酸堿度對兔肉肌原纖維蛋白功能性質(zhì)的影響

周心雅，賀稚非,2，李洪軍,2*，王兆明

1(西南大學(xué)，食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

酸堿度對兔肉肌原纖維蛋白功能性質(zhì)的影響

周心雅1，賀稚非1,2，李洪軍1,2*，王兆明1

1(西南大學(xué)，食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

研究了不同酸堿度條件對兔肉肌原纖維蛋白功能特性的影響，以及肌原纖維蛋白功能特性指標(biāo)間的相關(guān)性，并通過蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化對其機(jī)理進(jìn)行初探。研究發(fā)現(xiàn)，隨著pH逼近等電點(diǎn)范圍，蛋白質(zhì)內(nèi)部芳香族氨基酸不斷暴露，蛋白的三級結(jié)構(gòu)展開，表面疏水性不斷變大，使得蛋白質(zhì)分子間疏水相互作用增加。肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的變化引起蛋白質(zhì)溶解度下降，并且伴隨著乳化活性減小以及乳化穩(wěn)定性的變化。同時(shí)這種結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致肌原纖維蛋白流變學(xué)特性的變化，pH值減小導(dǎo)致剪切應(yīng)力變小，并且在近等電點(diǎn)時(shí)，剪切應(yīng)力存在明顯變化。隨著pH值不斷減小，肌源性蛋白凝膠硬度不斷增大，并且在近等電點(diǎn)時(shí)變?。煌瑫r(shí)凝膠保水性不斷下降，而凝膠白度不斷增大。

pH值;兔肉;肌原纖維蛋白;功能性質(zhì)

我國是世界兔肉生產(chǎn)大國，據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)[1]，在過去的50年，世界兔肉產(chǎn)量增長了3.4倍，2013年世界兔肉產(chǎn)量為210萬 t，我國以72.7萬 t的產(chǎn)量，位居世界首位。兔肉因其高消化率、高不飽和脂肪酸、低能量、低膽固醇以及油膩感低的特點(diǎn)，特別受當(dāng)代消費(fèi)者青睞[2]。

兔肉肌肉蛋白中主要含肌原纖維蛋白、肌漿蛋白和基質(zhì)蛋白，肌原纖維蛋白占肌肉總蛋白的40%～60%，是一類具有重要生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)群。肌原纖維蛋白的功能特性不僅影響著兔肉制品的感官品質(zhì)，也對兔肉加工和儲存過程的物理特性起重要作用。影響蛋白質(zhì)功能特性的因素很多，除蛋白質(zhì)本身固有的性質(zhì)決定肌原纖維蛋白的功能特性外，pH、鹽離子、氧化還原電位以及表面活性劑等環(huán)境因素對其也有重要的影響。pH是肌原纖維蛋白功能特性的重要影響因素之一，可通過改變氨基酸側(cè)鏈電荷的數(shù)量及分布，改變蛋白質(zhì)分子的折疊狀態(tài)及蛋白質(zhì)間的相互作用，從而引起蛋白質(zhì)功能特性的改變。目前，國內(nèi)外在pH對的肌原纖維蛋白功能特性的影響研究主要集中在pH對蛋白質(zhì)凝膠作用的影響[3-4]，而對其他功能特性的研究較少，并且不同來源肌原纖維蛋白功能特性差異很大，針對兔肉的研究更是少之又少。

本文以兔背最長肌為原料，研究了pH對兔肉肌原纖維蛋白功能特性的影響，并通過肌原纖維結(jié)構(gòu)的變化分析功能特性變化機(jī)理。旨在為兔肉的綜合利用及兔肉產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)材料為150日齡成年伊拉公兔，購于重慶市高校草食動物中心種兔場，按常規(guī)方式屠宰后，采集10只兔的全部背部最長肌，0.5 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-18 ℃冷凍。牛血清蛋白為生化試劑，其余試劑均為分析純。

