高原低氧環(huán)境對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元自噬的影響及意義

馬文科 羅鵬 戴舒惠 楊悅凡 饒維 彭程 王玖 費(fèi)舟

(1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032; 2解放軍第261醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100094)

·神經(jīng)損傷研究·

高原低氧環(huán)境對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元自噬的影響及意義

馬文科1羅鵬1戴舒惠1楊悅凡1饒維1彭程2王玖1費(fèi)舟1*

(1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032;2解放軍第261醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100094)

目的研究6000 m海拔高度下，不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧暴露對(duì)小鼠負(fù)性情緒、海馬神經(jīng)元損傷、海馬神經(jīng)元自噬的影響，探討其相互關(guān)系。方法利用低壓氧艙模擬6000 m海拔高原低氧環(huán)境，實(shí)驗(yàn)組給予不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理，對(duì)照組置飼養(yǎng)于艙外。采用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估高原低氧環(huán)境對(duì)小鼠負(fù)性情緒的影響，HE染色觀察海馬神經(jīng)元病理學(xué)變化，Western Blot法檢測(cè)低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)及自噬標(biāo)志性蛋白Beclin-1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II(LC3-II)在海馬組織的表達(dá)變化。結(jié)果高原低氧1、3、14 d暴露明顯減少了小鼠高架十字迷宮開臂滯留時(shí)間百分比和開臂進(jìn)入次數(shù)百分比；HE染色顯示，高原低氧1、3、14 d組小鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元排列紊亂、細(xì)胞間隙變大、胞體不規(guī)則、核固縮表現(xiàn)明顯，而高原低氧7 d組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的損傷表現(xiàn)相對(duì)較輕；Western Blot結(jié)果顯示，海馬HIF-1α、Beclin-1及LC3-II的表達(dá)在高原低氧暴露1 d后即達(dá)到高峰，后逐漸下降。至高原低氧處理第7天，HIF-1α和LC3-II表達(dá)與對(duì)照組已無顯著差異。結(jié)論高原低氧環(huán)境下，小鼠負(fù)性情緒的增加與海馬神經(jīng)元的損傷密切相關(guān)，而自噬的激活可能參與了急性高原低氧期海馬神經(jīng)元的損傷。

高原低氧; 負(fù)性情緒; 海馬神經(jīng)元; 自噬

我國(guó)高原面積遼闊，高原人口數(shù)目龐大。然而，高原性頭痛(high-altitude headache, HAH)、急性高山病(acute mountain sickness, AMS)和高原性腦水腫(high altitude cerebral edema, HACE)等急性高原性腦損害發(fā)生率高、危害大，給高原人群的健康帶來了嚴(yán)重?fù)p害[1-2]。高原環(huán)境的主要特點(diǎn)包括低氣壓、低氧、高寒、強(qiáng)輻射等，其中，低氧是引起急性高原腦損害的主要因素之一[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，高原低氧環(huán)境造成的腦損害與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)[4]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，缺血缺氧條件下，自噬的發(fā)生可以影響神經(jīng)元的最終轉(zhuǎn)歸[5]。但是，在高原低氧這種特殊環(huán)境下，自噬與神經(jīng)元的轉(zhuǎn)歸是否相關(guān)，不同高原低氧暴露時(shí)間是否對(duì)其存在影響，目前仍不清楚。故本研究旨在探討高原低氧環(huán)境下，不同高原低氧暴露時(shí)間對(duì)小鼠負(fù)性情緒、海馬神經(jīng)元損傷、海馬神經(jīng)元自噬的影響及相互關(guān)系，為深入研究高原性腦損害的分子病理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性C57BL/6小鼠(8～10 w, 18～20 g)由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠隨機(jī)分為平原對(duì)照組、高原低氧1 d組、3 d組、7 d組及14 d組，每組15只。

