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    基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制劑在結(jié)膜松弛癥成纖維細(xì)胞中的表達△

    2013-11-01 03:09:02韓竹梅張興儒柯梅青倪振華符之瑄李青松項敏泓
    中國眼耳鼻喉科雜志 2013年6期
    關(guān)鍵詞:結(jié)膜纖維細(xì)胞蛋白酶

    韓竹梅 張興儒 柯梅青 倪振華 符之瑄 李青松 項敏泓

    結(jié)膜松弛癥(conjunctivochalasis,CCh)是年齡相關(guān)性老年人常見眼病[1],CCh的發(fā)病機制與球結(jié)膜成纖維細(xì)胞功能發(fā)生改變[2-3],球結(jié)膜組織彈力纖維減少,膠原纖維融解[3-4],球結(jié)膜厚度變?。?-6],及球結(jié)膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的表達過強[7],球結(jié)膜成纖維細(xì)胞MMPs與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)表達失衡有關(guān)[8]。MMPs 可降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),TIMPs是特異性MMPs抑制劑,二者共同維持ECM的合成及降解平衡。2012年1~12月通過檢測CCh球結(jié)膜成纖維細(xì)胞中MMPs及TIMPs的表達,旨在進一步探討結(jié)膜松弛癥的發(fā)病機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料 CO2培養(yǎng)箱(SANYO公司,日本),超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司),倒置顯微鏡(WILOVERT公司,德國),低溫高速離心機(Eppendorf公司,德國),酶標(biāo)檢測儀(BIO-RAD公司,美國),DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶溶液(上海博谷生物科技有限公司),成纖維細(xì)胞生長添加物(FGS)(北京裕恒豐生物科技有限公司)。MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3 ELISA試劑盒(上海明睿生物有限公司)。收集上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院眼科手術(shù)室2012年1~12月病例資料。CCh組:隨機選擇CCh手術(shù)切除的松弛結(jié)膜13例(13眼),按照Zhang[9]的分級標(biāo)準(zhǔn),Ⅱ級2眼,Ⅲ級8眼,Ⅳ級3眼,年齡54~82歲,平均(68.08±8.42)歲。正常對照組:為年齡配對的單純白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)的病例16例(16眼),年齡56~85歲,平均(70.14±8.43)歲。均獲得上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)及患者知情同意。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)[10]將切取的球結(jié)膜組織放入準(zhǔn)備好的無菌裝有9 g/L生理鹽水的一次性藥碗內(nèi)漂洗3次,除去血污;用眼科顯微剪刀將其剪成0.5~1 mm2大小組織塊,平鋪于六孔板內(nèi),翻轉(zhuǎn)底朝上放置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察6孔板內(nèi)組織塊近干;翻轉(zhuǎn)6孔板底朝下,緩慢加入3 mL含10%體積胎牛血清和青霉素-鏈霉素、0.1%FGS的DMEM培養(yǎng)液,且勿使組織浮起,繼續(xù)培養(yǎng);每3天換液1次,在倒置相差顯微鏡下觀察接種組織塊貼壁及培養(yǎng)液情況。經(jīng)過倒置顯微鏡對細(xì)胞形態(tài)觀察及免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)對成纖維細(xì)胞特異性蛋白的檢測,鑒定為成纖維細(xì)胞。

    1.2.2 ELISA 檢測細(xì)胞上清液中 MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3的質(zhì)量濃度 選取3~6代呈對數(shù)生長期細(xì)胞,將生長至90%的細(xì)胞消化后,用含10%體積胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,以2.5×105個/mL濃度接種于24孔板中,每孔為l mL。培養(yǎng)24 h后,棄去原培養(yǎng)液,加無血清DMEM培養(yǎng)液,每孔1 mL,每組設(shè)3個復(fù)孔,然后置于37℃,體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)48 h后,收集各孔培養(yǎng)上清液,高速離心機(相對離心力為152×g)離心20 min,取上清液,置于無菌EP管中,分裝后-20℃冷凍保存,用 ELISA 檢測其中 MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3 濃度,按試劑盒說明書操作。用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量各孔的吸光度(A450)OD值,利用標(biāo)準(zhǔn)品OD值及其相對應(yīng)的濃度,以O(shè)D值為橫坐標(biāo),濃度為縱坐標(biāo),作一標(biāo)準(zhǔn)曲線并用公式表現(xiàn)出來,將樣本的OD值代入計算即可得出樣本濃度。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計學(xué)處理采用 SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計,各組檢測指標(biāo)數(shù)據(jù)資料經(jīng)W檢測呈正態(tài)分布,經(jīng)Levene檢驗方差,檢測平均濃度值用以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析,以 P<0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    采用ELISA檢測,得到各個標(biāo)本中MMPs、TIMPs濃度表達。MMP-1的表達:CCh成纖維細(xì)胞的濃度明顯高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.40,P<0.05)。MMP-3的表達:CCh成纖維細(xì)胞的濃度明顯高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.79,P<0.01)。TIMP-1的表達:CCh成纖維細(xì)胞的濃度與正常對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.05,P>0.05)。TIMP-3的表達:CCh成纖維細(xì)胞的濃度明顯低于正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.74,P<0.05)。見表 1。

