胞抗氧化能力的影響(平均值±標準誤, n=3)Fig. 6 Effect of silymarin on antioxidant capabilities in grass carp hepatocytes (mean±SE, n=3)

肝細胞對甘油三酯的儲存能力有限。當過量游離脂肪酸蓄積在肝細胞內(nèi), 導(dǎo)致產(chǎn)生過量的活性氧(Reactive oxygen species, ROS), 引起氧化應(yīng)激發(fā)生, 造成脂毒性, 導(dǎo)致細胞損傷或死亡[46,47], 并使得營養(yǎng)性脂肪肝進一步向肝纖維化和肝壞死轉(zhuǎn)變[9]。ROS是不穩(wěn)定的活性分子, 依賴于細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的清除作用。SOD屬于抗氧化酶, 可清除游離的自由基進而保護細胞的抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[48];GSH用于維持細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡, 作為谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的底物, 對清除自由基起了關(guān)鍵作用[49]。水飛薊素具有抗氧化、抗炎、抗癌等作用[16,17]。已有研究發(fā)現(xiàn), 水飛薊素處理棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細胞后, 不僅提高了細胞中GSH含量, 而且改善了棕櫚酸誘導(dǎo)的AKT酶活性的降低, 并緩解了細胞死亡[50]。在體研究中, 水飛薊賓不僅能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)平衡, 而且可顯著降低酒精性脂肪肝炎大鼠ROS含量, 抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的脂毒性作用, 最終阻止了肝臟損傷的發(fā)展[38]。在本研究中, 水飛薊素處理肝細胞后, GSH含量增加, 表明水飛薊素能夠促進肝細胞的抗氧化能力的提高, 這將有助于抵抗細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生, 保護肝細胞[17]。然而, 有關(guān)水飛薊素對肝細胞氧化應(yīng)激和脂質(zhì)蓄積影響的內(nèi)在作用機制有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn), 水飛薊素能夠抑制油酸誘導(dǎo)的草魚肝細胞脂質(zhì)蓄積, 改善肝細胞的脂肪變性狀況,其作用機制可能與其抑制脂質(zhì)合成基因的表達有關(guān); 同時水飛薊素能夠提高肝細胞的抗氧化能力,表明水飛薊素或可作為一種具有開發(fā)潛力的魚用降脂及抗氧化因子。另外, 研究認為, 結(jié)合在體飼養(yǎng)試驗, 通過建立細胞離體培養(yǎng)模型進行微量成分作用機制研究和功能性添加劑的篩選, 可作為開展水產(chǎn)動物營養(yǎng)學(xué)研究和飼料開發(fā)的有效方法。

圖7 RT-PCR測定水飛薊素對草魚肝細胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的影響(平均值±標準誤, n=3)Fig. 7 Effects of silymarin on the relative expression of the lipid metabolism related genes in grass carp hepatocytes (mean±SE, n=3)

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INHIBITORY EFFECT OF SILYMARIN ON OLEIC ACID-INDUCED LIPID ACCUMULATION IN GRASS CARP (CTENOPHARYNGODON IDELLUS)HEPATOCYTES IN VITRO

XIAO Pei-Zhen1, JI Hong1, ZHANG Bao-Tong2, YE Yuan-Tu3, SUN Jian1, YANG Zhou1,LI Xue-Xian1and TIAN Jing-Jing1
(1. College of Animal Science and Technology, Northwest A amp; F University, Yangling 712100, China; 2. Open Lab for Aquatic Animal Nutrition, Beijing Research Institute for Nutritional Resources, Beijing 100069, China; 3. Key Laboratory of Aquatic Nutrition of Jiangsu Province, School of Biology and Basic Medical Sciences, Soochow University, Suzhou 215123, China)

The objective of this study was to explore the mechanism and effect of silymarin on hepatocytes lipid accumulation of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) induced by oleic acid (OA). Hepatocytes were treated at 400 μmol/L OA with or without silymarin to observe the cell viability by 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and the lipid accumulation by Oil Red O stain. We also tested the effects of silymarin on the antioxidant capacities and the expression of lipid metabolism related gene in hepatocytes in grass carp detected by RT-PCR.The results showed that the cell viability was not affected by the treatment of 400 μmol/L OA with 75—125 μg/mL silymarin in presence for 24h (P＞0.05). The intracellular lipid content of hepatocytes decreased significantly after the treatment of 400 μmol/L OA with 100—150 μg/mL silymarin for 24h by Oil Red O stain (P＜0.05). Compared with the OA group, SM100 group showed time-dependent trend on the decreasing lipid accumulation (P＜0.05). Reduced glutathione (GSH) contents were higher in SM100 group than those in the OA group. The expressions of fatty acid synthase(FAS) and stearoyl-CoA desaturases 1 (SCD1) mRNA were significantly downregulated in SM100 group compared with those in the OA group (P＜0.05). These results demonstrated silymarin exerted an inhibitory effect on lipid accumulation by decreasing lipogenesis, and enhanced antioxidative ability in grass carp hepatocytes. Silymarin may shed light on the prevention of fatty liver.

Silymarin; Lipid accumulation; Hepatocyte; Grass carp; Oleic acid

S963.7

A

1000-3207(2017)06-1301-10

2017-01-04;

2017-03-17

陜西省水產(chǎn)健康生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)集成與示范(2014-TS-36)資助 [Supported by the Technical Integration and Demonstration of Aquaculture Health Ecology in Shaanxi Province (2014-TS-36)]

蕭培珍(1980—), 女, 山西忻州人; 博士研究生在讀; 主要研究方向為水生生物研究方法與技術(shù)。E-mail: peizhenxiao2012@163.com

吉紅(1967—), 男, 河南靈寶人; 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師; 主要研究方向為水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料。E-mail: jihong@nwsuaf.edu.cn