GC-MS結(jié)合電子鼻/電子舌分析發(fā)酵羊肉干的風(fēng)味成分

劉建林，孫學(xué)穎，張曉蓉，王 丹，趙麗華，靳 燁

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010020）

發(fā)酵肉制品通過有益微生物的發(fā)酵作用產(chǎn)生乳酸及菌素等代謝產(chǎn)物，從而降低其pH 值，提高產(chǎn)品的安全性和貨架期。通過微生物的發(fā)酵以及內(nèi)源酶的共同作用可產(chǎn)生醇類、酸類、雜環(huán)化合物及核苷酸等大量芳香類物質(zhì)，賦予發(fā)酵肉制品獨(dú)特的風(fēng)味[1]。目前，發(fā)酵肉制品中發(fā)現(xiàn)的揮發(fā)性成分沒有具體的數(shù)量，主要包括酸類、醇類、醛類、酮類、酯類和烴類等。發(fā)酵羊肉干是發(fā)酵肉制品中的一類，具有特殊的風(fēng)味和香氣，而風(fēng)味和滋味是影響感官特性、質(zhì)量和消費(fèi)者行為的重要因素[2]。目前，對(duì)發(fā)酵肉制品中風(fēng)味物質(zhì)的研究越來越多，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography-mass spec-trometry，GC-MS）技術(shù)被廣泛應(yīng)用到發(fā)酵食品揮發(fā)性成分的檢測(cè)中[3-5]。如：王德寶等[6]通過GC-MS 技術(shù)在香腸成品中共鑒定出26 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要包括醇類、醛類、酯類、酸類、烴類及醚類。

電子鼻是一種模擬人類嗅覺的低成本、快速檢測(cè)儀器。其主要由一系列對(duì)化學(xué)成分靈敏的傳感器組成，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法測(cè)量樣本頂部空間的揮發(fā)性化合物[7]。鄧龍等[2]通過GC-MC-O 結(jié)合電子鼻對(duì)8 種橄欖油進(jìn)行分離，結(jié)果顯示電子鼻結(jié)合PCA 分析可將8 種橄欖油很好地分離。電子舌（又稱智能味覺仿生系統(tǒng)）是通過多傳感器陣列感知樣品的整體特征響應(yīng)信號(hào)，利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)樣品進(jìn)行模擬識(shí)別和定量定性分析的一種檢測(cè)技術(shù)。賀羽等[8]通過電子鼻和電子舌技術(shù)成功分辯出不同釀造階段檸檬果醋氣、味的差異。然而，電子鼻只能檢測(cè)樣本的揮發(fā)性風(fēng)味性能，電子舌只能檢測(cè)樣本的滋味性能，因此本文將GC-MS技術(shù)和電子鼻/電子舌結(jié)合，通過主成分分析（Principal component analysis，PCA）和雷達(dá)分析圖譜等分析軟件對(duì)4 組發(fā)酵羊肉干的風(fēng)味成分進(jìn)行深入檢測(cè)，為我國發(fā)酵肉制品生產(chǎn)加工過程中的風(fēng)味鑒定以及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

背最長脊羊肉為巴盟察右中旗放牧羊；食鹽，中國鹽業(yè)集團(tuán)有限公司；白砂糖，太古糖業(yè)（中國）有限公司；葡萄糖、亞硝酸鈉、硝酸鈉和氯化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；植物乳桿菌X3-2B；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；沙蔥，購于鄂爾多斯市。以上試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

ZXMP-A1430 恒溫恒濕箱，上海智城分析儀器制造有限公司；PEN3 型便攜式電子鼻傳感器，德國Airsense 公司；SA402B 電子舌（日本Insent），北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司；氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀、手動(dòng)式SPME 手柄，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵羊肉干的制作 將原料肉去除筋腱、筋腱膜和脂肪后，順著肌纖維將羊肉切成約2～3 cm 的條。加入輔料后將處理好的發(fā)酵劑菌液加入到羊肉條中，使其終含量達(dá)到107CFU/g。將羊肉條與輔料、菌液等混合均勻腌制12 h 后進(jìn)行發(fā)酵。具體試驗(yàn)分組及輔料添加量見表1。