二、實(shí)驗(yàn)主要試劑

小鼠抗低氧誘導(dǎo)因子-1α (hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)、兔抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II (microtubule-associated protein 1 light 3-II, LC3-II) (Sigma)；兔抗Beclin-1、兔抗β-actin (cell signaling technology)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔、抗鼠IgG(北京康為世紀(jì))；蛋白裂解液(北京鼎國(guó)昌盛)；蛋白定量試劑盒(北京博奧森)；凝膠電泳試劑盒(上海碧云天)；化學(xué)發(fā)光底物(美國(guó)Advansta公司)。

三、建立高原低氧模型

本實(shí)驗(yàn)采用低壓氧艙(中航工業(yè))，模擬高原環(huán)境，建立高原低氧模型。模擬海拔高度：6000 m，艙內(nèi)溫度：25.6 ℃，艙內(nèi)濕度：21.3%，艙內(nèi)壓力：47.2 kPa，運(yùn)行時(shí)間為24 h/d，晝夜比12 h∶12 h。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由攝食及飲水。實(shí)驗(yàn)組小鼠置于低壓氧艙，給予不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理；平原對(duì)照組小鼠置于艙外(西安海拔約400 m)飼養(yǎng)。

四、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated plus maze, EPM)

實(shí)驗(yàn)組小鼠出艙后進(jìn)行EMP測(cè)試。EMP置于隔音的房間內(nèi)，弱光照明，將小鼠置于EMP的中央平臺(tái)上，面朝開臂，背對(duì)實(shí)驗(yàn)者。開始測(cè)試后，視屏采集系統(tǒng)自動(dòng)記錄5 min內(nèi)小鼠的活動(dòng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用系統(tǒng)軟件分析計(jì)算各組小鼠的開臂滯留時(shí)間百分比及開臂進(jìn)入次數(shù)百分比。

五、取材與標(biāo)本制作

EMP實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取6只小鼠，0.8%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，4%甲醛心內(nèi)灌注固定，后開顱取腦，4%甲醛繼續(xù)外固定一周，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，用于HE染色。各組剩余小鼠斷頭處死，冰上快速分離海馬，-80 ℃保存，用于Western Blot實(shí)驗(yàn)。

六、HE染色

切片脫蠟至水，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)改變。

七、蛋白印記法(Western Blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)

將加入細(xì)胞裂解液的海馬組織在冰上勻漿，待其充分裂解后離心30 min，取上清進(jìn)行蛋白定量及蛋白樣品制備。常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉，孵育一抗：小鼠抗HIF-1α(1∶4000)、兔抗Beclin-1(1∶2000)、兔抗LC3(1∶2000)，4 ℃過夜后室溫孵育二抗(1∶20 000)1 h，發(fā)光后采集電子圖像進(jìn)行分析。

八、統(tǒng)計(jì)分析

圖1 高原低氧環(huán)境對(duì)小鼠負(fù)性情緒的影響
Fig 1 High-altitude hypoxia exposure for different duration (1, 3, 7, 14 d) affected the negative emotions of mouse.
A: The percentage of residence time in open arms; B: The percentage of open arm entries.

Note: HH stands for high-altitude hypoxia exposure, and the number behind HH stands for high-altitude hypoxia exposure time.

aPlt;0.001,bPlt;0.05,cPlt;0.01,vscontrol group.

結(jié) 果

一、高原低氧環(huán)境對(duì)小鼠負(fù)性情緒的影響

與平原對(duì)照組相比，各高原低氧組的開臂滯留時(shí)間百分比(圖1A)和開臂進(jìn)入次數(shù)百分比(圖1B)均有所下降。其中，高原低氧1 d、3 d及14 d處理組的2項(xiàng)指標(biāo)下降顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果表明，高原低氧1 d、3 d及14 d暴露明顯增加了小鼠的負(fù)性情緒。

