甘草黃酮的提取分離及其葡萄糖苷酶抑制活性研究

楊劍萍，蘇婷婷，張韓潔，林曉純，劉小意，黃 灝，汪雅麗

(廣東第二師范學院化學系，廣東 廣州 510303)

甘草黃酮的提取分離及其葡萄糖苷酶抑制活性研究

楊劍萍，蘇婷婷，張韓潔，林曉純，劉小意，黃 灝，汪雅麗

(廣東第二師范學院化學系，廣東 廣州 510303)

采用超聲提取和堿溶酸沉法提取甘草的活性成分甘草黃酮；通過化學顯色法進行定性鑒定，采用分光光度法測定甘草黃酮含量；并建立了一種基于電化學法的葡萄糖苷酶抑制活性篩選新方法，以臨床降糖藥阿卡波糖驗證了電化學篩選法的可靠性。結(jié)果表明，甘草黃酮具有較好的葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50為67.6 mg·L-1。葡萄糖苷酶抑制活性電化學篩選法具有良好的準確性和抗干擾能力，為中藥葡萄糖苷酶抑制劑的研發(fā)提供了有價值的參考。

甘草黃酮；葡萄糖苷酶抑制活性；電化學法；酶抑制劑

甘草是多年生豆科草本植物，是我國傳統(tǒng)的補益中藥，有效成分主要為甘草黃酮、甘草酸和甘草多糖。文獻報道，甘草黃酮具有良好的抗氧化、抗病毒、止咳平喘、調(diào)和諸藥等生理活性[1-2]，但有關(guān)甘草黃酮的葡萄糖苷酶抑制活性尚不明確。

我國天然藥物資源豐富，采用中藥治療糖尿病已有多年的臨床實踐；此外，中藥的毒副作用相對較小且療效顯著，從天然藥物中篩選葡萄糖苷酶抑制藥物具有廣闊的應用前景[3-4]。目前，藥物葡萄糖苷酶抑制活性篩選常采用碘量法和分光光度法，容易受溶液背景顏色的干擾從而造成實驗誤差大。由于中藥提取物大部分具有較深的顏色，不可避免會影響實驗結(jié)果[5]。因此，開發(fā)一種篩選中藥葡萄糖苷酶抑制活性的新方法很有必要。作者采用超聲提取和堿溶酸沉法提取甘草黃酮，建立了一種適用于天然藥物有效成分的葡萄糖苷酶抑制劑快速篩選的電化學法，并對電化學篩選法的可靠性和抗干擾性進行了研究。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

甘草，大森林藥店，粉碎過四號篩。

α-葡萄糖苷酶、葡萄糖、淀粉，上海伯奧生物科技有限公司；阿卡波糖(每片含阿卡波糖50 mg)，德國拜耳公司；蘆丁標準品，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；硝酸銅，分析純，廣州試劑廠。

TU-1900型紫外可見分光光度計，北京普析儀器公司；CS電化學工作站，武漢科恩特儀器有限公司；玻碳電極、Ag/AgCl電極和鉑絲電極。

1.2 甘草黃酮的提取分離

稱取甘草粉末50 g于燒杯中，加入500 mL 95%乙醇溶液浸漬過夜，置于超聲波清洗器中提取1 h，過濾。濾液減壓濃縮成浸膏狀，然后加5% Na2CO3溶液溶解，再加入濃鹽酸調(diào)至pH值為1～2，甘草黃酮沉淀析出，抽濾。重復2次堿溶酸沉過程，干燥，得到較純的甘草黃酮提取物[6]。

1.3 甘草黃酮提取物的定性鑒定

取少量提取物溶于1 mL乙醇中，撒一點鎂粉，滴加2滴濃鹽酸，觀察顏色變化。用玻璃棒蘸取提取液于濾紙上，干燥后噴灑1%乙酸鎂甲醇溶液，置于紫外光下觀察。

1.4 甘草黃酮含量的測定

稱取蘆丁標準品10 mg，用50%乙醇溶解，定容到50 mL容量瓶中，配成濃度為0.20 g·L-1蘆丁標準溶液。分別吸取0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL蘆丁標準溶液于10 mL容量瓶中，加50%乙醇定容到5 mL，加5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加4%NaOH溶液2 mL，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，于510 nm處測吸光度。

稱取甘草黃酮提取物40.0 mg，用50%乙醇溶解，定容到50 mL容量瓶中，準確移取1 mL溶液至10 mL容量瓶中，同法測定溶液吸光度，計算甘草黃酮含量。

1.5 葡萄糖濃度的電化學法測定

以沉積了氧化銅的玻碳電極為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，Ag/AgCl電極為參比電極，構(gòu)成一個簡便的電化學安培傳感器用于測定葡萄糖濃度。電沉積方法如下：在0.1 mol·L-1Cu(NO3)2(0.1 mol·L-1KCl作為支持電解質(zhì))溶液中對玻碳電極進行電沉積。恒電位極化電位為-0.4 V，時間為3 min，常溫下晾干；電位設(shè)為-0.5～0.3 V，在0.1 mol·L-1NaOH溶液里循環(huán)伏安循環(huán)20圈，得到沉積了氧化銅的玻碳電極[7]。

