鯉脾臟高豐度micoRNA let-7a序列特征、組織表達(dá)及功能預(yù)測分析

郭國軍 趙銀麗 劉變枝 王 杰 孫向麗 李國喜

(1. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院, 鄭州 450046; 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 鄭州 450002; 3. 河南工業(yè)大學(xué), 鄭州 450001)

(1.Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450046, China; 2. Henan University of Agricultural,Zhengzhou 450002, China; 3. Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China)

鯉脾臟高豐度micoRNA let-7a序列特征、組織表達(dá)及功能預(yù)測分析

郭國軍1趙銀麗3劉變枝2王 杰2孫向麗2李國喜2

(1. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院, 鄭州 450046; 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 鄭州 450002; 3. 河南工業(yè)大學(xué), 鄭州 450001)

先前研究表明let-7a為鯉(Cyprinus carpio)脾臟高豐度miRNA, 但其功能尚不清楚。為全面了解鯉let-7a的潛在生物學(xué)功能, 研究分析了其成熟序列特征、組織表達(dá)譜和靶基因富集情況。結(jié)果顯示, let-7a在鯉脾臟中存在序列長度變異和堿基替換, 長度為18—25 nt, 堿基替換類型有9種, 種子區(qū)序列堿基替換率達(dá)2.1%。表達(dá)譜分析表明, let-7a為廣泛性高豐度miRNA, 具明顯的時序表達(dá)特征, 其在鰓、腸、脾臟和腎臟等免疫相關(guān)器官中的表達(dá)水平明顯高于其他器官。GO富集分析顯示, let-7a與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞刺激應(yīng)答、離子轉(zhuǎn)運、跨膜運輸、蛋白質(zhì)氨基酸磷酸化和細(xì)胞遷移等生物學(xué)過程密切相關(guān), 尤其是靶基因GO term在刺激應(yīng)答相關(guān)的許多生物學(xué)過程顯著富集?？傊? 鯉let-7a可廣泛參與多種生物學(xué)過程調(diào)控, 尤其是機(jī)體各種刺激應(yīng)答。

鯉; let-7a; 序列特征; 組織表達(dá)譜; 生物學(xué)功能

鯉(Cyprinus carpio)是重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類, 在中國其養(yǎng)殖產(chǎn)量約占淡水養(yǎng)殖魚類總產(chǎn)量的30%。近年來, 隨著高密度精養(yǎng)的快速發(fā)展, 傳染性疾病的暴發(fā)日益嚴(yán)重, 已影響到該物種的生產(chǎn)。因此, 鯉的抗病育種越來越受到關(guān)注。在天然條件下, 魚類主要依賴于非特異性免疫應(yīng)答快速清除病原體而抵抗疾病[1]。因此, 疾病預(yù)防的一個重要途徑就是采用分子育種方法培育對主要疾病具有抵抗力的品種。但目前, 有關(guān)鯉抗病性狀的研究還處于初級階段, 許多抗病性狀還沒有很好的分子標(biāo)記,至使分子育種技術(shù)在鯉育種實踐中還得不到廣泛應(yīng)用。

MicroRNA(miRNA)是內(nèi)源性非編碼小RNA,其通過與mRNA的3′-UTR中靶位點結(jié)合而從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá), 參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和代謝等許多生物學(xué)過程調(diào)節(jié)[2], 已成為解析動物性狀形成的一個新靶點。許多研究已證實,miRNA在免疫系統(tǒng)自身發(fā)育以及免疫相關(guān)的許多生物學(xué)過程發(fā)揮重要作用[3,4]。脾臟是魚類的二級淋巴樣免疫器官, 在疾病過程可通過T細(xì)胞和B細(xì)胞等免疫細(xì)胞消滅抗原, 防御來自血液的病原體,在細(xì)菌感染過程發(fā)揮重要作用[5]。因此, 脾臟是鑒定魚類免疫相關(guān)分子標(biāo)記的一個理想器官。為從轉(zhuǎn)錄后水平解析鯉脾臟發(fā)育的分子機(jī)制和鑒定免疫相關(guān)分子標(biāo)記, 前期構(gòu)建了黃河鯉(Cyprinus carpio haematopterusTemminck)脾臟的miRNA表達(dá)譜,從中鑒定到194種保守miRNA和12種新miRNA[6]。但目前尚不清楚這些miRNA在鯉脾臟中的功能。