1.2主要儀器設(shè)備

冷凍離心機(jī)(Avanti J-30I)，美國貝克曼庫爾特公司；質(zhì)構(gòu)分析儀(CT-3)，美國Brookfield公司；超低溫冰箱(DF8517)，韓國ilshin公司；真空冷凍干燥機(jī)(ALPHA1-4LSC)，德國Christ公司；紫外分光光度計(jì)(UV-2450)，日本島津公司；紅外光譜(Spectrun100)，美國PerkinElmer公司；流變儀(HR-1),美國Brookfield公司；熒光分光光度計(jì)(F-2500)， 日本島津公司；測色儀(UltraScan PRO)，美國Hunter Lab公司；可見分光光度計(jì)(722 型)，上海元析儀器有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

肌原纖維蛋白的提取參照XIONG[5]、姜啟星[6]的方法，作適當(dāng)修改。具體操作過程為：將兔肉絞碎，加入4倍體積的冰浴0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L NaCl，0.001 mol/L EDTA，0.002 mol/L MgCl2，pH 7.0)，7 000 r/min條件下均質(zhì)處理30 s，停歇3 min后再次均質(zhì)30 s，均質(zhì)液在4 ℃、8 000 r/min條件下離心15 min，重復(fù)上述操作3次。沉淀中加入0.1 mol/L NaCl(內(nèi)含0.001 mol/L NaN3，pH 6.25)，7 000 r/min條件下均質(zhì)處理30s，均質(zhì)液在8 000 r/min條件下離心15 min，重復(fù)上述操作3次，最后一次離心前經(jīng)雙層紗布過濾，以上操作均質(zhì)冰浴條件下進(jìn)行。

1.3.2 肌原纖維蛋白溶解度

肌原纖維蛋白溶解度的測定參照TANG[7]的方法。稱取0.5 g肌原纖維蛋白，溶于20 mL NaCl溶液中，冰浴條件下2 800 r/min均質(zhì)處理30 s，將均質(zhì)液在4 ℃、8 000 r/min條件下離心15 min，測定離心前后蛋白質(zhì)濃度。

(1)

1.3.3 乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性

乳化能力的測定基于AGYARE[8]等的方法，作適當(dāng)?shù)男薷?。?.1 mol/L、pH 6.5磷酸鹽緩沖溶液溶解肌原纖維蛋白溶解，制成蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液。將5.0 mL大豆油和20.0 mL蛋白質(zhì)溶液放入直徑為2.5 cm的塑料離心管中，10 000 r/min條件下高速均質(zhì)60 s，均質(zhì)結(jié)束后立即從距離心管底5 mm處取均質(zhì)液50 μL(剩下的均質(zhì)液備用)，加入到5 mL、0.1% SDS溶液中，振蕩混勻，靜置10 min，用分光光度計(jì)在500 nm波長處測定吸光度值，記作A0，以0.1% SDS溶液做空白。10 min后在離心管相同位置再次取均質(zhì)液50 μL，進(jìn)行上述處理，吸光度值記作A10。肌原纖維蛋白乳油均質(zhì)液的乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)的計(jì)算公式如下：

EAI={(2×2.303)/[C×(1-φ)×104]}×A500×稀釋倍數(shù)

(2)

ESI=100×A10/A0

(3)

式中：C，乳化前的蛋白質(zhì)濃度,g / mL；φ，乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)；A500，在500 nm處的吸光度值。

1.3.4 肌原纖維蛋白表面疏水性

(4)

1.3.5 紫外吸收光譜及其二階導(dǎo)圖

基于QIU[10]的方法適當(dāng)修改測定。用0.6 mol/L NaCl溶液溶解肌原纖維蛋白，制成蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的溶液。以0.6 mol/L NaCl作為空白，波長230～320 nm，測定肌原纖維蛋白的紫外吸收光譜。

1.3.6 內(nèi)源熒光光譜測定

基于XU[11]的方法適當(dāng)修改測定。用0.6 mol/L NaCl溶液溶解肌原纖維蛋白，制成蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的溶液。以0.6 mol/L NaCl溶液作為空白，儀器參數(shù)設(shè)置激發(fā)波長為295 nm，發(fā)射光譜范圍為 300～400 nm，掃描范圍為 300～400 nm，掃描速度為1 500 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為2.5 nm，掃描3次。

