眼遺傳病的分子診斷

吳繼紅

很多原發(fā)性的眼科疾病是遺傳性的，目前已知眼科疾病中與遺傳相關的有600余種。臨床上常見的有視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)、視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、青光眼、黃斑變性、先天性白內障(congenital cataract，CC)、Leber先天性黑矇(Leber congenital amaurosis，LCA)、Leber遺傳性視神經病變(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(familial exudative vitreoretinopathy，F(xiàn)EVR)、高度近視、角膜營養(yǎng)不良、先天性無虹膜。此外，還有上瞼下垂、斜視、小眼球及無眼球等。根據遺傳方式可分為4種主要類型:常染色體顯性遺傳病、常染色體隱性遺傳病、性染色體連鎖遺傳病和線粒體遺傳病。眼遺傳病的分子基因學表現(xiàn)多樣［1-2］:有些是單基因遺傳病，單個基因突變就足以致病，如RB，其致病基因為RB1;另外一些屬多基因遺傳病，由多個基因、多個環(huán)境因子以及這些因子相互作用而致病，如RP、CC、青光眼等。一些常用的眼遺傳病致病基因網站見表1。

表1 常用的眼遺傳病致病基因網站

大部分眼遺傳病存在遺傳異質性，而且通過對不同地域或民族之間的比較發(fā)現(xiàn)，很多眼遺傳病致病基因的突變位點和表型有較大差異，這為眼遺傳病的分子基因學研究帶來了很大困難。近年來，隨著基因分析技術的快速發(fā)展，很多與眼遺傳病相關的致病基因或致病突變位點被相繼報道，這些已知的致病突變位點可作為基因標記，用于眼遺傳病的臨床基因診斷、癥狀前診斷和產前診斷。

眼遺傳病的及時有效診斷、治療對改善患者的生活質量有著重要意義。分子診斷是診斷眼遺傳病不可缺少的手段和方法之一，不僅可通過確定發(fā)病基因來加深對疾病分子機制的理解，還可提供多種有效信息，有助于臨床診斷和治療、預測患者的病情進展及預后、發(fā)現(xiàn)無癥狀的攜帶者及癥狀前診斷。然而，目前國內對眼遺傳病的分子基因學研究較少，眼遺傳病的分子診斷也才剛剛起步，尚未建立起較規(guī)范和完善的眼遺傳病分子診斷體系。

在此，我們以RB、RP等臨床上常見的眼遺傳病為例，介紹眼遺傳病基因標記、分子診斷的常用技術，并討論如何建立眼遺傳病分子診斷服務。

1 常見眼遺傳病的基因標記

一些常見眼遺傳病的致病基因和基因標記見表2。

表2 常見眼遺傳病的致病基因和基因標記

1.1 RB RB是兒童中最常見的眼內惡性腫瘤，我國每年新病例約1000例，占全世界每年新病例的20%左右，其中30% ～40%是屬于遺傳性型。RB是單基因遺傳病，多為常染色體顯性遺傳，致病基因為RB1［3］。RB發(fā)病需要2次基因突變或發(fā)生表觀遺傳學改變［4-5］。第1次基因突變可發(fā)生于體細胞，也可發(fā)生于親代生殖細胞。如果第1次突變發(fā)生于親代生殖細胞則是遺傳性的，有早發(fā)、多發(fā)的特點，而且其他組織產生第二腫瘤的可能性較高［6］。

1.2 RP RP是一組以視網膜光感受器進行性退變?yōu)樘卣鞯漠愘|性遺傳病。臨床癥狀包括夜盲、視野變窄，最終導致失明，發(fā)病率約為1/3500［7］。RP的遺傳方式多樣，15% ～20%的患者是常染色體顯性遺傳，20%～25%的患者是常染色體隱性遺傳，10% ～15%的患者是X染色體連鎖遺傳，剩下的40% ～55%的患者是散發(fā)的［8］。大部分RP是單基因致病，但也有雙基因致病的［9-10］;還有報道線粒體DNA突變可能也與RP 相關［11］。

