參芍口服液對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子GRP78、PERK及CHOP表達(dá)的影響

遠(yuǎn)迪 ，董云朋 ，曾招軍 ，黃安靜 ，張春來 ，周洪霞

（1.華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000；2.河北省唐山工人醫(yī)院 心內(nèi)四科，河北 唐山 063000）

參芍口服液對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子GRP78、PERK及CHOP表達(dá)的影響

遠(yuǎn)迪1，董云朋1，曾招軍1，黃安靜1，張春來2，周洪霞2

（1.華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000；2.河北省唐山工人醫(yī)院 心內(nèi)四科，河北 唐山 063000）

目的觀察參芍口服液對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性因子GRP78、PERK及CHOP表達(dá)的影響。方法將30只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Sham組）、模型組（DN組）和參芍口服液組（SS組）。DN組和SS組予以高脂飼料加鏈脲佐菌素腹腔注射復(fù)制糖尿病腎病模型。SS組每日1次給予參芍口服液（250 mg/kg）灌胃，Sham組和DN組每日1次給予等劑量的蒸餾水灌胃。12周后檢測(cè)各組血糖、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）及24 h尿蛋白定量（PRO）；HE染色光鏡下觀察大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)改變；Western blot檢測(cè)大鼠腎組織GRP78、PERK及CHOP蛋白表達(dá)情況；TUNEL染色檢測(cè)大鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果DN組血糖、BUN、Scr及PRO與Sham組相比均增高，SS組血糖、BUN、Scr及PRO與DN組相比均降低（P＜0.05）。HE發(fā)現(xiàn)Sham組大鼠腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚，未見異常；DN組可見腎小球體積增大，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球系膜基質(zhì)區(qū)增生，腎小管基底膜增厚，部分腎小球、腎小管出現(xiàn)纖維化；SS組腎組織病理形態(tài)變化輕于DN組。Western blot發(fā)現(xiàn)DN組腎臟組織GRP78、PERK及CHOP蛋白表達(dá)高于Sham組，SS組腎組織GRP78、PERK及CHOP蛋白表達(dá)均低于DN組（P＜0.05）。TUNEL發(fā)現(xiàn)DN組較Sham組腎臟組織存在更多細(xì)胞凋亡；SS組凋亡細(xì)胞少于DN組。結(jié)論參芍口服液可減輕糖尿病腎病大鼠腎臟病理?yè)p害，延緩腎功能減退，具有腎保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子GRP78、PERK及CHOP的表達(dá)及減少腎組織細(xì)胞凋亡有關(guān)。

參芍口服液；糖尿病腎?。粌?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；PERK；大鼠

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者重要的并發(fā)癥之一，DN進(jìn)展為慢性腎衰竭的比例逐年升高，是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因[1-2]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜目前還未明確。近年來發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）與糖尿病腎病的發(fā)生有密切關(guān)系[3]。研究表明[4]，高血糖可誘發(fā)ERS，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在DN發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是DN的重要發(fā)病機(jī)制。中醫(yī)認(rèn)為“脾腎氣虛，痰瘀阻絡(luò)”是糖尿病腎病發(fā)病的重要原因，研究發(fā)現(xiàn)中藥在DN的早期防治有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可使糖尿病腎病的進(jìn)展得到有效延緩[5-6]。參芍口服液是復(fù)方制劑，具備活血化瘀、益氣通絡(luò)之功效，以丹參、黃芪、赤芍及水蛭等主要成分精制而成[7]。研究已明確，參芍口服液可通過抑制DN病變過程中炎癥因子的表達(dá)，改善糖尿病大鼠早期腎臟損害的作用。但參芍口服液是否能通過對(duì)糖尿病腎病內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響發(fā)揮對(duì)腎功能的保護(hù)作用及作用機(jī)制目前尚不明確。本文從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的角度，研究觀察參芍口服液對(duì)糖尿病腎損害大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性因子GRP78、PERK及CHOP表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡30只健康Wistar雄性大鼠，無特定病原體（SPF）級(jí)，體重120～160 g；由華北理工大學(xué)動(dòng)物中心提供（環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)：028）。

1.2 藥物與試劑

參芍口服液（唐山市工人醫(yī)院制劑室，批號(hào)：Z20050957）藥物成份：丹參 250 g，黃芪 250 g，赤芍150 g，當(dāng)歸 150 g，川芎 75 g，桃仁 125 g，紅花 75 g，水蛭187.5 g，地龍250 g，清半夏125 g。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國(guó) Sigma公司），血糖儀及血糖試紙（美國(guó)強(qiáng)生公司），免疫印跡試劑盒（上海碧云天生物公司），兔抗鼠GRP78抗體（美國(guó)Abcam公司），兔抗鼠PERK抗體及CHOP抗體（美國(guó)Abcam公司），TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)ROCHE公司）。