1.3.7 氫鍵含量

參照周光宏[12]等方法測定。用0.02 mol/L、pH 6.5的磷酸鹽緩沖液溶解肌原纖維蛋白，制成蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液。取肌原纖維蛋白樣液，分別加入0.5 mL的S1溶液(0.02 mol/LTris，1% SDS，pH 8.0)和S2溶液(0.5 mol/L NaOH)，振蕩均勻后室溫放置1 h，8 000 r/min離心30 min，測定上清液蛋白濃度，同時(shí)取0.6 mL上清液加入50%三氯乙酸(TCA)溶液，使上清液的最終TCA濃度達(dá)到10%，樣品在4 ℃條件下放置15 min后4 000 r/min離心10 min，沉淀用S2溶液溶解，測定蛋白濃度，氫鍵含量以S1溶解的蛋白含量占S2溶解的蛋白質(zhì)含量的百分比表示，用0.02 mol/L、pH 6.5的磷酸緩沖液做空白。

1.3.8 肌原纖維蛋白凝膠特性

1.3.8.1 肌原纖維蛋白凝膠的制備

用0.6 mol/L NaCl，0.05 mol/L、pH 6.0的磷酸鹽緩沖液溶解肌原纖維蛋白，制成蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液。用直徑25 mm的離心管盛放蛋白溶液，置于溫度20～70 ℃、以1 ℃/min的速率上升的水浴鍋中，并在70 ℃的條件下保溫20 min制備成凝膠。凝膠加熱結(jié)束后，迅速在流水中冷卻，置于4 ℃的冰箱中過夜，測定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.8.2 凝膠硬度

采用CT-3質(zhì)構(gòu)儀對凝膠硬度進(jìn)行測定。儀器參數(shù)設(shè)置如下：測量長度10 mm，圓柱直徑20 mm，形變30%，始發(fā)點(diǎn)負(fù)載4 g，測試速度1.00 mm/s，探頭TA5。

1.3.8.3 凝膠持水性

基于SALVADOR[13]的方法，適當(dāng)?shù)男薷臏y定。取2 g蛋白凝膠，置于5 mL的離心管中，在4 ℃下8 000 r/min離心10 min，測定凝膠離心前后的重量。結(jié)果以前后重量的百分比進(jìn)行表示，重復(fù)3次。

1.3.8.4 凝膠白度

凝膠白度值在測定其L*(亮度值)、a*(紅度值)、b*(黃度值)后，按照PARK[14]的方法計(jì)算求得，其計(jì)算公式如下：

白度=100-[(100-L*)2+a*2+b*2]1/2

(5)

1.3.8.5 凝膠作用力分析

參照PéREZ-MATEOS[15]等的方法，測定凝膠作用力。取2 g凝膠，分別加入10 mL 0.05 mol/L NaCl(SA)、0.6 mol/L NaCl(SB)、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L脲(SC)和0.6 mol/L NaCl+8 mol/L脲(SD)，混合后高速均質(zhì)30 s，4 ℃靜置1 h，8 500 r/min離心10 min，雙縮脲法測定其上清液蛋白質(zhì)含量。離子鍵的貢獻(xiàn)以SB與SA溶液中蛋白質(zhì)含量之差表示；氫鍵的貢獻(xiàn)以SC與SB溶液中蛋白質(zhì)含量之差表示；疏水性相互作用的貢獻(xiàn)以SD與SC溶液中蛋白質(zhì)含量之差表示。

1.3.9 流變性特性

用0.6 mol/L NaCl，0.05 mol/L、pH 6.0的磷酸鹽緩沖液溶解肌原纖維蛋白，制成蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為20 mg/mL的溶液，測定其流變性特性。靜態(tài)流變學(xué)特性流變儀條件為：夾具為40 mm平行板，狹縫500 μm，應(yīng)變1%，頻率0.1 Hz，剪切速率0.1～100 s-1。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，Origin 8.0 進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果