表1 發(fā)酵羊肉干配方及分組情況Table 1 Recipe and grouping of fermented dried mutton

1.3.2 風(fēng)味測(cè)定 參照羅玉龍等[9]的方法稍作改動(dòng)。采用固相微萃取法進(jìn)行樣品處理。取6 g 樣品置于20 mL 頂空瓶中壓蓋，將老化后的SPME 萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于60℃吸附50 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進(jìn)樣口，于250℃解吸3 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

氣相色譜條件：DB-5 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），氦氣載氣流速1 mL/min，進(jìn)樣口與接口溫度為250℃，不分流方式為進(jìn)樣模式。

采用三段式升溫程序：第1 階段起始溫度為40℃，以4℃/min 的速度升溫至150℃，持續(xù)3 min；第2 階段從150℃升溫至200℃，速度為5℃/min，保持1 min；第3 階段以20℃/min 的速度從200℃升溫到230℃，時(shí)間為5 min。

質(zhì)譜條件：采用EI 離子源作為電離方式，電離電壓70 eV，離子源溫度250℃，傳輸線溫度250℃，掃描質(zhì)量范圍m/z 30～400，溶劑延遲時(shí)間1 min。

定性與定量分析：將總離子流色譜圖中的每個(gè)峰與NIST，WILEY 和MENALIB 數(shù)據(jù)庫中已知物質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索定性，以匹配度大于800 為鑒定依據(jù)。根據(jù)峰面積歸一法計(jì)算每種風(fēng)味化合物的相對(duì)百分含量，最終單位為AU/g。

1.3.3 電子鼻傳感器檢測(cè) 參照李雙艷等[10]的方法略作修改。稱取5 g 肉糜放入10 mL 專用瓶中，60℃水浴40 min 后取出靜置平衡10 min，在25℃恒溫環(huán)境中用PEN3 型便攜式電子鼻傳感器對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

電子鼻條件：初始進(jìn)樣流量300 μL/min，取樣間隔時(shí)間1 s，清洗時(shí)間90 s，檢測(cè)時(shí)間200 s，零點(diǎn)修剪時(shí)間1 s。在數(shù)據(jù)分析與處理時(shí)，選擇傳感器信號(hào)穩(wěn)定后的值（一般在200 s 后基本穩(wěn)定），每組樣品做3 次平行重復(fù)。

表2 化學(xué)傳感器對(duì)不同物質(zhì)的響應(yīng)類型Table 2 Chemical sensors corresponding to different types of volatile substances

1.3.4 電子舌測(cè)定 參照范文教等[11]的方法略作修改。取10 g 肉樣，切碎后置于錐形瓶中加入100 mL 0.1 mol/L 氯化鉀溶液，在磁力加熱攪拌器上攪拌浸提30 min 后過濾，將濾液倒入電子舌專用容器中上機(jī)測(cè)定。

數(shù)據(jù)采集前，對(duì)電子舌進(jìn)行傳感器活化、校準(zhǔn)等操作，確保檢測(cè)數(shù)據(jù)的可靠性與穩(wěn)定性。將100 mL 濾液置于電子舌專用容器中，樣品采集與清洗交替進(jìn)行。樣品測(cè)定時(shí)間為90 s，采集周期1.0 s，采集延遲0 s，攪拌速率1 r/s，清洗（基準(zhǔn)液）時(shí)間336 s，截止時(shí)間20 s。檢測(cè)環(huán)境溫度為室溫。每個(gè)樣品除甜味測(cè)定5 次外，其它味均測(cè)定4 次，選取后3 次穩(wěn)定的電子舌響應(yīng)值進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0 分析軟件對(duì)4 組發(fā)酵羊肉干采集到的揮發(fā)性風(fēng)味數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。電子鼻、電子舌根據(jù)傳感器采集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用Origin 2018 和Excel 進(jìn)行主成分分析（PCA）和雷達(dá)色譜圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵羊肉干主要揮發(fā)性風(fēng)味的組成