據報道［12］，至少有40個基因座與非綜合征RP相關，其中已發(fā)現(xiàn)的致病基因超過60個。常染色體顯性遺傳的RP患者中，超過25%的致病基因為Rhodopsin(RHO)，6% ～8%的致病基因為RP1［13］。約70%的X染色體連鎖遺傳RP患者的致病基因為Retinitis pigmentosa GTPase regulator(RPGR)［14］。

1.3 青光眼 青光眼是以視杯擴大和視野缺損為特征的異質性遺傳病，也是很常見的致盲性眼病。其中以原發(fā)性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)最為常見，約占50%［15］，在40歲以上人群中的發(fā)病率約為2%［16］。早發(fā)性POAG是常染色體顯性遺傳病，發(fā)病早且癥狀較重［17］。原發(fā)性先天性青光眼(primary congenital glaucoma，PCG)是常染色體隱性遺傳病，多發(fā)于3歲以內的嬰兒，是另一種重癥青光眼［18］。

青光眼的發(fā)病機制尚不清楚。研究［12］發(fā)現(xiàn)，有4個基因座與PCG相關，而至少有15個基因座與POAG相關，其中已定位致病基因的有 GLC1A(myocilin，MYOC)［19］，GLC1E(optineurin，OPTN)［20］，GLC1G(WD repeatdomain 36， WDR36)［21］， GLC3A(cytochrome P4501B1，CYP1B1)［22］，GLC3D(latent transforming growth factor β binding protein 2，LTBP2)［23-24］。據報道，2% ～4%的歐美POAG患者有MYOC 基因突變［25-26］，而 1.1% ～1.8%的中國 POAG患者發(fā)現(xiàn)該基因突變［27-28］。約16.7%的遺傳性POAG患者和12%的散發(fā)性POAG患者有OPTN基因突變［20］，而1% ～1.6%的中國POAG患者中發(fā)現(xiàn)該基因突變［29］。超過5%的 POAG患者有 WDR36基因突變［21，30］。48%的法國 PCG患者中發(fā)現(xiàn) CYP1B1基因突變［31］，而只有20%的日本患者中存在該基因突變［32］。另外，在早發(fā)性POAG中也發(fā)現(xiàn)了CYP1B1基因突變［33］，而 MYOC 基因突變可能與 PCG 相關［34-35］。

1.4 CC CC是一組以晶狀體代謝異常為特征的異質性遺傳病，臨床癥狀表現(xiàn)為從出生就發(fā)生白內障，進行性影響視力甚至致盲。發(fā)病率為1/10000～8/10000，其中約1/4與遺傳相關。主要是常染色體顯性遺傳，也有少數是常染色體隱性遺傳或X染色體連鎖遺傳。目前已報道的致病基因至少有29個［36-38］。

2 眼遺傳病分子診斷的常用技術

眼遺傳病分子診斷最常用的技術是基因全長測序，優(yōu)點是基因突變的檢出率較高，缺點是耗時。如果已知致病基因存在突變熱點，則可以先通過一些簡單的方法檢測，如限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，單鏈構象多態(tài)性(single-strand conformational polymorphism，SSCP)［46］等。如果致病基因中存在大片段的缺失或插入，可以用多重連接探針擴增技術(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)對DNA序列進行定性和半定量分析［47］。甲基化特異性多重連接探針擴增技術(methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification，MS-MLPA)還可以對基因啟動子區(qū)的甲基化程度進行定性和半定量分析［48］。如果DNA檢測沒有發(fā)現(xiàn)突變，則需要提取RNA進行全長測序，檢測是否存在內含子剪接突變或大片段重排［49］。通過熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測RNA水平，可以反映基因表達的變化。

目前，眼遺傳病的分子診斷主要局限于DNA檢測。然而，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)蛋白功能、信號通路和基因調節(jié)在眼遺傳病發(fā)病機制中的地位越來越重要，因此，分子診斷的內容和技術也將相應發(fā)生改變。