Let-7家族是研究最為廣泛的miRNA之一。2000年, 由Reinhart等[7]首次在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中發(fā)現(xiàn), 研究證明其參與線蟲發(fā)育時序性調(diào)控。隨后, let-7在果蠅(Drosophila melanogaster)、小鼠(Mus musculus)和人類(Homo sapiens)等多個物種中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn), 其序列高度保守并廣泛存在于無脊椎動物到脊椎動物的許多物種中。有關(guān)let-7生成、加工、表達(dá)調(diào)控和生物學(xué)功能的相關(guān)研究已很多, 這些研究表明let-7家族廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)生等多種生理病理過程的調(diào)控[8,9]。其中, 免疫方面的一些研究顯示, let-7可調(diào)控生物體對細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答[10], 通過調(diào)控白細(xì)胞介素[11—14]、細(xì)胞活素[15]和Toll-like受體[16,17]等免疫相關(guān)因子的表達(dá)而影響機(jī)體免疫, 這說明let-7家族與動物免疫密切相關(guān)。因此, 深入研究let-7家族在魚類免疫中的調(diào)控功能, 有助于免疫相關(guān)分子標(biāo)記的發(fā)掘。但目前有關(guān)魚類let-7家族的研究還僅見于斑馬魚(Danio rerio)[18]和牙鲆(Paralichthys olivaceus)[19,20]等少數(shù)報道。本實驗室前期從黃河鯉脾臟組織miRNA表達(dá)譜中檢測到了let-7家族的9個成員, 其中l(wèi)et-7a的測序讀數(shù)占整個文庫序列讀數(shù)的37.61%[6], 為高豐度miRNA, 但其功能尚不明確。本研究分析了let-7a在鯉脾臟中的序列特征、組織表達(dá)譜和預(yù)測靶基因富集情況, 并整合上述3種結(jié)果探討了鯉let-7a的潛在生物學(xué)功能, 以期增加對鯉let-7a生物學(xué)功能的全面理解和為后續(xù)功能研究提供有益線索。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

采用黃河鯉進(jìn)行l(wèi)et-7a的組織表達(dá)譜分析, 試驗用魚來自河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院下屬的黃河鯉良種場, 為室外池塘養(yǎng)殖。分別取1齡和3齡黃河鯉各3尾, 解剖后采集腦、鰓、肌肉、心臟、脾臟、腸、腎臟和肝胰臟等組織, 用液氮迅速冷凍后保存于–80℃冰箱中備用。

1.2 試驗方法

總RNA提取與加尾 采用Trizol試劑(TaKaRa公司), 按照產(chǎn)品操作說明提取黃河鯉各組織的總RNA, 分別利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測總RNA的完整性和濃度。let-7a實時定量PCR分析采用加尾法, 反轉(zhuǎn)錄前在RNA兩端加poly (A)尾, 反應(yīng)體系為20 μL, 其中總RNA 4 μL、10×buffer 2 μL、ATP (10 umol/L) 2 μL、E. coliPoly(A) Polymerase (5 U/μL, NEB公司) 2 μL、H2O 10 μL, 上述試劑混合后于PCR儀上37℃孵育60min。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)利用primerScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa公司)對黃河鯉各組織總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 反應(yīng)體系: 反轉(zhuǎn)錄引物(10 μmol/L) 2 μL、加尾后的總RNA 2 μL、5×PrimeScript Buffer 4 μL、dNTP Mixture (2.5 mmol/L each) 4 μL、DTT(0.1 mol/L) 2 μL、PrimeScript Rtase (200 U/μL)1 μL、H2O (RNase Free) 5 μL。依次加入各試劑,混勻后, 在42℃ 60min、85℃ 5min條件下進(jìn)行反應(yīng), 結(jié)束后于冰上冷卻終止反應(yīng)。所用反轉(zhuǎn)錄引物為5′-CTCGATCCAGTCTCAGGGTCCGAGGT ATTCGATCGAGTCGCACTTTTTTTTTTTTTTTT-3′。