4 組發(fā)酵羊肉干通過GC-MS 分析后，共檢測(cè)出主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)27 種，主要包括：酸類（7種）、醛類（6 種）、酯類（2 種）、醇類（3 種）、酮類（2種）、烴類（3 種）、其它（4 種），其物質(zhì)含量見表4。酸類風(fēng)味物質(zhì)主要源于食品中的有機(jī)酸以及發(fā)酵劑產(chǎn)生的乳酸，占總揮發(fā)成分的8.08%～15.68%，主要以異戊酸和乙酸為主。異戊酸含量差異較大，發(fā)酵劑+沙蔥組的異戊酸僅占0.98%，其它3 組都占2.18%～12.29%，這種差別可能是因?yàn)樘砑游锊煌瑢?dǎo)致的，植物乳桿菌X3-2B 為微生物發(fā)酵劑，而沙蔥則為一種香辛料。乙酸賦予產(chǎn)品的是酸醋味，而異戊酸賦予產(chǎn)品的是果香以及篤斯越橘樣香味。

醛類風(fēng)味物質(zhì)來自脂肪氧化水解、微生物作用以及糖類的美拉德反應(yīng)，其閾值較低，對(duì)產(chǎn)品最終的風(fēng)味影響較大，而且醛類有很強(qiáng)的與許多其它物質(zhì)重疊的風(fēng)味效應(yīng)[12-15]。其占總揮發(fā)性成分的2.54%～5.80%，主要以月桂醛、己醛、庚醛和正辛醛為主，其中月桂醛占2.28%～2.93%；而對(duì)照組和沙蔥組無己醛和脂肪香味，月桂醛賦予產(chǎn)品的則是柑橘香及紫羅蘭花香。

酯類風(fēng)味物質(zhì)主要是通過脂肪酸分解、過酶促反應(yīng)、酯化和醇解等途徑生物合成的[2]，占總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的3.81%～5.28%，主要以油酸甲酯為主（3.66%～5.01%），其中對(duì)照組含量最低（3.66%），發(fā)酵劑組含量最高（5.01%）。

表3 化學(xué)傳感器對(duì)不同物質(zhì)的響應(yīng)類型Table 3 Chemical sensors corresponding to different types of volatile substances

酮類風(fēng)味物質(zhì)由食物中多不飽和脂肪酸的氧化或降解以及氨基酸降解產(chǎn)生，其閾值低可賦予產(chǎn)品水果香和花香[15]，占總揮發(fā)性成分的1.42%～3.53%，主要為3-羥基-2-丁酮和2，3-辛二酮。發(fā)酵劑+沙蔥組3-羥基-2-丁酮和2，3-辛二酮的含量最高，沙蔥組未檢出2 種酮類風(fēng)味物質(zhì)。3-羥基-2-丁酮是由檸檬酸代謝產(chǎn)生的二乙酸轉(zhuǎn)化而來，可賦予發(fā)酵羊肉干清香味和奶香味[16-17]，2，3-辛二酮賦予的則是甜奶油以及甘薯相關(guān)風(fēng)味[18]。

醇類風(fēng)味物質(zhì)主要是由肉中的共軛亞油酸被脂肪氧合酶和氫過氧化酶降解以及羰基化合物還原而來，氣味柔和，可賦予產(chǎn)品植物香味[19-20]，占總揮發(fā)性風(fēng)味成分的0.5%～1.66%，以苯乙醇為主（1%～2.69%）。苯乙醇可賦予發(fā)酵羊肉干花香味，然而對(duì)照組和發(fā)酵劑組均未檢出苯乙醇，沙蔥組（1.32%）中苯乙醇的含量略高于發(fā)酵劑+沙蔥組（1.08%）。

烴類是由脂肪酸的烷氧基均裂形成，占總揮發(fā)性風(fēng)味成分的0.43%～3.66%，各組樣品烴類物質(zhì)含量差異較大，主要以鄰異丙基甲苯為主。烴類風(fēng)味物質(zhì)的閾值較大，對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味的影響較小[16，21]。

其它揮發(fā)性風(fēng)味占總揮發(fā)性風(fēng)味比例較低，僅為0.37%～1.6%，主要以醚類為主。由表4可知，添加物的不同使4 組發(fā)酵羊肉干的揮發(fā)性物質(zhì)不同，主要體現(xiàn)在風(fēng)味比例以及成分不一致上。