2.1pH值對肌原纖維蛋白功能特性的影響

2.1.1 pH對溶解度的影響

蛋白質(zhì)溶解度是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-溶劑相互作用之間平衡的熱力學(xué)表現(xiàn)形式[16]，由圖1可知，隨著pH值逼近肌原纖維蛋白等電點(diǎn)范圍(肌原纖維等電點(diǎn)約為5～5.2[17])，其蛋白質(zhì)溶解度顯著減小，在pH 5.5時(shí)達(dá)到最小值，而隨著pH值偏離其等電點(diǎn)范圍，其溶解度極顯著增大，并且在一定范圍內(nèi)，隨著pH值的增加而增加。

圖1 pH值對肌原纖維蛋白溶解度的影響Fig.1 Effect of pH on the solubility of myofibrillar protein

2.1.2 pH值對乳化性的影響

蛋白質(zhì)的乳化性是蛋白質(zhì)的界面性質(zhì)，由圖2所示，兔肉肌原纖維蛋白的乳化活性隨著pH值的升高而增大，而乳化穩(wěn)定性隨著pH值的升高呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，在pH 6.5處達(dá)到最大值。隨著pH值減小，蛋白質(zhì)的溶解度下降，蛋白凝聚，乳化微粒增大，肌原纖維蛋白表面電荷減少，蛋白分子間靜電排斥力減小這使得肌原纖維蛋白的乳化性最低[18]。

圖2 pH值對肌原纖維蛋白乳化性的影響Fig.2 Effect of pH on the emulsification of myofibrillar protein

2.1.3 pH值對凝膠特性的影響

肌原纖維蛋白膠凝性是肌原纖維蛋白重要的功能性質(zhì)，其對肉類食品而言，不僅可以形成半固態(tài)黏彈性質(zhì)地，還具有保水、穩(wěn)定脂肪和黏結(jié)的作用。在凝膠的評價(jià)體系中，凝膠強(qiáng)度、保水性以及白度具有重要意義。由圖3可知，隨著pH值逼近等電點(diǎn)范圍，肌原纖維蛋白凝膠硬度先增大后減小。在pH值為6.0時(shí)，得到最大凝膠硬度，這是因?yàn)殡S著pH值的減小，蛋白質(zhì)分子間靜電斥力較小，使蛋白質(zhì)疏水作用和二硫鍵作用增大[19]，而隨著pH值增大，靜電斥力越大，蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)過于松散，對凝膠強(qiáng)度產(chǎn)生不利影響[20]，使其硬度減小(plt;0.05)；在pH值逼近等電點(diǎn)范圍時(shí)，蛋白質(zhì)分子間疏水相互作用增強(qiáng)，蛋白溶解度部分喪失或全部喪失，蛋白質(zhì)分子無序聚集，形成容易滲水且強(qiáng)度弱的凝膠,引起凝膠硬度的極顯著減小(plt;0.01)。同時(shí)，本研究可以證明在肌原纖維蛋白凝膠體系中，盡管蛋白質(zhì)溶解度不是蛋白質(zhì)膠凝作用的必需條件，但其喪失程度會對蛋白質(zhì)膠凝作用產(chǎn)生一定的影響，喪失程度嚴(yán)重會引起凝膠硬度的減小。

圖3 pH值對肌原纖維蛋白凝膠硬度、保水性和白度的影響Fig.3 Effect of pH on the hardness, water retention and degree of whiteness of myofibrillar protein gel

肌原纖維蛋白凝膠持水性是蛋白質(zhì)溶液與蛋白質(zhì)沉淀的中間狀態(tài)，也是蛋白質(zhì)相互結(jié)合并將水包容，形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。由圖3可知，隨著pH值逼近等電點(diǎn)范圍，兔肉肌原纖維蛋白凝膠保水性顯著下降(plt;0.05)。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子間靜電斥力減小，并且與水分子結(jié)合的氫鍵位點(diǎn)也明顯變少[21]，導(dǎo)致水合作用表面積減小，持水性下降。

凝膠白度值是凝膠色澤的表觀體現(xiàn)，與肌原纖維蛋白的變小程度有關(guān)[22]。隨著pH值逼近等電點(diǎn)范圍，肌原纖維蛋白白度值顯著增大(plt;0.05)。這可能是因?yàn)閜H的不同導(dǎo)致凝膠形成機(jī)制存在差異，在相同的凝膠制作條件下，引起蛋白質(zhì)變性程度不同。