let-7a熒光定量PCR分析在Roche Light-Cycler?480Ⅱ?qū)崟r定量檢測PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR分析, 反應(yīng)體系20 μL: 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL、上游特異性引物(10 μmol/L) 1 μL、下游通用引物(10 μmol/L) 1 μL、2×SYBR熱啟動預(yù)混酶10 μL、H2O 7 μL。反應(yīng)條件為: 95℃ 10min; 95℃ 15s,60℃ 1min, 共40個循環(huán)。于62℃采集熒光, 采用默認(rèn)設(shè)置自動生成Ct值。各組織樣品重復(fù)3次。反應(yīng)中, let-7a上游特異性引物為5′-CGGTGAGGT AGTAGGTTGTATAG-3′, 下游通用引物為5′-CCAGTCTCAGGGTCCGAG-3′。同時, 按照相同條件對5S RNA進(jìn)行熒光定量PCR分析, 所用引物為: 上游5′-ACGGCCATACCACCCTGAGC-3′、下游5′-GTATTCCCAGGCGGTCTCCC-3′。以5S RNA為內(nèi)參對照、1齡鯉肌肉組織為校準(zhǔn)樣品, 利用各組織樣品三次重復(fù)的平均Ct值, 采用2–ΔΔCt法計算鯉各組織中l(wèi)et-7a的相對表達(dá)量。

let-7a成熟序列堿基編輯分析以實驗室構(gòu)建的鯉脾臟小RNA文庫為基礎(chǔ), 將Solexa高通量測序獲得的未被注釋的小RNA序列與miRBase數(shù)據(jù)庫(http://microrna.sanger.ac.uk/)中鯉let-7a的成熟序列進(jìn)行比對, 在允許特定位點存在一個堿基錯配的條件下, 分析與let-7a已知序列相匹配的小RNA序列, 從而檢測let-7a成熟序列的堿基編輯情況。

let-7a靶基因預(yù)測、通路分析和GO term 富集

本研究基于相近物種間基因3′-UTR靶位點高度保守的原理, 利用TargetScan Release 6.2 (http://www.targetscan.org/fish_62/)中斑馬魚的資源, 預(yù)測了鯉let-7a的靶基因。利用DAVID Bioinformatics Resources 6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)中的Functional Annotation Tool對let-7a的預(yù)測靶基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)分析和通路分析, 顯著性富集標(biāo)準(zhǔn)是校正P≤0.05。利用GENERIC GENE ONTOLOGY(GO)TERM FINDER在線工具(http://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermFinder), 采用ZFIN-D.rerio (Zebrafish)為背景集, 以P＜0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn),對let-7a的預(yù)測靶基因進(jìn)行分層富集。

2 結(jié)果

2.1 鯉脾臟中l(wèi)et-7a成熟序列特征

基于前期構(gòu)建的鯉脾臟小RNA文庫和Solexa測序數(shù)據(jù), 分析了let-7a的序列特征。結(jié)果表明,鯉脾臟中l(wèi)et-7a成熟序列長度在18—25 nt, 多數(shù)為22 nt (80.6%), 其次為23 nt (10.2%)、21 nt (7.3%)、20 nt (1.3%); 長度變異主要發(fā)生在3′末端, 主要形式有修飾和(或)核苷酸添加(圖1)。

圖1 鯉脾臟組織中l(wèi)et-7a序列長度變異Fig. 1 Let-7a sequence length difference in the spleen tissue of common carp

另外, 在文庫中共檢測到5915316條與let-7a相匹配的小RNA序列存在多態(tài)現(xiàn)象, 其堿基替換類型有9種, 包括A-＞C、A-＞G、A-＞T、G-＞A、G-＞C、G-＞T、T-＞A、T-＞C和T-＞G等, 這些堿基替換類型占所有替換類型總計數(shù)的百分比分別為0.01%、0.40%、0.03%、11.70%、0.03%、4.05%、0.15%、0.10%和0.24%, 其中優(yōu)勢類型為G-＞A和G-＞T。堿基替換發(fā)生在let-7a成熟序列的第5到第20位堿基處, 主要是第12、第19和第6位堿基處, 分別占93.9%、2.0%和1.7%。成熟miRNA的5′端第2至第8位堿基稱為種子序列(Seed sequence), 該區(qū)域是miRNA與靶mRNA的結(jié)合部位, 本研究從文庫中共檢測到20802條與let-7a相匹配的小RNA序列, 它們的第5至第8位處存在堿基編輯現(xiàn)象, 占2.1%。