表4 4 組發(fā)酵羊肉干主要揮發(fā)性物質(zhì)含量Table 4 The percentage composition of volatile compounds of 4 different types of fermented mutton jerky

2.2 電子鼻分析4 組發(fā)酵羊肉干揮發(fā)性成分

PEN3 電子鼻包括10 個(gè)傳感器，根據(jù)4 組發(fā)酵羊肉干在10 個(gè)傳感器上的響應(yīng)值繪制出羊肉干雷達(dá)分析圖（圖1）。圖中不同顏色和形狀代表不同組別的發(fā)酵羊肉干。W5S、W5C、W1W 和W2W 4 個(gè)傳感器對(duì)各組發(fā)酵羊肉干樣品的響應(yīng)值都比較大，尤其是W5S（靈敏度大，對(duì)氮氧化合物很靈敏）和W1W（對(duì)硫化物靈敏）。W1W 傳感器對(duì)4 組羊肉干的響應(yīng)值差異較大，說明W1W 傳感器檢測(cè)出的揮發(fā)性成分組成相差較大；其它9個(gè)傳感器的信號(hào)響應(yīng)值基本一致，且不同種類之間幾乎重疊，說明這9 個(gè)傳感器檢測(cè)出的揮發(fā)性成分組成基本相似。對(duì)照組/發(fā)酵劑組發(fā)酵羊肉干的雷達(dá)響應(yīng)圖和其它3 組差異較大，對(duì)照組W1W傳感器響應(yīng)值顯著大于其它3 組，發(fā)酵劑組W1W傳感器響應(yīng)值顯著小于其它3 組，沙蔥和沙蔥+發(fā)酵劑組效果居中。硫化物在食品中含量極少，呈味閾值低，但對(duì)加工肉類貢獻(xiàn)很大，其主要是通過加工過程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)形成[22]；因此添加發(fā)酵劑（植物乳桿菌X3-2B）可在一定程度上抑制美拉德反應(yīng)。

圖1 發(fā)酵羊肉干的電子鼻雷達(dá)圖分析圖譜Fig.1 Radar map analysis of fermented mutton jerky by electronic nose

PCA 統(tǒng)計(jì)方法是對(duì)原有初始數(shù)據(jù)進(jìn)行簡化，通過線性組合將一組可能有相關(guān)性的變量簡化為一組線性不相關(guān)變量，從而突出元素之間的關(guān)系[23-25]。從圖2可以看出，第1 和第2 主成 分（PC1，PC2）貢獻(xiàn)率分別為66.2%和24.2%，總貢獻(xiàn)率達(dá)90.4%，涵蓋了樣品的大部分信息，用其代表發(fā)酵羊肉干電子鼻的整體信息可信度較高。4組發(fā)酵羊肉干的分離效果較好，其中對(duì)照組與其它3 組相差很大，在PC1 和PC2 上均為正值；發(fā)酵劑組與其它3 組相差也很大，在PC1 上為負(fù)值，PC2 上為正值，這與電子鼻雷達(dá)色譜圖表達(dá)的信息一致，主要由于美拉德反應(yīng)導(dǎo)致[2]。本研究中，同組樣品的數(shù)據(jù)采集點(diǎn)聚集在同一區(qū)域，不同組樣品的數(shù)據(jù)采集點(diǎn)則分散于不同區(qū)域，說明添加發(fā)酵劑和沙蔥的發(fā)酵羊肉干揮發(fā)性氣味具有顯著差異（圖2）。4 組發(fā)酵羊肉干的風(fēng)味物質(zhì)可以在二維PCA 圖譜上很好地分離，這說明電子鼻結(jié)合PCA可區(qū)分4 組發(fā)酵羊肉干。

圖2 發(fā)酵羊肉干電子鼻PCA 二維圖Fig.2 Two-dimensional PCA map of E-nose of fermented mutton jerky