循環(huán)伏安的檢測條件：電解質(zhì)溶液為0.1 mol·L-1NaOH溶液，電位范圍為0～0.8 V，掃描速率為100 mV·s-1，電流量程為20 mA，檢測葡萄糖濃度為0.005 mol·L-1。電流與葡萄糖濃度的標準曲線測定條件：在不斷磁力攪拌下滴加葡萄糖標準溶液，電位設(shè)為0.6 V，葡萄糖濃度在1 000 s內(nèi)從0.1 mmol·L-1到10 mmol·L-1，每個濃度檢測3次[8]。

1.6 葡萄糖苷酶抑制活性實驗

1.6.1 酶液的配制

稱取α-葡萄糖苷酶16.0 mg置于50 mL燒杯中，加入0.1 mol·L-1pH值6.8的磷酸鈉緩沖溶液30 mL，攪拌溶解后將上清液轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用磷酸鈉緩沖溶液定容至刻度，搖勻，配成濃度為5 U·mL-1的酶液。置于4 ℃冰箱內(nèi)靜置過夜，過濾，移取0.2 mL濾液于10 mL容量瓶中，用磷酸鈉緩沖溶液定容至刻度，搖勻，配成濃度為0.1 U·mL-1的酶液。

1.6.2 淀粉溶液的配制

稱取2.0 g淀粉，加蒸餾水溶解，邊攪拌邊加入約80 mL熱水，煮沸3 min，靜置冷卻過濾至100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，配成濃度為2.0%淀粉溶液。

1.6.3 酶抑制活性的測定

6支試管分別標號a、b、c、d、e、f ，其中a為空白組，不加酶也不加阿卡波糖；b為陰性對照組，加酶不加阿卡波糖；c為陽性對照組，加酶、加0.1 mL阿卡波糖；d、e、f為樣品組，加酶、加不同濃度的甘草黃酮提取物溶液。試劑加入的順序為：pH值6.8的磷酸鈉緩沖溶液2.5 mL，酶液0.5 mL(空白組加0.5 mL磷酸鈉緩沖溶液)，0.1 mL阿卡波糖，置于37 ℃水浴10 min，再加入5 mL 2.0%淀粉溶液，37 ℃水浴中恒溫20 min，加入6 mL 0.5 mol·L-1NaOH溶液終止反應。迅速冷卻至室溫，蒸餾水定容至30 mL，分別檢測各反應體系的葡萄糖濃度。按下式計算酶抑制率(I)：

式中：b為陰性對照組葡萄糖濃度；d為樣品組葡萄糖濃度；a為空白組葡萄糖濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取物的定性分析

提取物遇鎂粉和濃鹽酸出現(xiàn)紅色；再噴灑乙酸鎂溶液，在紫外光下可觀察到熒光，這是黃酮類物質(zhì)特有的顯色反應，可判斷提取物為黃酮類物質(zhì)。

2.2 甘草黃酮含量的測定

蘆丁標準溶液濃度與吸光度的關(guān)系見表1。

表1蘆丁標準溶液濃度與吸光度的關(guān)系

Tab.1Correlation between the concentration ofrutin standard solution and absorbance

測定甘草黃酮樣品溶液吸光度為0.685，查得濃度為69.0 mg·L-1，經(jīng)計算提取物中甘草黃酮含量為86.50%。

2.3 電化學法測定葡萄糖濃度

葡萄糖的循環(huán)伏安曲線及響應電流與葡萄糖濃度的線性曲線如圖1所示。

從圖1a可以看出，電極在氫氧化鈉溶液中沒有明顯的響應電流，添加了葡萄糖溶液后，氧化峰電流急增，并且在電位0.6 V處出現(xiàn)明顯的葡萄糖氧化峰，循環(huán)伏安曲線證明了制備的電極對葡萄糖有良好的檢測效果。從圖1b可以看出，隨著葡萄糖濃度的增加，響應電流也呈階梯式上升，且在一定的濃度范圍內(nèi)，響應電流與葡萄糖濃度呈線性關(guān)系，線性方程為：y=139.1x+10，R2=0.9928。

2.4 葡萄糖苷酶抑制活性電化學篩選法的可靠性

采用臨床降糖藥α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖驗證電化學篩選法的可靠性。電化學篩選法和碘量法測定阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率如表2所示。