3 眼遺傳病分子診斷體系

眼遺傳病分子診斷的流程如圖1所示。

圖1.眼遺傳病分子診斷流程圖

3.1 基因診斷 患者就診，經臨床診斷后，或同家屬一起接受基因檢測。經過檢查前宣教，向患者及其家屬解釋基因檢測的優(yōu)缺點，解決潛在的倫理問題。受檢查者或其合法監(jiān)護人簽署知情同意書。由醫(yī)護人員抽取受檢查者的外周血，至于抗凝管中保存，及時抽提DNA或RNA，進行基因檢測。根據檢測結果作出基因診斷。

3.2 風險評估 基因檢測結果可以用于評估疾病風險。風險評估的意義在于趨利避害，指導患者進行個性化健康管理，采取個性化的行為生活方式，提前做好預防和保健工作，最終達到遠離疾病的目的。由于多數常見眼遺傳病屬于多基因遺傳病，而且存在遺傳異質性和地域、民族差異，很難明確各種眼遺傳病致病基因的突變位點和表型間的關系，這為眼遺傳病的風險評估帶來了一定的困難。

運用遺傳學的基本原則可以預測后代遺傳父母突變基因的概率。我們在這里列舉最簡單的例子，單基因的單點突變。如果父母雙方都是同一個基因突變的純合子，那么后代遺傳該突變的概率是100%;如果父母一方是純合子，另一方是雜合子，其后代有50%的可能是純合子，同時有50%的可能是雜合子，但不會有正?；蛐偷暮蟠?如果父母雙方都是雜合子，其后代有25%的可能是純合子，50%的可能是雜合子，還有25%的可能是正常基因型;如果父母一方正常，另一方是雜合子，其后代有50%的可能是雜合子，同時有50%的可能是正常的。

在進行風險評估時還要考慮到疾病的遺傳方式，隱性遺傳病的雜合子是沒有臨床癥狀的攜帶者，而顯性遺傳病的雜合子也會出現(xiàn)顯著的臨床癥狀。線粒體遺傳屬于母系遺傳，母親的線粒體基因突變幾乎100%遺傳給后代，而父親的線粒體基因突變則不會遺傳給后代。

3.3 基因咨詢 基因咨詢是眼遺傳病分子診斷必需的一步。在對患者或其家屬進行基因咨詢前，需要先得到基因檢測結果，并明確基因型和表型的對應關系和疾病的遺傳方式?；蜃稍兛梢詾闇矢改柑峁┭圻z傳病的基因信息，并幫助他們確定將這些疾病遺傳給孩子的可能性。

有些基因突變并不能直接導致疾病的發(fā)生，而需要和某些特定的環(huán)境因子共同作用誘發(fā)疾病?；蜃稍儾粌H能提前告知檢測對象患病風險的高低，還能提供個性化健康指導服務、個性化用藥指導服務和個性化體檢指導服務。幫助人們在疾病發(fā)生之前進行準確的預防，通過調整膳食營養(yǎng)、改變生活方式、增加體檢頻度、接受早期診治等多種方法，有效避免誘發(fā)疾病的環(huán)境因素［50］。

4 結語

目前，基因檢測還不是醫(yī)院常規(guī)的臨床檢查項目，分子診斷在眼遺傳病的臨床應用更是處于起步階段，但隨著對疾病分子基因學研究的深入和高通量分子診斷技術的不斷發(fā)展，越來越多的眼遺傳病的基因信息將被識別并用于指導臨床預測、預防、診斷和治療。因此，急需建立一個標準的分子診斷程序用于眼遺傳病的致病基因鑒定。在此之前必須先建立一個種族特異性的眼遺傳病數據庫，包括臨床信息、致病基因及突變位點信息、疾病的遺傳方式等，這樣才能保證分子診斷更加安全有效地應用于癥狀前診斷、產前診斷和基因咨詢。

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