米根霉利用玉米芯渣同步糖化發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)富馬酸和真菌殼聚糖

李鑫，顧夕梅

(江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，南京 210037)

米根霉利用玉米芯渣同步糖化發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)富馬酸和真菌殼聚糖

李鑫，顧夕梅

(江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，南京 210037)

以堿處理玉米芯渣為原料，研究米根霉利用高質(zhì)量濃度玉米芯渣同步糖化發(fā)酵(SSF)生產(chǎn)富馬酸，同時(shí)從米根霉菌體中提取真菌殼聚糖。結(jié)果表明，高底物質(zhì)量濃度纖維素酶水解提高了葡萄糖質(zhì)量濃度，有利于米根霉發(fā)酵產(chǎn)富馬酸。米根霉利用質(zhì)量濃度為100 g/L的玉米芯渣SSF，發(fā)酵至72 h，富馬酸質(zhì)量濃度達(dá)到28.65 g/L，是質(zhì)量濃度為50 g/L玉米芯渣SSF中富馬酸質(zhì)量濃度的1.95倍。采用堿法從米根霉菌體中提取殼聚糖，米根霉殼聚糖脫乙酰度為90%；米根霉殼聚糖溶液(質(zhì)量濃度為20 g/L)黏度為2 mPa·s，米根霉殼聚糖的重均分子量和數(shù)均分子量分別2 578 和1 532 u。本研究實(shí)現(xiàn)了米根霉以木質(zhì)纖維原料為碳源聯(lián)產(chǎn)富馬酸和真菌殼聚糖，為木質(zhì)纖維原料高值生物轉(zhuǎn)化有機(jī)酸和生物高分子提供成本較低的新途徑。

米根霉；同步糖化發(fā)酵；木質(zhì)纖維原料；聯(lián)產(chǎn)；富馬酸；殼聚糖

作為地球上最豐富的可再生生物質(zhì)資源之一，木質(zhì)纖維原料具有價(jià)廉、易得、量大、可再生等特點(diǎn)，適合替代化石資源，用以生產(chǎn)能源及化學(xué)品[1-2]。我國農(nóng)業(yè)廢棄物資源潛力巨大，其中，農(nóng)作物秸稈資源量達(dá)到4.33億～6.35億t[3-4]。除秸稈還田、飼料、造紙、食用菌基料等用途，廢棄秸稈的主要處理方式為直接燃燒[3]，易造成環(huán)境污染。因此，農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用受到科研人員的廣泛關(guān)注。

富馬酸作為重要的四碳有機(jī)羧酸廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域，被美國能源部認(rèn)定為12種最具開發(fā)潛力的平臺化合物之一[5-6]。根霉屬微生物為生產(chǎn)富馬酸的最佳生產(chǎn)菌株[7]。同時(shí)，葡萄糖轉(zhuǎn)化為富馬酸的理論轉(zhuǎn)化率達(dá)到129%。與木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化燃料乙醇相比較，木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化富馬酸具有更高的原料利用度[7]。

殼聚糖為自然界中存在的堿性同多糖，具有良好的生物相容性、可降解性和生物安全性，在藥學(xué)和材料學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注[8]。與蝦、蟹來源的殼聚糖相比，微生物來源的殼聚糖具有生產(chǎn)不受季節(jié)影響、安全性高、生產(chǎn)低污染等優(yōu)勢[9]。米根霉菌體中富含殼聚糖，占菌體干質(zhì)量13%以上，所提取的真菌殼聚糖是生產(chǎn)高品質(zhì)生物材料的較理想原料[9]。這說明除富馬酸，真菌殼聚糖也是米根霉生產(chǎn)的有價(jià)值產(chǎn)品之一[10]。因此，米根霉適合生產(chǎn)真菌殼聚糖[11]。

筆者以米根霉為生產(chǎn)菌種，利用堿處理的玉米芯渣為碳源，研究高底物質(zhì)量濃度同步糖化發(fā)酵(SSF)生產(chǎn)富馬酸，并聯(lián)產(chǎn)真菌殼聚糖。發(fā)酵后，廢棄的米根霉菌體用以提取真菌殼聚糖，并對其性能進(jìn)行表征。通過研究米根霉利用木質(zhì)纖維原料聯(lián)產(chǎn)富馬酸和真菌殼聚糖，為木質(zhì)纖維原料高值生物轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

米根霉(Rhizopusoryzae) CICC 40351，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)。