2.2 鯉let-7a的組織表達(dá)譜

由圖2可知, let-7a在所檢測的8種鯉組織中均有表達(dá)。在設(shè)定閾值為2.8576條件下, 1齡鯉各組織實時定量PCR分析的平均Ct值為13.45—16.57,3齡鯉各組織的平均Ct值為13.00—18.93, 這說明let-7a在鯉不同發(fā)育階段的各組織中均高豐度表達(dá)。從相對表達(dá)量看, let-7a在鰓、腦、腸、脾臟和腎臟中的表達(dá)水平明顯高于心臟、肝胰臟和肌肉中的表達(dá)水平, 其中1齡鯉脾臟最高, 肌肉最低(圖2)。

同時, let-7a的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的時序特征。除肝胰臟外, 隨著生長發(fā)育let-7a在鯉各組織中的表達(dá)水平均降低, 1齡鯉明顯高于3齡鯉(圖2)。在腦組織, let-7a在1齡和3齡鯉均高豐度表達(dá), 1齡鯉稍高于3齡鯉。在鰓、腸、脾臟和腎臟中, let-7a的表達(dá)水平在兩個發(fā)育階段差異顯著, 1齡鯉鰓、腸、脾臟和腎臟中l(wèi)et-7a的表達(dá)量分別是3齡鯉的5.3、2.4、2.4和1.4倍。

2.3 鯉let-7a的功能預(yù)測分析

為更好地理解鯉let-7a的生物學(xué)功能, 采用TargetScan算法預(yù)測到了2381個let-7a的潛在靶基因(結(jié)果未顯示)。GO富集分析顯示, 這些預(yù)測靶基因與廣泛的生物學(xué)過程相關(guān), 涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞刺激應(yīng)答、離子轉(zhuǎn)運、跨膜運輸、蛋白質(zhì)氨基酸磷酸化、細(xì)胞遷移、大分子復(fù)合物裝配等特定的生物學(xué)過程(表1)。其中, 在有機(jī)物的細(xì)胞應(yīng)答、內(nèi)源性刺激的細(xì)胞應(yīng)答和有機(jī)環(huán)狀化合物的細(xì)胞應(yīng)答等相關(guān)生物學(xué)過程中, 累計富集基因占總預(yù)測靶基因的比例分別為5.5%、4.5%和2.4%(表1)。

圖2 鯉let-7a的組織表達(dá)譜Fig. 2 Tissue expression patterns of the let-7a in common carp

表1 let-7a預(yù)測靶基因在生物學(xué)過程分類范疇中富集的GO termTab. 1 GO term enrichment for the predicted target genes of let-7a in biological process category

由于細(xì)胞應(yīng)答與機(jī)體防御密切相關(guān), 為了解let-7a調(diào)控鯉刺激應(yīng)答的更多信息, 利用GO Term Enrichment tool對let-7a的預(yù)測靶基因重新進(jìn)行了分層富集。結(jié)果顯示, 這些靶基因的GO term在化學(xué)刺激應(yīng)答、刺激的細(xì)胞應(yīng)答、對含氮化合物應(yīng)答、對含氧化合物的應(yīng)答、刺激應(yīng)答調(diào)控、對生長因子的應(yīng)答、對肽類激素的應(yīng)答、對胰島素的應(yīng)答和轉(zhuǎn)化生長因子β刺激的細(xì)胞應(yīng)答等特定生物學(xué)過程中顯著富集(圖3)。同時, 這些預(yù)測靶基因具有DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白激酶活性、離子通道活性、磷酸酶活性和生長因子活性等多種分子功能(表2)。

