寧夏地區(qū)艾滋病患者感染HIV病毒pol區(qū)基因變異性研究

吳忠蘭,關(guān)光玉,尹 婷，趙偉明，曹 愍，楊東智，馬學(xué)旻

·論 著·

寧夏地區(qū)艾滋病患者感染HIV病毒pol區(qū)基因變異性研究

吳忠蘭1,關(guān)光玉1,尹 婷2，趙偉明2，曹 愍1，楊東智1，馬學(xué)旻1

目的通過巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測寧夏地區(qū)艾滋病患者感染HIV-1病毒的pol基因片段分析其變異情況，為艾滋病防治提供參考依據(jù)。方法采集艾滋病患者全血標(biāo)本，提取病毒RNA，針對(duì)HIV-1病毒pol區(qū)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，凝膠電泳鑒定后送測序。結(jié)果巢式PCR檢測47份,成功擴(kuò)增35分樣本和獲得pol區(qū)序列，長1 060 bp。寧夏地區(qū)HIV-1感染者中存在四種基因亞型，即CRF07-BC占65.7%、CRF08-BC占17.1%、CRF01-AE占11.4%、B亞型占5.7%,基因離散率為B亞型最大。結(jié)論HIV-1基因型別趨于多樣化，CRF07-BC重組亞型為主要流行毒株，B亞型在寧夏地區(qū)流行時(shí)間最長；吸毒人群和性活躍人群仍是艾滋病防治的重點(diǎn)人群。

基因序列;進(jìn)化樹;亞型特征

HIV屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬，為逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒，基因組為兩條相同的RNA單鏈，每條單鏈9.2～9.8 kb，由結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因組成。其結(jié)構(gòu)基因中的pol基因編碼逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白水解酶，對(duì)于HIV病毒的復(fù)制、前病毒的整合和增殖都具有重要作用[1-2]。HIV感染類型可以分為1型和2型，中國主要流行HIV-1型，由于HIV-1生存能力弱、抵抗力低，但變異性很強(qiáng)。寧夏在2007年之前是以靜脈吸毒傳播為主，現(xiàn)以性傳播為主。本研究對(duì)寧夏地區(qū)HIV-1基因亞型展開調(diào)查，通過對(duì)HIV感染者HIV-1病毒pol區(qū)核酸序列進(jìn)行分析，掌握本地區(qū)基因亞型分布情況，為艾滋病的防治提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：2015年6-12月，采用方便抽樣的方法，在寧夏進(jìn)行調(diào)查。納入標(biāo)準(zhǔn)為：WB(Western blot)免疫印跡確證陽性、病毒載量gt;1 000 拷貝/mL、年齡gt;18歲。無特殊重大殘疾等。共招募調(diào)查對(duì)象47例，采集感染者5 mL外周血，用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，分離血漿，-70 ℃保存待用。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法：采用羅氏High Pure Viral RNA Kit試劑盒進(jìn)行病毒RNA提取，巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增HIV-1pol區(qū)PR和部分RT基因區(qū)。第一輪反應(yīng)引物序列為MAW-26(5'-TGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3')和RT-2(5'-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGA-3')，擴(kuò)增條件分別為50 ℃ 30 min ,94 ℃ 2 min后;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min,4 ℃保溫。第二輪反應(yīng)引物為RT-20 (5'-CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC-3')和PRO-1 (5'-TGGAAATGTGGAAAGGAAGGACCAGAGCCAACAGCCOCA-3'。擴(kuò)增條件分別為94 ℃ 5 min預(yù)變性，94 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 150 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，片段大小約為1.1 kb，鑒定后送北京諾賽基因公司測序。

1.2.2 亞型分析：采用Los Alamos HIV Database 提供的在線工具Quality control和BioEdit軟件對(duì)所得的序列進(jìn)行校正和剪裁，采用美國NCBI提供的在線亞型分析工具Genotyping對(duì)所獲得的序列進(jìn)行初步分析，采用Mega 6.0軟件構(gòu)建部分毒株的Neighor-Joining 系統(tǒng)進(jìn)化樹(重復(fù)運(yùn)算1 000次)。