1.1.2 原 料

玉米芯渣，由江蘇康維生物有限公司提供，為堿處理玉米芯渣；商品殼聚糖和葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，均購于Sigma公司。

1.1.3 纖維素酶

纖維素酶Ctec2，酶活257.57 U/g，購于諾維信公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):酵母膏3.0；麥芽浸膏3.0；瓊脂20.0；蛋白胨5.0；葡萄糖10.0。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40.0；硫酸銨 4.4；KH2PO40.6；MgSO4·7H2O 0.5；ZnSO4·7H2O 0.017 6；FeSO4·7H2O 0.000 498；pH 2.3～2.7。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米芯渣50～150；硫酸銨0.71；KH2PO40.6；MgSO4·7H2O 0.5；ZnSO4·7H2O 0.01；FeSO4·7H2O 0.000 4；碳酸鈣 30(需要單獨(dú)滅菌)；纖維素酶用量為25 U/g；加入0.05 mol/L緩沖液維持發(fā)酵液pH為4.8左右。

以上培養(yǎng)基均在0.1 MPa、121℃條件下滅菌15 min。

1.2 方 法

1.2.1 纖維素酶水解

稱取一定量絕干玉米芯渣于酶解瓶中，加入檸檬酸緩沖液(pH 4.8)，使玉米芯渣質(zhì)量濃度為50～150 g/L，分別加入25 U/g纖維素酶。在50℃、150 r/min的條件下酶水解72 h。酶水解后，酶解液以10 000 r/min速度離心10 min，取上清液測定其中的葡萄糖質(zhì)量濃度。

1.2.2 孢子懸濁液

將儲存于冰箱中的米根霉菌種取少量米根霉孢子，接種于斜面培養(yǎng)基上，在30℃條件下培養(yǎng)6～7 d。使用5 mL無菌水沖洗長滿孢子的米根霉菌絲3次，用紗布過濾，得到米根霉孢子懸濁液，再將孢子濃度稀釋至107個(gè)/mL。

1.2.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)

向三角瓶(250 mL)中加入50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接入5 mL孢子懸濁液，在35℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)

在250 mL的三角錐形瓶中，加入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接入5 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液，置于38℃、220 r/min的搖床培養(yǎng)60 h。

1.2.5 真菌殼聚糖提取方法

發(fā)酵后，米根霉菌體用G3砂芯漏斗過濾后，純水洗滌菌體3次，于60℃烘干至質(zhì)量恒定。使用1 mol/L NaOH溶液按照固液比1∶40(g/mL)于121℃條件下處理15 min，水洗沉淀至中性；然后用質(zhì)量濃度為20 g/L的乙酸溶液于95℃水浴中保溫24 h，離心分離，取上清液，加入質(zhì)量濃度為500 g/L的NaOH溶液至偏堿性，沉淀殼聚糖；固液分離后，水洗沉淀至中性，真空冷凍干燥得殼聚糖粉末。

1.2.6 分析方法

發(fā)酵樣品的制備：發(fā)酵結(jié)束后，使用NaOH溶液，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至偏堿性，再用硫酸溶液將pH調(diào)至7左右，將富馬酸轉(zhuǎn)化為易溶于水的鈉鹽形式進(jìn)行分析檢測。離心后，取上層清液待測。

采用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)孢子的數(shù)量；采用NREL方法測定玉米芯渣三素(纖維素、半纖維素和木質(zhì)素)質(zhì)量分?jǐn)?shù)[12]；采用濾紙酶活的標(biāo)準(zhǔn)方法測定纖維素酶活力[13]。按照文獻(xiàn)[9]方法測定殼聚糖脫乙酰度和黏度。

采用高效液相色譜法測定葡萄糖、富馬酸、乙醇質(zhì)量濃度，設(shè)備為Agilent 1200高效液相色譜儀(德國，1200)，色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87糖柱，以5 mmol/L硫酸為流動(dòng)相，流速0.6 mL/min，柱溫55℃，示差折光檢測器，進(jìn)樣量10 μL。

分子量的測定：稱取一定質(zhì)量的殼聚糖粉末，溶解于質(zhì)量濃度為20 g/L的乙酸溶液，配制成1 g/L的樣品，在10 000 r/min條件下離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，用于測定分子量。使用1260安捷倫高效液相色譜儀(德國，1260 Infinity)，色譜柱采用Waters Ultrahydrogel TM 2000(7.8 mm×300 mm)、Waters Ultrahydrogel TM 250(7.8 mm×300 mm)和Waters Ultrahydrogel TM 120(7.8 mm×300 mm)三柱串聯(lián)。保護(hù)柱為Waters Ultrahydrogel TM Guard Column(6 mm×40 mm)，示差檢測器，以超純水為流動(dòng)相，流速為0.60 mL/min，柱溫為65℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料及纖維素酶水解