二、高原低氧環(huán)境下海馬神經(jīng)元的病理學(xué)改變

HE染色顯示，各高原低氧組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元受到了不同程度的損傷(圖2)。與對(duì)照組相比，高原低氧1、3、14 d組海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元排列紊亂，細(xì)胞間隙變大，胞體不規(guī)則，核固縮表現(xiàn)明顯。而高原低氧7 d組神經(jīng)元的損傷表現(xiàn)相對(duì)較輕。

三、高原低氧環(huán)境對(duì)小鼠海馬組織HIF-1α表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果顯示，HIF-1α在不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧暴露后表達(dá)均有所增高(圖3)。高原低氧暴露1 d后，HIF-1α的表達(dá)即達(dá)到高峰。隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)，其表達(dá)逐漸下降。至高原低氧暴露第7天時(shí)，與平原組比較，HIF-1α的表達(dá)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

四、高原低氧環(huán)境對(duì)小鼠海馬組織自噬標(biāo)志物表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果顯示，與平原對(duì)照組比較，高原低氧暴露1、3、7 d組的Beclin-1的表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而高原低氧暴露14 d組的Beclin-1的表達(dá)無明顯變化(圖4A)。與平原對(duì)照組比較，LC3-II在高原低氧暴露1 d及3 d組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在高原低氧暴露7 d及14 d組，其表達(dá)無明顯變化(圖4B)。

圖2 高原低氧環(huán)境下小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的病理學(xué)改變(HE)
Fig 2 High-altitude hypoxia exposure for different duration (1, 3, 7, 14 d) damaged the hippocampal neurons in CA1 area of mouse (HE)

Bar= 100 μm.

圖3 高原低氧環(huán)境上調(diào)了小鼠海馬組織HIF-1α的表達(dá)
Fig 3 High-altitude hypoxia exposure for different duration (1, 3, 7, 14 d) up-regulated the expression of HIF-1α in hippocampus of mouse

aPlt;0.01,bPlt;0.05,vscontrol group.

圖4 高原低氧環(huán)境對(duì)小鼠海馬組織Beclin-1和LC3-II表達(dá)的影響
Fig 4 Effects of high-altitude hypoxia exposure for different duration (1, 3, 7, 14 d) on the expression of Bcelin-1 and LC3-II in hippocampus of mouse
A: Quantity of Bcelin-1 was detected by Western Blot; B: Quantity of LC3-II was detected by Western Blot.

aPlt;0.001,bPlt;0.05,vscontrol group.

討 論

本研究采用低壓氧艙，建立了6000 m海拔高度下的急性高原低氧模型(高原低氧1 d、3 d組)和亞急性高原低氧模型(高原低氧7 d、14 d組)，初步證實(shí)了高原低氧環(huán)境下海馬神經(jīng)元損傷的發(fā)生，探討了與其相關(guān)的行為學(xué)表現(xiàn)和可能的分子機(jī)制。

首先，我們通過高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)觀察了不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理對(duì)小鼠負(fù)性情緒的影響。開臂滯留時(shí)間百分比和開臂進(jìn)入次數(shù)百分比是高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠負(fù)性情緒的兩項(xiàng)重要指標(biāo)。負(fù)性情緒增加的小鼠會(huì)減少在開臂的滯留時(shí)間和進(jìn)入開臂的次數(shù)，而更多地停留在閉臂[6]。本研究通過該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在6000 m海拔的高原低氧環(huán)境下，急性高原低氧1 d、3 d組和亞急性高原低氧14 d組小鼠的負(fù)性情緒明顯增加，而亞急性高原低氧7 d組小鼠的情緒無明顯變化。