圖4 pH值對維持肌原纖維蛋白凝膠作用力的影響Fig.4 Effect of pH on the maintenance of myofibrillar protein gel

凝膠的蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-水相互作用以及鄰近肽鏈間的吸引力和排斥力共同平衡時(shí)的結(jié)果，其涉及的作用力由涉及疏水相互作用、氫鍵、靜電作用、二硫鍵等，pH值可通過改變蛋白質(zhì)分子的離子化作用和凈電荷值，進(jìn)而影響維持凝膠的作用力[23]。由圖4可知，pH對凝膠維持的作用力重要的影響。隨著pH偏離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)范圍，氫鍵貢獻(xiàn)先增大后減小，在pH 6.5時(shí)有氫鍵最大貢獻(xiàn)；離子鍵貢獻(xiàn)也呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，其在pH 7.0時(shí)有最大貢獻(xiàn)值；而疏水相互作用貢獻(xiàn)則呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢，在pH 6.0時(shí)貢獻(xiàn)值最小。

2.2pH值對肌原纖維蛋白靜黏彈性流變學(xué)特性的影響

肌原纖維蛋白靜態(tài)流變性可以反映其溶液在外力作用下的運(yùn)動速度和運(yùn)動阻力。根據(jù)冪率定律τ=K×δn(τ為剪切應(yīng)力，K為黏度系數(shù)，δ為剪切速度，n為流變指數(shù))可以判定肌原纖維蛋白的流體特性，在冪率定律中，當(dāng)nlt;1時(shí)，流體為假塑性流體，當(dāng)n=1時(shí)，流體為牛頓流體，當(dāng)ngt;1時(shí)，流體為脹塑性流體[24]。本研究中，在pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5時(shí)流變指數(shù)n分別為0.447、0.446 8、0.534 9、0.619 8、0.666，均小于1，說明該條件下肌原纖維蛋白為假塑性流體，剪切變稀。

圖5 pH值對肌原纖維蛋白流變學(xué)特性的影響Fig.5 Effect of pH onthe rheological properties myofibrillar protein

由圖5可知，隨著剪切速率的增大，剪切應(yīng)力不斷增大，在低剪切速率0.1～1 s-1區(qū)，剪切應(yīng)力隨著剪切速率的增大呈線性增大趨勢，這是由于剪切速率過低，高分子鏈段未顯現(xiàn)出彈黏性形變，表現(xiàn)出牛頓流體的性能；當(dāng)進(jìn)入高剪切速率40～100 s-1區(qū)時(shí)，剪切應(yīng)力隨著剪切速率的增大再次呈現(xiàn)線性增大趨勢，這可能是因?yàn)樵诟叩募羟兴俾氏?，肌原纖維蛋白自身來不及在流動過程中顯示出黏彈性的變化或已經(jīng)完成了流動取向，再次呈現(xiàn)出牛頓流體的特性[25]。

在同一剪切速率條件下，隨著pH逼近等電點(diǎn)范圍，剪切應(yīng)力不斷減小，并且在pH 5.5時(shí)，其剪切應(yīng)力明顯變小，這主要是由蛋白質(zhì)分子間作用力過小引起的。

2.3表面疏水性

蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)間的相互作用是一種非共價(jià)鍵的相互作用，是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的重要因素，盡管構(gòu)成蛋白質(zhì)的非極性氨基酸側(cè)鏈大多數(shù)分布于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，但其非極性基團(tuán)仍有一部分暴露在蛋白質(zhì)表面，使其表面具有一定的疏水作用[26-27]。表面疏水性說明蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露程度，表面疏水基團(tuán)暴露的越多，肌原纖維蛋白的表面疏水性越大。由圖6可知，隨著pH值逼近等電點(diǎn)范圍，肌原纖維蛋白表面疏水性顯著增大，蛋白質(zhì)暴露的非極性基團(tuán)不斷增多，這些基團(tuán)受水分子的排斥而相互靠范德華力或疏水鍵結(jié)合的更加緊密[28]，當(dāng)非極性基團(tuán)暴露到一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)就會聚集，同時(shí)伴隨著溶解度的部分喪失或全部喪失。