2 結(jié)果

2.1 基本情況：招募的47例艾滋病感染者，獲得35條 pol 序列，其中男性25例，占71.4%；女性10例，占28.6%，呈現(xiàn)四種基因亞型分布。民族以漢族為主，占51.4%；其次為回族，占42.9%?；橐鰻顩r主要為已婚有配偶者，占42.9%，其次為離異或喪偶者，占37.1%；文化程度主要集中在初中和小學(xué)及以下低學(xué)歷組，分別為25.7%和45.7%；亞型中以CRF07_BC為主，其次為CRF08_BC，見表1。

表1 35例基因分型HIV感染者/AIDS患者一般人口學(xué)特征和基因分布

2.2 基因亞型分布和重組體：35例HIV-1感染者pol基因區(qū)與國際參考株建立系統(tǒng)樹分析，確定基因亞型和重組亞型。 結(jié)果顯示，性傳播存在3種重組亞型，靜脈吸毒存在4種重組亞型，以CRF07_BC重組亞型為主，為23例(65.7%);其次為CRF08_BC重組亞型6例,CRF01_AE重組亞型4例(18.2%)、B亞型2例(3.0%)，見表2。

表2 35例艾滋病患者基因亞型和傳播途徑的分布

2.3 不同基因亞型基因離散率的分析：CRF07_BC、CRF08_BC、CRF01_AE和B亞型和國際參考株07_BC.CN.08LNA001、08_BC.CN.97.CNGX6F、01_AE.CF.1990CF402和B.FR83.HXB2比較，計(jì)算基因離散率發(fā)現(xiàn)，B亞型變異最大，見表3。將23例CRF07_BC重組亞型和國內(nèi)CRF07_BC重組亞型比較發(fā)現(xiàn)，寧夏的CRF07_BC重組亞型形成3個(gè)主要的聚集簇，其中NX-35和NX-40與云南的聚集在一起。

表3 寧夏地區(qū)HIV-1基因亞型和國際參考株、組內(nèi)基因離散率比較

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3],HIV-1病毒在具有高度亞型多樣性的地區(qū),以pol基因分型和用env基因分型的符合率僅86%。不過也有研究表明[4-5],HIV-1的pol基因序列可以用在毒株亞型較為單一的地區(qū)作為分型的依據(jù),而且用pol基因分型還可以更好地識(shí)別一些重組毒株(CRF)。寧夏屬內(nèi)陸地區(qū)，未見有報(bào)道HIV基因多樣性分布，本次調(diào)查兩類人群，一類為靜脈吸毒人群，另一類為性傳播人群，吸毒人群中主要流行CRF07_BC(68.8%)，還存在其他亞型，為B亞型、CRF08_BC和CRF01_AE重組亞型。我國HIV-1分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果提出，HIV-1基因亞型的流行與傳播途徑有關(guān)，CRF07_BC和CRF08_ BC重組體的流行主要與靜脈吸毒有關(guān)，CRFO1_AE的流行主要與異性性接觸感染有關(guān)，B/B’基因亞型主要與供/輸血(血制品)有關(guān)[6]。本研究 CRF07_BC重組亞型的流行病學(xué)資料顯示，11例為靜脈吸毒人員，這些感染者通過共用注射器感染，因此，在本地區(qū)加強(qiáng)美沙酮門診干預(yù)措施顯得尤為重要。調(diào)查還發(fā)現(xiàn)12例CRF07_BC重組體為性傳播途徑感染，而性傳播又是傳染病向普通人群傳播的有效橋梁,可以推斷吸毒和性傳播均促進(jìn)了CRF07_BC重組亞型的持續(xù)擴(kuò)散,本研究結(jié)果和上海市吸毒人群HIV基因型分布特征相似[7]。