另外, 利用DAVID生物信息學(xué)資源對預(yù)測靶基因也進(jìn)行了通路分析, 結(jié)果顯示這些預(yù)測靶基因的GO term在MAPK信號通路、Wnt信號通路和TGF-beta信號通路等通路中顯著富集(表3)。

3 討論

研究表明, 動物許多miRNA的表達(dá)具有明顯的種屬和組織特異性, 這些miRNA在特定組織器官的特定發(fā)育階段大量表達(dá), 參與相應(yīng)生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)。因此, 明確特定組織器官或特定發(fā)育階段miRNA的表達(dá)譜, 將有助于揭示特定組織器官發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制。本研究結(jié)果表明, let-7a在所檢測的8種鯉組織中均高豐度表達(dá), 且隨著發(fā)育機(jī)體生理功能趨于完善穩(wěn)定, 其表達(dá)量相對降低(肌肉組織除外), 呈現(xiàn)明顯的時序特征(圖2); 而靶基因預(yù)測分析也顯示, 鯉let-7a與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞刺激應(yīng)答、離子轉(zhuǎn)運、跨膜運輸、細(xì)胞遷移等多種生物學(xué)過程密切相關(guān)(表1)。這些說明, 本研究的組織表達(dá)譜與靶基因預(yù)測分析結(jié)果高度一致, 同時也提示let-7a在鯉中可能具有廣泛的生物學(xué)功能。

在生物體內(nèi), 一個miRNA可能作用于多個靶基因, 或多個miRNA調(diào)控一個靶基因, 共同構(gòu)成一個網(wǎng)絡(luò), 從整體上調(diào)控有機(jī)體的生命活動[21]。另外,機(jī)體內(nèi)miRNA靶基因的結(jié)合位點經(jīng)常存在多態(tài)現(xiàn)象, 如Lin28基因中l(wèi)et-7結(jié)合位點的多態(tài)性與Ⅱ型糖尿病發(fā)病風(fēng)險有關(guān)[22]; KRAS 3′-UTR中l(wèi)et-7結(jié)合位點的多態(tài)性與多種癌癥有關(guān)[23,24]?；趍iRNA靶基因的多樣性, 機(jī)體內(nèi)miRNA常常存在序列長度變異和堿基編輯情況。其中, 長度和/或末端序列變異可影響miRNA/靶基因mRNA雜交雙鏈體的形成,從而使miRNA能夠執(zhí)行不同的功能[25]; 而成熟miRNA的5′端種子區(qū)(也叫miRNA seed)序列的堿基變化可導(dǎo)致miRNA靶位點的變化[26]。本研究利用Solexa測序數(shù)據(jù)分析了鯉脾臟中l(wèi)et-7a的長度變異和堿基編輯情況, 發(fā)現(xiàn)let-7a序列末端存在修飾和(或)核苷酸添加現(xiàn)象(圖1), 長度在18—25 nt; 同時,let-7a成熟序列第5至第20位堿基處存在9種類型的堿基替換, 而種子區(qū)序列的替換率達(dá)2.1%。據(jù)研究, 機(jī)體內(nèi)A-＞G替換是由腺苷脫氨酶(ADARs)催化的A-to-I脫氨基作用引起[27—29], 而其他類型的堿基替換可能是由RNA的轉(zhuǎn)錄后修飾產(chǎn)生[30]。因此, 鯉脾臟中l(wèi)et-7a序列長度變異與堿基編輯, 增加了let-7a及其靶基因的多樣性, 擴(kuò)大了let-7a的功能范圍,是let-7a功能多樣性的基礎(chǔ)。