2.3 電子舌分析4 組發(fā)酵羊肉干滋味成分

SA402B 電子舌共有5 個(gè)傳感器，根據(jù)4 組發(fā)酵羊肉干在5 個(gè)傳感器上的響應(yīng)值繪制出羊肉干雷達(dá)色譜圖。圖中不同顏色和形狀代表不同組別的發(fā)酵羊肉干。如圖3所示，咸味和鮮味傳感器對(duì)各組發(fā)酵羊肉干樣品的響應(yīng)值最大，而苦味、澀味、后味B（苦的回味）、后味A（澀的回味）、豐富度（鮮的回味）傳感器的響應(yīng)值基本一致，甜味傳感器的響應(yīng)值低于以上5 種傳感器的響應(yīng)值，而酸味傳感器的響應(yīng)值最低。經(jīng)分析，酸味和鮮味傳感器對(duì)各組發(fā)酵羊肉干樣品的響應(yīng)值呈顯著性差異，其中發(fā)酵劑組和沙蔥組的響應(yīng)值基本一致，對(duì)照組與發(fā)酵劑+沙蔥組的響應(yīng)值基本一致。發(fā)酵劑組和沙蔥組的鮮味顯著高于對(duì)照組和發(fā)酵劑+沙蔥組，而酸味顯著低于對(duì)照組和發(fā)酵劑+沙蔥組。綜上，單獨(dú)添加發(fā)酵劑與沙蔥可以改善發(fā)酵羊肉干的滋味，但并不能有效地區(qū)分各組樣品。

圖3 發(fā)酵羊肉干的電子舌雷達(dá)圖分析圖譜Fig.1 Radar map analysis of fermented mutton jerky by electronic tongue

從圖4可以看出，PC1 的貢獻(xiàn)率為83.7%，PC2 的貢獻(xiàn)率為13.9%，總貢獻(xiàn)率達(dá)97.6%，涵蓋了發(fā)酵羊肉干氣味物質(zhì)幾乎所有信息。如圖4所示，發(fā)酵劑組和沙蔥組的樣品都位于第2，3 象限之間，且相距較近，說明其滋味的相似性很高；對(duì)照組與發(fā)酵劑+沙蔥組的樣品都位于第1，4 象限之間，且相距較近，說明其滋味的相似性很高，這與電子舌雷達(dá)圖表達(dá)的信息一致[8]。4 組發(fā)酵羊肉干在二維PCA 圖譜上可以被較好地分開，說明4組發(fā)酵羊肉干存在滋味差異。

圖4 發(fā)酵羊肉干電子舌PCA 二維圖Fig.4 Two-dimensional PCA map of electronic tongue of fermented mutton jerky

3 結(jié)論

本研究通過GC-MS 技術(shù)結(jié)合電子鼻/電子舌探究發(fā)酵劑和沙蔥對(duì)發(fā)酵羊肉干成熟后風(fēng)味的影響。在發(fā)酵羊肉干成熟后檢測(cè)出主要風(fēng)味貢獻(xiàn)物質(zhì)27 種，包括異戊酸、乙酸、油酸甲酯、月桂醛、己醛、庚醛、正辛醛、苯乙醇、鄰異丙基甲苯、3-羥基-2-丁酮、2，3-辛二酮和醚類。對(duì)照組共檢測(cè)出16種風(fēng)味物質(zhì)成分，未檢測(cè)出己醛和苯乙醇；發(fā)酵劑組共檢測(cè)18 種風(fēng)味物質(zhì)成分，未檢出苯乙醇和2，3-辛二酮；沙蔥組共檢測(cè)出15 種風(fēng)味物質(zhì)成分，未檢測(cè)出己醛、庚醛、正辛醛、3-羥基-2-丁酮、2，3-辛二酮；沙蔥+發(fā)酵劑組共檢測(cè)出19 種風(fēng)味物質(zhì)成分，未檢測(cè)出醚類。電子鼻和電子舌結(jié)合PCA 和雷達(dá)圖譜分析可以更直觀地區(qū)分4 組發(fā)酵羊肉干之間的風(fēng)味差別。GC-MS 技術(shù)結(jié)合電子鼻和電子舌可為不同發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味差別提供相應(yīng)數(shù)據(jù)參考。