1.3 動(dòng)物分組及模型復(fù)制

將30大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Sham組）、模型組（DN組）、參芍口服液組（SS組），各10只，Sham組以普通飼料喂養(yǎng)，DN組和SS組采用高脂飼料喂養(yǎng)。DN組和SS組禁食12 h后，予以一次性STZ（25 mg/kg）腹腔注射制備糖尿病腎病模型，分別于第2、3及14天，連續(xù)3次監(jiān)測(cè)血糖≥16.7 mmol/L，并伴有多飲、多尿、多食，收集尿液測(cè)尿糖為+++、++++（強(qiáng)陽(yáng)性），24 h尿蛋白定量 ＞30 mg/24 h，為造模成功。造模過程中，DN組和SS組各有1只大鼠血糖不符合模型標(biāo)準(zhǔn)和各有1只大鼠死亡，均被剔除。最終共26只大鼠（Sham組10只、DN組8只、SS組8只）納入實(shí)驗(yàn)。

1.4 藥物干預(yù)

造模后各組大鼠灌胃給藥，SS組大鼠每天1次250 mg/kg參芍口服液灌胃，Sham組和DN組每天1次等劑量的蒸餾水灌胃，共12周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 血糖及腎功能指標(biāo)檢測(cè) 于給藥12周用代謝籠采集大鼠24 h尿液，腹主動(dòng)脈取血3 ml，監(jiān)測(cè)各組大鼠血糖、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）水平、24 h 尿蛋白定量（proteinuria，24 h PRO）。

1.5.2 腎臟組織病理學(xué)檢查 在采集血、尿標(biāo)本后處死各組大鼠，取出腎組織，一部分制作成石蠟塊，另一部分標(biāo)本置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。將石蠟塊包埋的腎組織切成4μm厚度切片，進(jìn)行HE染色，按常規(guī)脫蠟，經(jīng)蘇木素染色、返藍(lán)、伊紅染色、再經(jīng)乙醇、二甲苯?jīng)_洗及封片等步驟。顯微鏡下觀察腎組織病理學(xué)改變。

1.5.3 腎組織GRP78、PERK及CHOP蛋白水平表達(dá)的檢測(cè) 應(yīng)用Western blot法，將腎組織取出，提取蛋白，取樣品蛋白加入上樣緩沖液，放到電泳槽上進(jìn)行凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，封閉，再分別加入一抗GRP78、PERK及CHOP抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗對(duì)其進(jìn)行孵育，洗膜，最后用生物凝膠圖像分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行蛋白定量分析，以目的條帶與GAPDH條帶的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5.4 大鼠腎臟細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè) 將腎組織石蠟塊包埋后切片，進(jìn)行TUNEL染色，按試劑盒說明書進(jìn)行操作過程，經(jīng)過烤片、脫蠟、孵育、沖洗、顯色、細(xì)胞核復(fù)染及封片等步驟，顯微鏡下觀察腎組織細(xì)胞凋亡情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 參芍口服液對(duì)血糖及腎功能的影響

DN 組的血糖、BUN、Scr、24 h PRO 水平與 Sham組相比均增高（P＜0.05），SS組上述指標(biāo)的水平均低于DN組（P＜0.05），見附表。

附表 各組大鼠血糖、及腎功能指標(biāo)比較 （±s）

附表 各組大鼠血糖、及腎功能指標(biāo)比較 （±s）

注：1）與 Sham 組比較，P ＜0.05；2）與 SS組比較，P ＜0.05

組別 血糖/（mmol/L）BUN/（mmol/L）Scr/（μmol/L）24 h PRO/（mg/d）Sham 組 7.72±0.38 8.38±0.80 51.38±1.09 19.34±1.16 DN 組 26.90±1.021） 18.15±0.871） 76.55±1.191） 47.54±2.401）SS 組 22.38±0.552） 15.71.±0.812） 64.75±1.712） 39.88.±1.172）F值 1 982.617 348.692 798.807 719.420 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 參芍口服液對(duì)腎組織病理形態(tài)學(xué)改變的影響

HE染色示，Sham組可見大鼠腎組織結(jié)構(gòu)清楚未見明顯異常；DN組可見大鼠腎小球體積明顯增大及大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球系膜基質(zhì)及細(xì)胞外基區(qū)質(zhì)增生，腎小管基底膜變厚，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性及管腔炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分腎小球、腎小管纖維化；SS組與DN組相比腎小球及腎小管病理變化明顯減輕。見圖1。