揭示魚類免疫調(diào)節(jié)分子機(jī)制和鑒定免疫相關(guān)分子標(biāo)記, 是魚類抗病育種的關(guān)鍵。先前相關(guān)研究證明, let-7家族的一些成員可參與免疫調(diào)控。例如,let-7通過調(diào)控NF-κB通路抑制者A20而調(diào)節(jié)對結(jié)核分支桿菌感染的免疫應(yīng)答[10]; let-7a在裸鼠中可抑制k-Ras和c-Myc的表達(dá)而保護(hù)肺癌的生長[31]; let-7c在Jurkat細(xì)胞中可直接靶作用于IL-10而調(diào)控IL-10的表達(dá)[11]; let-7i通過靶作用于Toll-樣受體4(TLR4)而降低其表達(dá), 從而促進(jìn)免疫應(yīng)答[32]。而本研究結(jié)果與先前這些研究結(jié)果也高度一致, 組織表達(dá)譜顯示let-7a在鯉鰓、腸、脾臟和腎臟等免疫相關(guān)組織器官中高豐度表達(dá)(圖2), 其預(yù)測靶基因在化學(xué)刺激應(yīng)答、含氮化合物刺激應(yīng)答、含氧化合物刺激應(yīng)答、生長因子刺激應(yīng)答、肽類激素刺激應(yīng)答等機(jī)體防御相關(guān)的生物學(xué)過程中顯著富集(圖3), 這證明let-7a與鯉免疫功能調(diào)控密切相關(guān)。根據(jù)預(yù)測靶基因富集分析可知, let-7a對鯉免疫功能的調(diào)控, 可能是通過轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白激酶活性和生長因子活性等多種分子功能(表2)以及MAPK、Wnt和TGF-beta等信號通路(表3)來實現(xiàn)的。因此, 可以將let-7a作為鯉免疫調(diào)控的一個新靶標(biāo), 進(jìn)一步深入研究其在上述免疫防御相關(guān)生物學(xué)過程中的作用與機(jī)制, 為鯉抗病育種分子標(biāo)記篩選提供基礎(chǔ)。

總之, 上述let-7a的功能預(yù)測分析結(jié)果與其序列特征和組織表達(dá)譜相一致。整合3種分析結(jié)果可以看出, 鯉let-7a為廣泛性普遍表達(dá)miRNA, 可參與轉(zhuǎn)錄、離子轉(zhuǎn)運、跨膜轉(zhuǎn)運、細(xì)胞遷移、戊糖磷酸支路等諸多生物學(xué)過程調(diào)控, 尤其是機(jī)體各種刺激應(yīng)答。本研究所得結(jié)果, 為進(jìn)一步研究鯉let-7a的功能提供了有益線索。

圖3 與刺激應(yīng)答相關(guān)的GO term項的分層富集Fig. 3 Stratified enrichment of GO terms related to the stimulus response

表2 let-7a預(yù)測靶基因在分子功能分類范疇中富集的GO termTab. 2 GO term enrichment for the predicted target genes of let-7a in molecule function category

表3 let-7a預(yù)測靶基因富集的通路Tab. 3 The enrichment pathway for the predicted target genes of let-7a

[1]Camp K L, Wolters W R, Rice C D. Survivability and immune responses after challenge withEdwardsiella ictaluriin susceptible and resistant families of channel catfish,Ictalurus punctatus[J].Fish amp; Shellfish Immunology,2000, 10(6): 475—487

[2]Sontheimer E J, Carthew R W. Silence from within: endogenous siRNAs and miRNAs [J].Cell, 2005, 122(1):9—12

[3]Koralov S B, Muljo S A, Galler G R,et al. Dicer ablation affects antibody diversity and cell survival in the B lymphocyte lineage [J].Cell, 2008, 132(5): 860—874

[4]Zhu X, Hu Y, Wang K Z,et al. The expressional characterization of mir-222 in mandarin fish (Siniperca chuatsi)[J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2015, 39(2): 315—320[朱鑫, 胡毅, 王開卓, 等. 翹嘴鱖miR-222的表達(dá)特征.水生生物學(xué)報, 2015, 39(2): 315—320]

[5]Raida M K, Buchmann K. Development of adaptive immunity in rainbow trout,Oncorhynchus mykiss(Walbaum) surviving an infection withYersinia ruckeri[J].Fish amp; Shellfish Immunology, 2008, 25(5): 533—541

[6]Li G, Zhao Y, Wen L,et al. Identification and characterization of microRNAs in the spleen of common carp immune organ [J].Journal of Cellular Biochemistry, 2014,115(10): 1768—1778

[7]Reinhart B J, Slack F J, Basson M,et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing inCaenorhabditis elegans[J].Nature, 2000, 403(6772): 901—906