在我國，CRFO1_AE重組亞型于1994年首次從一名女性性工作者體內(nèi)檢出[8]，主要通過性途徑傳播。最近的研究結(jié)果顯示近年來吸毒人群中感染該重組亞型的比例也在逐漸增多[9]，本次報(bào)道CRF01_AE重組亞型4例(18.2%)，2例感染者的流行病學(xué)資料顯示除注射吸毒外，還存在高危性行為，因此混亂的高危行為(靜脈吸毒加性行為)容易產(chǎn)生并催化新的重組亞型[10-12]。Holmes等[1,13-14]也曾報(bào)道過經(jīng)異性性傳播的HIV與靜脈注射吸毒途徑、輸血途徑及同性性傳播HIV病毒在進(jìn)化樹中聚集在一起，推測異性性傳播途徑可能是其他傳播途徑的“交匯點(diǎn)”。因此，對(duì)經(jīng)異性性傳播途徑的研究有助于了解HIV-1流行及變異情況。

基因離散率又叫基因距離，反映了基因的變異程度。從寧夏4種不同基因亞型變異程度看，B亞型的變異率最大，其次為CRF01_AE和CRF08_BC重組亞型，通過系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，有多對(duì)艾滋病感染者的序列差異很小，提示HIV-1在本地區(qū)有聚集和加速傳播的趨勢。根據(jù)HIV-1基因變異率每年0.5%～1%計(jì)算[15-16]，以pol基因離散率估算，推測HIV-1 B亞型、CRF01_AE、CRF08_BC、CRF07_BC重組亞型分別在寧夏流行的時(shí)間為13～7年、8～6年、6～3年和5～2年。從推測可以看出，盡管CRF07_BC重組亞型在寧夏流行的時(shí)間較短，卻是此次發(fā)現(xiàn)的主要流行株。B亞型在吸毒人群中發(fā)現(xiàn)，且流行時(shí)間最久，這和寧夏艾滋病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果基本相符[17]。由于本研究涉及的樣本為隨機(jī)抽樣，未能系統(tǒng)地反映寧夏地區(qū)HIV-1基因亞型的分布情況和特征，僅作為艾滋病基因分布的初探研究。

通過對(duì)寧夏地區(qū)HIV-1流行株亞型特征的研究顯示，寧夏地區(qū)HIV-1基因型別趨于多樣化，加大了艾滋病防治的難度，須亟待加強(qiáng)對(duì)吸毒人群、行活躍人群的宣傳教育，普及艾滋病各種防治知識(shí)。

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StudyonthegeneticvariationofPolregionofHIVvirusinAIDSpatientsinNingxia

WUZhonglan1,GUANGuangyu1,YINTing2,ZHAOWeiming2,CAOMin1,YANGDongzhi1,MAXuemin1

1.NingxiaCenterforDiseaseControlandPrevention,Yinchuan750004,China；2.NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

ObjectiveTo study the characteristics of human immunodeficiency virus (HlV) gene sequence, sub-type distribution and origin of HlV strains, epidemic status and trends in Ningxia, to provide scientific evidence for AIDS prevention and control measures.MethodsAnticoagulating blood samples were collected from HIV infection individuals and epidemiological data were analyzed. Pol gene were amplified by nested PCR from the RNA extraction and then sequenced. The acquired sequences were compared with the international subtype references. The phylogenetic trees were constructed to determine the subtype of the samples.Results47 samples were detected, 35 samples were PCR positive and the sequences were acquired. 23 cases were CRF07_BC (65.7%), 6 cases were CRF08_BC (17.1%), 4cases were CRF01_AE (11.4%) and 2 cases were subtype B (3.0%), and the B subtype were the largest genetic-distance.ConclusionThe subtypes are tending to diversity, CRF07_BC is the dominant strain and shows a high prevalence, drug users and sex active people still are the key of the HIV/AIDS prevention and control of the crowd.

Genesequence;Phylogenetictrees;Subtypecharacteristics

10.13621/j.1001-5949.2017.10.0877

R512

A

寧夏科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目國際合作專項(xiàng)(2013ZYH193)；寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NZ13217)

1.寧夏疾病預(yù)防控制中心，寧夏 銀川 750004

2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004

吳忠蘭(1979-)，女， 碩士研究生， 主管檢驗(yàn)技師， 從事艾滋病檢測工作。

2017-01-03責(zé)任編輯李 潔