2.3 參芍口服液對(duì)大鼠腎組織GRP78、PERK及CHOP蛋白水平表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果示，DN組腎組織 GRP78、PERK和CHOP蛋白表達(dá)水平比Sham組增加（P＜0.05）；與 DN 組比較，SS組腎組織 GRP78、PERK 和CHOP蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖2。

2.4 參芍口服液對(duì)大鼠腎組織細(xì)胞凋亡變化的影響

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變 （HE×400）

圖2 各組大鼠腎組織GRP78、PERK、CHOP的表達(dá) （Western blot法檢測(cè)）

TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況，顯微鏡下觀察顯示，TUNEL染色定位于細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞核呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，正常細(xì)胞核顯色為藍(lán)色。Sham組大鼠腎組織細(xì)胞可見少量凋亡細(xì)胞；與Sham組比較，DN組大鼠腎組織可見腎小球和腎小管均有大量凋亡細(xì)胞；SS組較DN組凋亡細(xì)胞減少。見圖3。

3 討論

糖尿病腎病是以蛋白尿和腎功能逐漸下降為主要臨床表現(xiàn)，成為導(dǎo)致糖尿病患者死亡的重要原因，臨床尚未有明確有效的治療方法，近年來對(duì)其發(fā)病機(jī)制及防治方法的研究成為人們研究的焦點(diǎn)[8]。大量的臨床實(shí)踐研究發(fā)現(xiàn)，以益氣活血化瘀為理念，中藥在改善DN的臨床癥狀、延緩腎功能下降等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[9-10]。參芍口服液是以活血化瘀為治療原則，兼以補(bǔ)氣通絡(luò)為法以丹參、黃芪、川芎、地龍及水蛭等為主要成分研究而成的中藥復(fù)方制劑，具備活血化瘀、抗氧化應(yīng)激和抑制纖維化等作用[7，11]，參芍口服液符合中醫(yī)治療本虛標(biāo)實(shí)慢性腎病病變以補(bǔ)氣活血為主的理論。參芍口服液已被證明具有抑制炎癥因子表達(dá)，減輕腎臟纖維化，改善腎功能作用。因此推測(cè)參芍口服液可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少腎臟細(xì)胞的凋亡，改善DN腎功能從而起腎保護(hù)作用。

目前，愈來愈多的研究證明[3,12]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡可能是導(dǎo)致糖尿病腎病的重要機(jī)制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成轉(zhuǎn)運(yùn)的重要場(chǎng)所，在受到外界因素的影響下，蛋白質(zhì)的正確折疊受到干擾，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被打破失衡，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。適度的ERS可以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)；過度的ERS就會(huì)啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上3種跨膜蛋白：跨膜蛋白激酶1（IRE1）、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣激酶（PERK）和活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）介導(dǎo)的3條信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。腎臟細(xì)胞具有豐富而復(fù)雜的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，高血糖和蛋白尿是誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要因素，因此，糖尿病時(shí)腎臟細(xì)胞極易發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，長(zhǎng)期高血糖和蛋白尿引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的3種膜蛋白介導(dǎo)的凋亡途徑被上調(diào)激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，造成腎臟細(xì)胞大量凋亡[12]。魏靜[4]等發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病小鼠腎功能的惡化與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的腎臟細(xì)胞的凋亡可能有密切關(guān)系，證實(shí)持續(xù)存在的ERS參與DN的發(fā)生且細(xì)胞凋亡可能是DN腎功能減退的重要因素。

GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中是一個(gè)重要的分子伴侶蛋白，屬于熱休克蛋白家族成員，大量研究顯示他在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)疾病中大量表達(dá)，GRP78被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生和存在的標(biāo)志蛋白[8]。FUKAMI等[13]發(fā)現(xiàn)，AGEs引起大鼠足細(xì)胞GRP78表達(dá)上調(diào)，誘發(fā)ERS，通過一系列反應(yīng)激活凋亡基因?qū)е伦慵?xì)胞凋亡。PERK通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最重要的通路，也是ERS時(shí)最先啟動(dòng)的通路[14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，GRP78從PERK上解離大量表達(dá)，PERK通過自身磷酸化激活，進(jìn)一步激活下游的一系列反應(yīng)上調(diào)活化轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4），進(jìn)而激活生長(zhǎng)停滯及損傷基因（CHOP）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。CHOP是介導(dǎo)ERS介導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵蛋白也是ERS的一個(gè)重要中間信號(hào)分子，可被多個(gè)通路激活，PERK/ATF4是其表達(dá)的主要通路。陳玉鳳等[3]發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病小鼠腎組織GRP78、PERK表達(dá)水平提高，CHOP轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，并伴有腎小球硬化。敲除CHOP基因后小鼠上述指標(biāo)表達(dá)降低，腎臟病變減輕。NIE等[5，10]研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)的大鼠糖尿病模型中存在細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，并且在腎小球和腎小管部位的GRP78表達(dá)量增加，和CHOP呈正相關(guān)。本研究結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠出現(xiàn)大量蛋白尿，血糖、BUN及Scr水平升高及腎小球體積增大及大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球系膜基質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)區(qū)增生，腎小管基底膜增厚及上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分腎小球和腎小管出現(xiàn)纖維化等糖尿病腎病表現(xiàn)；大鼠腎組織GRP78、PERK及CHOP蛋白水平表達(dá)升高，腎組織出現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡。提示糖尿病大鼠腎臟處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，GRP78表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而通過PERK/ATF4通路激活CHOP基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。參芍口服液組大鼠血糖、BUN及Scr水平降低，24 h PRO下降，大鼠腎臟病理?yè)p害及腎功能得到改善，腎組織GRP78、PERK及CHOP蛋白水平表達(dá)降低及腎組織細(xì)胞凋亡減少。提示參芍口服液可能通過下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78、PERK蛋白的表達(dá)，進(jìn)而減少CHOP基因的激活，減輕糖尿病腎病大鼠腎組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抑制腎臟細(xì)胞凋亡，延緩腎功能減退發(fā)揮腎保護(hù)作用，從而起到延緩DN的發(fā)生、發(fā)展的作用。

綜上所述，參芍口服液能夠降低糖尿病大鼠血糖和蛋白尿，提高腎功能，延緩糖尿病腎病的進(jìn)程，其機(jī)制可通過抑制大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及減少腎組織細(xì)胞凋亡有關(guān)，為臨床早期防治糖尿病腎病提供新思路和其臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（王榮兵 編輯）

Effect of Shenshao oral liquid on expression of GRP78,PERK and CHOP in rat models of diabetic nephropathy

Di Yuan1,Yun-peng Dong1,Zhao-jun Zeng1,An-jing Huang1,Chun-lai Zhang2,Hong-xia Zhou2
(1.North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China;2.Tangshan Workers'Hospital,Tangshan,Hebei 063000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Shenshao oral liquid on expression of endoplasmic reticulum stress factors GRP78,PERK and CHOP in rat models of diabetic nephropathy.MethodsA total of 30 healthy male Wistar rats were randomly divided into Sham group,model group (DN group)and Shenshao oral liquid group (SS group).Animals in DN group and SS group were fed with high fat diet in addition to intraperitoneal injection of streptozotocin.Rats in SS group were administrated with Shenshao oral liquid(250 mg/kg)daily,and distilled water were administered daily into rats from Sham group and DN group.Blood glucose,blood urea nitrogen (BUN),creatinine (Scr)and 24-hour urinary protein (PRO)were measured 12 weeks post insults.Histopathological changes in renal tissue were graded through HE staining.Expression levels of GRP78,PERK and CHOP in kidney were measured by Western blot.Apoptosis rate were determined by TUNEL staining.ResultsBlood glucose,BUN,Scr and PRO in rats from DN group were significantly increased compared with Sham group(P＜0.05),which were attenuated with treatment of Shenshao oral liquid(P＜0.05).HE staining showed that morphological abnormality was observed in DN group including enlarged glomerular volume,inflammatory cell infiltration,glomerular mesangial stromal hyperplasia,tubular basement membrane thickening,and glomerular and tubular fibrosis.Above histopathological deterioration of renal tissue was significantly ameliorated by treatment of Shenshao oral liquid (P＜0.05).Western blot showed that the expression levels of GRP78,PERK and CHOP in renal tissue of DN group were significantly increased when compared with Sham group,which was decreased in SS group.TUNEL staining manifested that increased apoptosis rate in DN group (P＜0.05)in comparison with Sham group could be attenuated in SS group (P＜0.05).ConclusionsShenshao oral liquid reduces development of diabetic nephropathy,restoring renal function in dependence of manipulation on endoplasmic reticulum stress related factors GRP78,PERK,CHOP and apoptosis.

shenshao oral liquid;diabetic nephropathy;endoplasmic reticulum stress;apoptosis

R587.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.005

1005-8982（2017）27-0022-05

2017-04-11

張春來，E-mail：zcl1290@163.com；Tel：15930458965