[8]Thornton J E, Gregory R I. How does Lin28 let-7 control development and disease[J]?Trends in Cell Biology,2012, 22(9): 474—482

[9]Viswanathan S R, Daley G Q. Lin28: A microRNA regulator with a macro role [J].Cell, 2010, 140(4): 445—449

[10]Kumar M, Sahu S K, Kumar R,et al. MicroRNA let-7 Modulates the immune response toMycobacterium tuberculosisinfection via control of A20, an inhibitor of the NF-κB pathway [J].Cell Host amp; Microbe, 2015, 17(3):345—356

[11]Jiang L, Cheng Z, Qiu S,et al. Altered let-7 expression in Myasthenia gravis and let-7c mediated regulation of IL-10 by directly targeting IL-10 in Jurkat cells [J].International Immunopharmacology, 2012, 14(2): 217—223

[12]Swaminathan S, Suzuki K, Seddiki N,et al. Differential regulation of the Let-7 family of microRNAs in CD4+ T cells alters IL-10 expression [J].The Journal of Immunology, 2012, 188(12): 6238—6246

[13]Kumar M, Ahmad T, Sharma A,et al. Let-7 microRNA-mediated regulation of IL-13 and allergic airway inflammation [J].Journal of Allergy and Clinical Immunology,2011, 128(5): 1077—1085

[14]Wang S J, Geng Q, Zheng X Y,et al. Regulatory role of the let-7/miR-98 family in IL-6 expression [J].Journal of Shandong University (Health Sciences), 2012, 50(1):62—65 [王樹軍, 耿芹, 張秀英, 等. Let-7/miR-98家族對IL-6的調(diào)節(jié)作用. 山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2012, 50(1):62—65]

[15]Schulte L N, Eulalio A, Mollenkopf H J,et al. Analysis of the host microRNA response to Salmonella uncovers the control of major cytokines by the let-7 family [J].The EMBO Journal, 2011, 30(10): 1977—1989

[16]Lehmann S M, Krüger C, Park B,et al. An unconventional role for miRNA: let-7 activates Toll-like receptor 7 and causes neurodegeneration [J].Nature Neuroscience,2012, 15(6): 827—835

[17]Satoh M, Tabuchi T, Minami Y,et al. Expression of let-7i is associated with Toll-like receptor 4 signal in coronary artery disease: effect of statins on let-7i and Toll-like receptor 4 signal [J].Immunobiology, 2012, 217(5):533—539

[18]López-Bellido R, Barreto-Valer K, Sánchez-Simón F M,et al. Cocaine modulates the expression of opioid receptors and miR-let-7d in zebrafish embryos [J].PLoS One,2012, 7(11): e50885

[19]Shi Z Y, Wu M L, Fu Y S. Cloning, expression and target gene prediction of let-7 inParalichthys olivaceusmetamorphosis [J].Journal of Fishery Sciences of China,2011, 18(6): 1211—1218 [施志儀, 吳明林, 付元帥. 牙鲆let-7基因的克隆與表達(dá)及其靶基因預(yù)測. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2011, 18(6): 1211—1218]

[20]Wu M L, Shi Z Y, Fu Y S,et al. Expression character and target predictions of let-7d during metamorphosis in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) [J].Journal of Shanghai Ocean University, 2012, 21(3): 344—350 [吳明林, 施志儀, 付元帥, 等. Let-7d在牙鲆變態(tài)發(fā)育期間的表達(dá)及靶基因預(yù)測. 上海海洋大學(xué)學(xué)報, 2012, 21(3):344—350]

[21]Ambros V. The functions of animal microRNAs [J].Nature, 2004, 431(7006): 350—355

[22]Zhang J, Zhang L, Fan R,et al. The polymorphism in the let-7 targeted region of the Lin28 gene is associated with increased risk of type 2 diabetes mellitus [J].Molecular and Cellular Endocrinology, 2013, 375(1-2): 53—57

[23]Li Z H, Pan X M, Han B W,et al. A let-7 binding site polymorphism rs712 in the KRAS 3′ UTR is associated with an increased risk of gastric cancer [J].Tumor Biology, 2013, 34(5): 3159—3163