對未處理玉米芯和堿處理的玉米芯渣進(jìn)行三素分析，物料中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量如表1所示。由表1可知，玉米芯中含纖維素360.1 g/kg、半纖維素368.4 g/kg，碳水化合物總量達(dá)728.5 g/kg。玉米芯經(jīng)堿處理后，半纖維素和木質(zhì)素含量明顯下降，纖維素含量提高至669.5 g/kg。玉米芯中半纖維素和木質(zhì)素的溶出解除了半纖維素和木質(zhì)素對纖維素的保護(hù)，從而增加纖維素比表面積，有利于提高酶水解得率[14]。

表1 原料成分Table 1 Composition of materials /(g/kg-1)

以玉米芯渣為底物，纖維素酶用量為25 U/g，研究玉米芯渣質(zhì)量濃度對纖維素酶水解玉米芯渣的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨底物質(zhì)量濃度的增加，葡萄糖質(zhì)量濃度也隨之增加，但葡萄糖得率呈現(xiàn)下降趨勢。質(zhì)量濃度為150 g/L的玉米芯渣酶解72 h后，葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到106.65 g/L，與50 g/L玉米芯渣相比，葡萄糖質(zhì)量濃度升高了2.74倍，但葡萄糖得率由50 g/L玉米芯渣的96.88%下降到150 g/L玉米芯渣的87.95%。因此，增加玉米芯渣質(zhì)量濃度雖然提高了葡萄糖的質(zhì)量濃度，但降低了葡萄糖的得率。這是由于纖維素酶的可及性下降以及傳質(zhì)受限，影響了高底物質(zhì)量濃度的纖維素酶水解[15]。高底物質(zhì)量濃度酶水解提高了葡萄糖質(zhì)量濃度，為后續(xù)的米根霉發(fā)酵提供充足的碳源，進(jìn)而獲得較高的富馬酸質(zhì)量濃度。

圖1 不同質(zhì)量濃度玉米芯渣72 h纖維素酶水解Fig. 1 The 72 h enzymatic hydrolysis of corncob residueat different substrate loadings

2.2 不同質(zhì)量濃度玉米芯渣對米根霉同步糖化發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的影響

以不同質(zhì)量濃度的玉米芯渣(50，100和150 g/L)為碳源米根霉SSF產(chǎn)富馬酸的結(jié)果如表2所示。由于高底物質(zhì)量濃度限制纖維素酶水解，因此100和150 g/L玉米芯渣SSF過程中設(shè)置24 h預(yù)酶解。由表2可知，玉米芯渣質(zhì)量濃度的增加對米根霉SSF產(chǎn)富馬酸影響較大。玉米芯渣質(zhì)量濃度為100 g/L時(shí)，富馬酸質(zhì)量濃度最高，為20.22 g/L；進(jìn)一步增加底物質(zhì)量濃度，富馬酸質(zhì)量濃度下降，體系中殘留較多葡萄糖，說明玉米芯渣質(zhì)量濃度高于100 g/L不利于米根霉SSF產(chǎn)富馬酸。米根霉為好氧發(fā)酵菌株，高玉米芯渣質(zhì)量濃度降低了同步糖化發(fā)酵效率，限制氧氣的傳質(zhì)，增加體系的黏度，不利于微生物同步糖化發(fā)酵產(chǎn)有機(jī)酸[15]。因此，選擇100 g/L玉米芯渣質(zhì)量濃度開展后續(xù)SSF研究。

表2 玉米芯渣質(zhì)量濃度對同步糖化發(fā)酵的影響Table 2 Effects of different solid loadings on simultaneous saccharification and fermentation