圖6 pH值對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.6 Effect of pH on the hydrophobicity of myofibrillar protein

2.4氫鍵含量

在肌原纖維蛋白中，肌球蛋白分子尾部的α-螺旋結(jié)構(gòu)是依靠多肽鏈中—CO與—NH之間的氫鍵來維持穩(wěn)定的[29]，當(dāng)氫鍵的穩(wěn)定性發(fā)生變化時(shí)，α-螺旋結(jié)構(gòu)會發(fā)生破壞和丟失，繼而引起蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化。由圖7可知，隨著pH值逼近等電點(diǎn)范圍，肌原纖維蛋白氫鍵含量逐漸減小，說明在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)隨著pH值的減小，肌原纖維蛋白的氫鍵穩(wěn)定性不斷減小，這逐漸引發(fā)酸性條件下α-螺旋的破壞和丟失，即α-螺旋含量逐漸減少。 這與LIU[30]得到的結(jié)果一致。

圖7 pH值對肌原纖維蛋白氫鍵含量的影響Fig.7 Effects of pH on the hydrogen bonding content of myofibrillar protein

2.5色氨酸內(nèi)源熒光光譜分析

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來源于芳香族氨基酸殘基，在295 nm處肌原纖維蛋白分子中由于酪氨酸殘基熒光熄滅和色氨酸殘基熒光增加，其熒光發(fā)射光譜主要是由色氨酸所發(fā)射，可用其用于監(jiān)測色氨酸殘基微環(huán)境變化[31]。由圖8可得，不同pH對肌原纖維蛋白的熒光光譜形狀影響不顯著，但對其熒光強(qiáng)度有顯著影響；隨著pH值逼近等電點(diǎn)范圍，肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度逐漸減弱。pH減小引起肌原纖維蛋白排列順序的變化，內(nèi)部色氨酸基團(tuán)暴露，引起蛋白分子間作用增強(qiáng)，使得蛋白分子再聚集，并且再聚集作用將更多色氨酸殘基包裹于分子內(nèi)部更加疏水的環(huán)境中，引起內(nèi)源熒光強(qiáng)度的下降[32]。

圖8 pH對肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響Fig.8 Effects of pH on the endogenous fluorescence intensity of myofibrillar protein

圖9是不同pH條件下肌原纖維蛋白的紫外圖譜及其二階導(dǎo)圖譜，由圖9-A可知，隨著pH值逼近等電點(diǎn)范圍，表征色氨酸與酪氨酸殘基的276 nm[33]紫外吸收強(qiáng)度上升，這表明肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。由圖9-B可知，肌原纖維蛋白在紫外二階導(dǎo)圖譜在289 nm與296 nm處有2個正吸收峰，在284 nm和292 nm處有2個負(fù)吸收峰。紫外二階導(dǎo)圖譜在289 nm和296 nm處，以pH 7.0為對照，在其逼近等電點(diǎn)范圍時(shí)，發(fā)生不同程度的藍(lán)移，吸收峰的藍(lán)移表明處理后蛋白分子展開，所處環(huán)境極性增加，導(dǎo)致表面疏水性增強(qiáng)[34]，這與前文中表面疏水性的研究一致。

圖9 不同pH條件下肌原纖維蛋白的紫外圖譜及其二階導(dǎo)圖譜Fig.9 Ultraviolet map and second-order map of myofibrillar protein at different pH

在處理肌原纖維二階導(dǎo)圖譜時(shí)，可依據(jù)正負(fù)吸收峰峰谷和峰頂距離的比例(r=a/b，其中a為284 nm吸收峰與289 nm吸收峰的距離，b為292 nm吸收峰與296 nm吸收峰的距離)的變化來推斷酪氨酸的貢獻(xiàn)，隨著pH值逼近等電點(diǎn)范圍，其r值分別為2.00, 2.22,1.66,1.91,2.19，“r”值越大表明蛋白的三級結(jié)構(gòu)展開程度越大，酪氨酸殘基暴露出來越嚴(yán)重[35]。