[24]Smits K M, Paranjape T, Nallur S,et al. A let-7 microRNA SNP in the KRAS 3′UTR is prognostic in early-stage colorectal cancer [J].Clinical Cancer Research, 2011,17(24): 7723—7731

[25]Jazdzewski K, Liyanarachchi S, Swierniak M,et al. Polymorphic mature microRNAs from passenger strand of pre-miR-146a contribute to thyroid cancer [J].The Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(5): 1502—1505

[26]Brodersen P, Voinnet O. Revisiting the principles of microRNA target recognition and mode of action [J].Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2009, 10(2): 141—148

[27]Borchert G M, Gilmore B L, Spengler R M,et al. Adenosine deamination in human transcripts generates novel microRNA binding sites [J].Human Molecular Genetics,2009, 18(24): 4801—4807

[28]Heale B S, Eulalio A, Schulte L,et al. Analysis of A to I editing of miRNA in macrophages exposed to Salmonella [J].RNA Biology, 2010, 7(5): 116—122

[29]Kawahara Y, Zinshteyn B, Sethupathy P,et al. Redirection of silencing targets by adenosine-to-inosine editing of miRNAs [J].Science, 2007, 315(5815): 1137—1140

[30]Ebhardt H A, Tsang H H, Dai D C,et al. Meta-analysis of small RNA-sequencing errors reveals ubiquitous posttranscriptional RNA modifications [J].Nucleic Acids Research, 2009, 37(8): 2461—2470

[31]Chen X M, Splinter P L, O'Hara S P,et al. A cellular micro-RNA, let-7i, regulates Toll-like receptor 4 expression and contributes to cholangiocyte immune responses againstCryptosporidium parvuminfection [J].The Journal of Biological Chemistry, 2007, 282(39): 28929—28938

[32]He X Y, Chen J X, Zhang Z,et al. The let-7a microRNA protects from growth of lung carcinoma by suppression of k-Ras and c-Myc in nude mice [J].Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 2010, 136(7): 1023—1028

SEQUENCE CHARACTERISTIC, TISSUE EXPRESSION PROFILE AND BIOINFORMATICS ANALYSIS OF ABUNDANCE MICORNA LET-7A IN THE SPLEEN OF COMMON CARP

GUO Guo-Jun1, ZHAO Yin-Li3, LIU Bian-Zhi2, WANG Jie2, SUN Xiang-Li2and LI Guo-Xi2

Previous studies have shown that the let-7a was an abundance miRNA in the spleen of common carp, but its function in the carp spleen is still not clear. Therefore, in this study, the characteristic of let-7a mature sequence were analyzed, the expression profiles of let-7a were determined by RT-qPCR in eight tissue samples at two stages of development, and the bioinformatic analysis were performed for the predicted target gene of let-7a. The results showed that the let-7a existed sequence length variation and base substitution in the spleen of common carp. The let-7a length ranged from 18 nt to 25 nt, and the base substitution types of its mature sequence had nine. Especially, the base substitution rate in seed sequence was 2.1%. The expression profile analysis showed that the let-7a as a generalized high abundance miRNA exhibited striking temporal expression characteristics. The let-7a expression levels in the immunity related organs including gill, intestine, spleen and kidney were significantly higher than those in the other organs. GO enrichment analysis suggested that the let-7a significantly involved in the regulation of transcription, cellular response to stimulus, ion transport, transmembrane transport, protein amino acid phosphorylation, cell motion, and so on. Especially, the predicted target genes of let-7a were significantly enriched in many biological processes of stimulus response. In a word, let-7a can widely participate in the regulation of various biological processes, especially in the stimulus response of the body in common carp.

Common carp; let-7a; Sequence characteristic; Tissue expression profile; Biological function

Q344+.1

A

1000-3207(2017)06-1177-09

2017-01-03;

2017-04-22

國家自然科學(xué)基項目(31572356)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31572356)]

郭國軍(1973—), 男, 河南中牟人; 在讀博士; 研究方向為水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)。E-mail: 306301974@qq.com

李國喜, 副教授; E-mail: liguoxi0914@126.com

10.7541/2017.146

(1.Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450046, China; 2. Henan University of Agricultural,Zhengzhou 450002, China; 3. Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China)