2.3 以玉米芯渣為碳源米根霉同步糖化發(fā)酵產(chǎn)富馬酸

米根霉分別以50和100 g/L的玉米芯渣SSF產(chǎn)富馬酸，結(jié)果如圖2所示。由圖2a可見，50 g/L玉米芯渣SSF發(fā)酵12 h后進(jìn)入快速產(chǎn)酸期，48 h時(shí)富馬酸質(zhì)量濃度達(dá)到最高值，說明低玉米芯渣質(zhì)量濃度有利于SSF較快生產(chǎn)富馬酸。由圖2b可見，發(fā)酵18 h時(shí)，發(fā)酵液中沒有富馬酸積累，隨后發(fā)酵液中開始積累富馬酸；但葡萄糖質(zhì)量濃度表現(xiàn)為直線下降趨勢。米根霉為非生長耦聯(lián)型的產(chǎn)有機(jī)酸機(jī)制，米根霉菌體生長結(jié)束后開始分泌富馬酸[16]。SSF至72 h時(shí)，富馬酸的質(zhì)量濃度達(dá)到最高值28.65 g/L，是50 g/L玉米芯渣SSF(圖2a)中富馬酸質(zhì)量濃度的1.95倍。在100 g/L玉米芯渣SSF中，玉米芯渣轉(zhuǎn)化富馬酸的得率為14.33%，與50 g/L玉米芯渣SSF的14.72%接近。高玉米芯渣質(zhì)量濃度SSF由于體系的高黏度及限制傳質(zhì)，延遲了米根霉生產(chǎn)富馬酸。同時(shí)，在高玉米芯渣質(zhì)量濃度SSF過程中，主要副產(chǎn)物乙醇的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在48 h時(shí)達(dá)到最高值6.7 g/L，隨后緩慢降低；在50 g/L玉米芯渣SSF中，副產(chǎn)物乙醇質(zhì)量濃度表現(xiàn)為先積累后穩(wěn)定的趨勢，發(fā)酵結(jié)束時(shí)乙醇質(zhì)量濃度為3.93 g/L。乙醇質(zhì)量濃度的差異進(jìn)一步說明高玉米芯渣質(zhì)量濃度SSF體系內(nèi)形成復(fù)雜的氣-液-固多相體系，限制體系內(nèi)的傳質(zhì)[17]，特別是氧氣的傳質(zhì)，使之呈現(xiàn)“假厭氧環(huán)境”，導(dǎo)致乙醇質(zhì)量濃度的增加，但隨后體系內(nèi)玉米芯渣質(zhì)量濃度的降低緩解了氧傳質(zhì)問題，表現(xiàn)為乙醇質(zhì)量濃度下降。

圖2 玉米芯渣同步糖化發(fā)酵產(chǎn)富馬酸、乙醇和葡萄糖歷程Fig. 2 Changes of fumaric acid, ethanol and glucose during simultaneoussaccharification and fermentation of corncob residue

2.4 米根霉殼聚糖性能表征

2.4.1 脫乙酰度

米根霉殼聚糖的脫乙酰度采用酸堿滴定法測定，脫乙酰度的結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，滴定前，殼聚糖溶液中含有過量的HCl，過量的HCl使用NaOH溶液滴定至中性，該過程中由于氫離子的大量減少導(dǎo)致電導(dǎo)率急劇下降。繼續(xù)加入NaOH溶液，NaOH與殼聚糖鹽酸反應(yīng)，鈉離子與氯離子的增加又使得電導(dǎo)率開始上升，出現(xiàn)電導(dǎo)率第一次躍升。當(dāng)NaOH與殼聚糖鹽酸反應(yīng)結(jié)束后，繼續(xù)滴定NaOH溶液，電導(dǎo)率隨NaOH體積的增加再一次快速上升，出現(xiàn)第二次躍升[9]。兩次電導(dǎo)率躍升對應(yīng)的NaOH體積之差，可根據(jù)如下公式計(jì)算米根霉殼聚糖的脫乙酰度：

式中：m為殼聚糖質(zhì)量，g；V為兩次電導(dǎo)率躍升對應(yīng)的0.05 mol/L NaOH體積之差。

由圖3數(shù)據(jù)計(jì)算可得，米根霉殼聚糖的脫乙酰度為90%，這與曾哲靈等[18]從乳酸發(fā)酵后米根霉廢菌體中提取的米根霉殼聚糖脫乙酰度相一致。