圖1 葡萄糖的循環(huán)伏安曲線(a)及響應電流與葡萄糖濃度的線性曲線(b)Fig.1 Cyclic voltammetry curve of glucose(a) and linear curve of current and glucose concentration(b)

表2阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率

Tab.2Inhibition rate of α-glucosaccharase by acarbose

從表2可以看出，2種方法測得的α-葡萄糖苷酶的抑制率比較接近，且在一定的濃度范圍內(nèi)，阿卡波糖濃度與抑制率呈正比。電化學篩選法和碘量法測得的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為42.2 mg·L-1和43.6 mg·L-1，表明阿卡波糖具有很強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，與臨床效果吻合，2種方法沒有顯著性差異。

2.5 電化學篩選法的抗干擾性研究

為驗證葡萄糖苷酶抑制活性電化學篩選法的抗干擾性，加入酶抑制活性反應體系可能的干擾物質(zhì)。分別往體系里添加反應濃度的磷酸鹽緩沖溶液、淀粉、阿卡波糖、甘草黃酮、α-葡萄糖苷酶和葡萄糖溶液(5 mmol·L-1)，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，電極只對葡萄糖具有很強的響應電流，而對干擾物沒有明顯的響應。表明電化學篩選法具有良好的抗干擾能力。

2.6 甘草黃酮的葡萄糖苷酶抑制活性研究

采用電化學法研究甘草黃酮的葡萄糖苷酶抑制活性，結(jié)果見表3。

圖2 電化學篩選法的抗干擾性Fig.2 Anti-interference of electrochemical screening method

表3甘草黃酮的α-葡萄糖苷酶抑制率

Tab.3Inhibitionrateofα-glucosaccharasebylicoflavone

樣品甘草黃酮濃度/(mg·L-1)抑制率/%空白組--陰性對照組--陽性對照組60.062.66樣品組160.045.20樣品組240.036.60樣品組320.023.65

由表3可以看出，甘草黃酮具有一定的葡萄糖苷酶抑制活性，且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。根據(jù)甘草黃酮濃度和抑制率的關(guān)系可以求出其對α-葡萄糖苷酶的IC50為67.6 mg·L-1，甘草黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制效果相當于阿卡波糖的72%。

3 結(jié)論

采用超聲提取和堿溶酸沉法提取甘草黃酮，并測定其葡萄糖苷酶抑制活性，建立了中藥活性成分的提取分離、定性鑒定和含量測定以及其葡萄糖苷酶抑制活性篩選的系統(tǒng)方法。結(jié)果表明，酶抑制活性電化學篩選法具有良好的準確性和選擇性，甘草黃酮具有較好的葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50為67.6 mg·L-1。該電化學篩選法操作簡單方便，為中藥有效成分的葡萄糖苷酶抑制活性研究提供了一種新穎的研究方法。

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ExtractionandSeparationofLicoflavoneandItsInhibitoryActivityonGlucosaccharase

YANG Jian-ping，SU Ting-ting，ZHANG Han-jie，LIN Xiao-chun，LIU Xiao-yi,HUANG Hao，WANG Ya-li

(SchoolofChemistry，GuangdongUniversityofEducation，Guangzhou510303,China)

We extracted active constituent licoflavone fromRadixliquiritiaeusing ultrasonic extraction and alkali-soluble acid precipitation extraction methods.We qualitatively identified it by a chemical coloration method，and determined its content by spectrophotometry.Moreover,we established a new glucosaccharase inhibitor screening method based on an electrochemical amperometric method.And we demonstrated the reliability of electrochemical screening method by clinical hypoglycemic drug acarbose.The results show that the licoflavone has good glucosaccharase inhibitory activity and its IC50is 67.6 mg·L-1.The electrochemical screening method forα-glucosidase inhibition activity has high accuracy and anti-interference.This study provides a valuable reference for screening glucosaccharase inhibitor from Chinese tradition medicine.

licoflavone；glucosaccharase inhibitory activity；electrochemical method；enzyme inhibitor

廣東省自然科學基金博士啟動項目 (2015A030310202)，廣東省教育廳強校工程青年創(chuàng)新人才類項目(2014KQNCX230)，廣東第二師范學院博士專項經(jīng)費項目(2013ARF04)，高等教育教學改革項目(2016ybzz08)，大學生創(chuàng)新訓練項目(201714278005，201714278075)

2017-06-25

楊劍萍(1979-)，女，廣東開平人，博士，講師，研究方向：藥物分析與藥物篩選、分析化學新儀器新方法等，E-mail:yangjianping@gdei.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.11.004

楊劍萍，蘇婷婷，張韓潔，等.甘草黃酮的提取分離及其葡萄糖苷酶抑制活性研究[J].化學與生物工程，2017，34(11)：15-18.

TQ461 R284.1

A

1672-5425(2017)11-0015-04