    表1 兩組成纖維細(xì)胞中MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3濃度比較(,ng/mL)

    表1 兩組成纖維細(xì)胞中MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3濃度比較(,ng/mL)

    注:a示與CCh組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

    MMP-1 MMP-3 TIMP-1 TIMP-3 CCh組組別437.62 ±13.62 0.29 ±0.02 0.48 ±0.00 0.17 ±0.01正常對照組 404.74 ±9.68a 0.15 ±0.02a 0.49 ±0.01 0.19 ±0.00a F值0.40 0.79 1.05 0.74 P值 <0.05 <0.01 >0.05 <0.05

    3 討論

    隨著人口老年化加快,CCh的患病人數(shù)將不斷增多。Zhang等[1,9]報道,60 歲及以上人群中 CCh 患病率為44.08%。近年研究發(fā)現(xiàn)MMPs及TIMPs參與了球結(jié)膜ECM穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié),其功能失調(diào)可能參與了CCh的病理過程[7-8]。

    MMPs是水解ECM的蛋白裂解酶,包括基質(zhì)中以及整合于質(zhì)膜中的各種膠原酶和彈性蛋白酶等,是以ECM成分為水解底物的蛋白酶家系,主要在ECM的降解和重建中起作用。在正常的生理狀態(tài)下,ECM處于不斷產(chǎn)生和降解的動態(tài)平衡中;病理狀態(tài)下,ECM的產(chǎn)生和(或)降解失平衡使其過多堆積 ,從而導(dǎo)致組織病理學(xué)方面的改變,產(chǎn)生相應(yīng)的疾病。

    MMPs主要分為 5 類,其中,膠原酶(MMP-l、8、13)主要降解 I、Ⅱ、Ⅲ型膠原;基質(zhì)降解酶(MMP-3、7、10、11、12)廣泛降解ECM。TIMPs是機體自發(fā)產(chǎn)生的特異性抑制 MMPs功能的一組蛋白質(zhì),目前研究發(fā)現(xiàn)TIMPs的 成 員 有 4 個:TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。它們可下調(diào)MMPs的活性,對于維持ECM的穩(wěn)態(tài)有重要作用。TIMP-1是體內(nèi)MMP-1的天然特異性組織抑制劑,可抑制 MMP-1酶原活化及其活性。TIMP-3是一種結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)的非可溶性蛋白,調(diào)節(jié)MMP-3蛋白水解活性,協(xié)調(diào)ECM的降解與重建。在生理條件下,MMPs和TIMPs之間保持動態(tài)平衡,以確保正常生理功能的進行;但在某些病理條件下,這種生理平衡狀態(tài)被打破,從而對組織表現(xiàn)出極大的破壞力而致病。MMPs和TIMPs表達水平失衡與眼科疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

    李青松等[7]研究顯示CCh球結(jié)膜組織中MMP-1、MMP-3表達較高,MMPs與 TIMPs平衡失調(diào)。Meller等[11]對CCh與正常結(jié)膜的成纖維細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn),CCh組結(jié)膜成纖維細(xì)胞MMP-1和MMP-3過度表達。Li等[8]對正常結(jié)膜和CCh來源的結(jié)膜成纖維細(xì)胞進行培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn),CCh患者成纖維細(xì)胞MMP-1和MMP-3蛋白表達在CCh中明顯增加,分別為正常組的3.5~7.6倍及2.3~13倍。在 CCh中,MMP-3的酶蛋白溶解活性和MMP-1的膠原酶溶解活性增強。這些研究結(jié)果提示MMPs與TIMPs的失衡導(dǎo)致了球結(jié)膜基質(zhì)和Tenon囊的過度降解,而發(fā)生CCh。

    本研究中采用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMPs的表達情況,采用CCh成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法[10],選取3~6代呈對數(shù)期生長的成纖維細(xì)胞,排除了原代培養(yǎng)中可能存在的上皮細(xì)胞。簡單純化了體外實驗的研究環(huán)境,排除了細(xì)胞混雜因素的干擾,直接檢測CCh成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3 的表達。

    本研究中CCh組成纖維細(xì)胞MMP-1、MMP-3呈高表達,表明大部分釋放出胞外,胞內(nèi)貯存的較少,證實了CCh是多種因素導(dǎo)致ECM的改變,使細(xì)胞內(nèi)大部分MMP-1、MMP-3釋放到細(xì)胞外維持ECM的穩(wěn)定。TIMP-1的表達與正常對照組比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義,證實了細(xì)胞內(nèi)外MMP-1/TIMP-1失去平衡。TIMP-3的表達明顯低于正常對照組,釋放到細(xì)胞外的較少,大部分儲存在細(xì)胞內(nèi),證實了細(xì)胞內(nèi)外MMP-3/TIMP-3失去平衡。這些研究結(jié)果提示在CCh中MMP-1的表達水平明顯升高,而TIMP-1并沒有隨之相應(yīng)的升高,同時,MMP-3的表達水平明顯升高,而TIMP-3的表達卻降低,上述球結(jié)膜成纖維細(xì)胞MMPs及TIMPs的病理表達可能參與了CCh的發(fā)生。對于MMPs、TIMPs的表達改變的機制及途徑還需進一步深入的研究。

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