圖3 米根霉殼聚糖脫乙酰度測定Fig. 3 Determination of deacetylation degree ofR. oryzae chitosan

2.4.2 黏 度

分別將商品殼聚糖和米根霉殼聚糖溶解于質(zhì)量濃度為20 g/L的乙酸溶液，配制成20 g/L殼聚糖溶液，采用流變儀測定不同剪切速率下商品殼聚糖與米根霉殼聚糖溶液的黏度，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，商品殼聚糖的黏度隨剪切速率的增大而平緩降低。而米根霉殼聚糖的黏度較小，且保持在恒定值，剪切速率的增大并未影響米根霉殼聚糖溶液的黏度。剪切速率上升至3 000 s-1時(shí)，商品殼聚糖的黏度保持為70 mPa·s左右，而米根霉殼聚糖溶液的黏度一直為2 mPa·s左右。在以往研究中，Pochanavanich等[19]從米根霉菌體中提取的殼聚糖黏度明顯低于商品殼聚糖黏度。Kleekayai等[20]提取的米根霉殼聚糖黏度僅為3.1～6.1 mPa·s。本研究中米根霉殼聚糖溶液的黏度較低。

圖4 不同剪切速率下的米根霉殼聚糖溶液的黏度Fig. 4 Viscosity of R. oryzae chitosan at differentshear rates

2.4.3 分子量

采用Ultrahydrogel TM 2000、TM 250和TM 120三柱串聯(lián)測定商品殼聚糖和米根霉殼聚糖的分子量。采用不同相對分子量的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程，將商品殼聚糖和米根霉殼聚糖的洗脫體積代入方程，求得米根霉殼聚糖的重均分子量和數(shù)均分子量分別2 578和1 532 u，分子量分散系數(shù)為1.68；商品殼聚糖的重均分子量和數(shù)均分子量分別70.2和53.5 ku，分子量分散系數(shù)為1.31。米根霉殼聚糖的分子量顯著低于商品殼聚糖的分子量。產(chǎn)富馬酸米根霉殼聚糖的低分子量導(dǎo)致米根霉殼聚糖溶液表現(xiàn)為低黏度性質(zhì)。

3 結(jié) 論

以玉米芯為碳源，米根霉同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸，并采用堿法從米根霉菌體中提取真菌殼聚糖。米根霉以100 g/L玉米芯渣為碳源同步糖化發(fā)酵，富馬酸質(zhì)量濃度達(dá)到28.65 g/L，是50 g/L玉米芯渣的同步糖化發(fā)酵過程中富馬酸質(zhì)量濃度的1.95倍。高玉米芯渣質(zhì)量濃度同步糖化發(fā)酵顯著提高富馬酸產(chǎn)量。采用堿法提取米根霉殼聚糖實(shí)現(xiàn)對米根霉廢棄菌體的再利用。獲得的米根霉殼聚糖脫乙酰度為90%，重均分子量和數(shù)均分子量分別2 578和1 532 u。米根霉殼聚糖的低分子量導(dǎo)致米根霉殼聚糖溶液的低黏度特性。本研究結(jié)果為木質(zhì)纖維原料生物法聯(lián)產(chǎn)富馬酸和真菌殼聚糖提供成本較低的新途徑。

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Co-productionoffumaricacidandfungalchitosanfromcorncobbysimultaneoussaccharificationandfermentationwithRhizopusoryzae

LI Xin, GU Ximei

(Jiangsu Co-Innovation Center of Efficient Processing and Utilization of Forest Resources,College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

The co-production of fumaric acid and fungal chitosan based on the simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of alkali-treated corncob residues was investigated at high solid loading. Cellulase hydrolysis with a higher corncob substrate concentration resulted in a higher substrate concentration of glucose, which was benefit for the production of fumaric acid byRhizopusoryzae. The SSF at 100 g/L substrate concentration of corncob byR.oryzaecould produce 28.65 g/L of fumaric acid, which was 1.95 times than that from SSF at 50 g/L substrate concentration. After SSF, fungal chitosan was prepared fromR.oryzaebiomass by alkaline process. The deacetylation degree ofR.oryzaechitosan was 90%. The viscosity ofR.oryzaechitosan (20 g/L) was 2 mPa·s. Weight-average molecular weight and number-average molecular weight ofR.oryzaechitosan were 2 578 u and 1 532 u, respectively, measured by gel chromatography. The results of this study can provide a cost-effective approach for co-production of fumaric acid and fungal chitosan by SSF usingR.oryzaefrom lignocellulosic materials.

Rhizopusoryzae; simultaneous saccharification and fermentation; lignocellulosic materials; co-production; fumaric acid; chitosan

2017-04-22

2017-06-22

江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(14KJA220003)；江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(BF2015007)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)。

李鑫，男，副教授，研究方向?yàn)樯锘ぁ-mail:xli@njfu.edu.cn

TQ35

A

2096-1359(2017)06-0097-06