2.6肌原纖維蛋白功能特性品質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性分析

pH對肌原纖維蛋白的離子化作用和凈電荷值均有影響，這直接導(dǎo)致蛋白分子間作用力以及蛋白分子與水分子的結(jié)合能力的變化[36]。

根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果，pH對與肌原纖維蛋白中氫鍵含量、溶解度、乳化活性和凝膠保水性極顯著正相關(guān)(plt;0.01)，與表面疏水性、凝膠硬度以及白度極顯著負(fù)相關(guān)(plt;0.01)，說明在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)pH值越低，肌原纖維蛋白氫鍵含量、溶解度、乳化活性以及凝膠保水性越差。氫鍵含量與蛋白質(zhì)溶解度、乳化活性和凝膠保水性極顯著正相關(guān)極顯著正相關(guān)(plt;0.01)，與凝膠硬度以及白度極顯著負(fù)相關(guān)(plt;0.01)，表明α-螺旋結(jié)構(gòu)的破壞或丟失程度越大，蛋白質(zhì)溶解度、乳化活性以及凝膠保水性越差。表面疏水性與凝膠硬度和凝膠白度極顯著正相關(guān)(plt;0.01)，與蛋白質(zhì)溶解度、乳化活性以及凝膠保水性極顯著負(fù)相關(guān)(plt;0.01)，表明疏水基團(tuán)的暴露程度越大，蛋白質(zhì)溶解度、乳化活性以及凝膠保水性越差。

表1 肌原纖維蛋白功能特性品質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性分析

3 結(jié)論

隨著pH值逼近等電點(diǎn)范圍，維持肌原纖維蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵穩(wěn)定性降低，α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞和丟失，內(nèi)部疏水性芳香族氨基酸不斷暴露，蛋白的三級結(jié)構(gòu)展開，表面疏水性不斷變大，使得蛋白質(zhì)分子間疏水相互作用增加。

肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的變化引起蛋白質(zhì)溶解度下降，并且伴隨著乳化活性減小以及乳化穩(wěn)定性的變化。同時(shí)這種結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致肌原纖維蛋白流變學(xué)特性的變化，pH值減小導(dǎo)致剪切應(yīng)力變小，并且在近等電點(diǎn)時(shí)，剪切應(yīng)力存在明顯變化。

肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致熱誘導(dǎo)凝膠形成機(jī)制的差異，引起維系凝膠的作用力不同，繼而對凝膠特性產(chǎn)生影響。隨著pH值不斷減小，肌源性蛋白凝膠硬度不斷增大，并且在近等電點(diǎn)時(shí)變?。煌瑫r(shí)凝膠保水性不斷下降，而凝膠白度不斷增大。

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EffectofpHonthefunctionalpropertiesofrabbitmyofibrillarprotein

ZHOU Xin-ya1, HE Zhi-fei1,2, LI Hong-jun1,2*, WANG Zhao-ming1

1(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China) 2(Chongqing Engineering Research Center of Regional Food,Chongqing 400715,China)

This study investigated the effects of different pH conditions on the function of myofibrillar protein in rabbit meat and the correlation between functional indexes of myofibrillar protein and mechanism of protein tertiary structure. It was found that, with the pH approaching the isoelectric point range, the aromatic amino acids inside the protein were exposed and the tertiary structure of the protein was unfolded; the surface hydrophobicity became larger, which resulted in the increase of the hydrophobic interaction between proteins. Changes in myofibrillar protein structure causes the decrease of protein solubility and emulsifying activity as well as emulsion stability. At the same time, this structural change leads to the change of myofibrillar protein rheological properties. The decrease of pH leads to the decrease of shear stress, and obvious shear stress changes at near isoelectric point. With the decrease of pH, the hardness of myogenic protein gel increases and becomes smaller at near isoelectric point. At the same time, the gel retention is decreased while gel whiteness is increased.

pH; rabbit meat; myofibrillar protein; functional properties

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014272

碩士研究生(李洪軍教授為通訊作者,E-mail: 983362225@￣qq.com)。

重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心能力提升項(xiàng)目(cstc2014pt-gc8001)；2017年國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31671787)

2017-03-09，改回日期：2017-04-25