作為大腦邊緣系統(tǒng)構(gòu)成組織之一，海馬與情緒和認(rèn)知的關(guān)系非常密切[7]。本研究通過對(duì)海馬CA1區(qū)病理學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，急性高原低氧1 d、3 d處理和亞急性高原低氧14 d處理均導(dǎo)致了小鼠海馬神經(jīng)元不同程度的排列紊亂、間隙擴(kuò)大及核固縮。而亞急性高原低氧7 d組小鼠海馬神經(jīng)元的損傷表現(xiàn)較輕，與之對(duì)應(yīng)的該組小鼠的負(fù)性情緒也沒有明顯增加。以上結(jié)果提示，高原低氧環(huán)境下，海馬神經(jīng)元的損傷可能與小鼠負(fù)性情緒的增加存在一定關(guān)聯(lián)。有文獻(xiàn)報(bào)道，焦慮、抑郁動(dòng)物模型的海馬神經(jīng)元存在不同程度的損傷[8-9]，所以我們推測(cè)，高原低氧環(huán)境下，海馬神經(jīng)元的損傷是引起小鼠負(fù)性情緒增加的重要因素。

HIF-1α是機(jī)體維持氧穩(wěn)態(tài)的核心調(diào)控因子[10]。在常氧條件下，脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase, PDH)活性增強(qiáng)，導(dǎo)致HIF-1α泛素化降解增多，因此細(xì)胞內(nèi)含量很低。而在低氧條件下，脯氨酸羥化酶的活性被抑制，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)HIF-1α水平升高。本研究發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理均使HIF-1α在海馬組織的表達(dá)增高，提示6000 m高原環(huán)境的確降低了小鼠腦組織氧含量。隨著高原低氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，HIF-1α表達(dá)逐漸下降，表明小鼠海馬對(duì)高原低氧環(huán)境逐漸產(chǎn)生了適應(yīng)。此外，HIF-1α作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其表達(dá)變化直接與其下游分子激活相關(guān)。研究證明，在低氧環(huán)境下，HIF-1α可介導(dǎo)自噬的發(fā)生[11]。

為了確切證明不同高原低氧暴露時(shí)長(zhǎng)對(duì)小鼠海馬組織自噬的影響，我們選擇了自噬啟動(dòng)的關(guān)鍵分子Beclin-1和介導(dǎo)自噬體膜延長(zhǎng)、閉合的關(guān)鍵分子LC3-II作為衡量海馬組織自噬活性的指標(biāo)[12-13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在急性高原低氧期，Beclin-1和LC3-II表達(dá)均明顯上調(diào)，說明急性高原低氧暴露可以激活海馬神經(jīng)元自噬過程。在亞急性高原低氧期，盡管Beclin-1在高原低氧7 d組小鼠仍然表達(dá)較高，但是LC3的表達(dá)已經(jīng)與平原組無明顯差異，表明亞急性高原低氧期海馬神經(jīng)元的自噬活性恢復(fù)到了正常水平。

綜合以上研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在急性高原低氧期，HIF-1α表達(dá)升高和自噬的激活伴隨著海馬神經(jīng)元的損傷以及小鼠負(fù)性情緒的明顯增加；而在亞急性高原低氧處理7 d組，HIF-1α表達(dá)減少和自噬活性下降伴隨著海馬神經(jīng)元損傷的減輕及小鼠情緒的正?；?。所以，我們推測(cè)，急性缺氧和自噬的大量激活直接參與了海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的損害。然而，上述過程的具體分子調(diào)控機(jī)制仍不明確。因此，在高原低氧環(huán)境下，自噬在神經(jīng)元轉(zhuǎn)歸中的確切作用有待進(jìn)一步研究。

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Influenceandimplicationofhigh-altitudehypoxiaexposureonautophagyofhippocampalneurons

MAWenke1,LUOPeng1,DAIShuhui1,YANGYuefan1,RAOWei1,PENGCheng2,WANGJiu1,FEIZhou1

1DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032;2DepartmentofNeurosurgery, 261stHospitalofChinesePeople'sLiberationArmy,Beijing100094, China

ObjectiveThis study aims to investigate the influence of high-altitude (6000 m) hypoxia exposure for different duration on negative emotions and hippocampal neuronal injury and autophagy of mouse and their interrelation.MethodsHypobaric oxygen chamber was used to simulate 6000 m altitude circumstances. Treatment groups were exposed to high-altitude hypoxia circumstances for different time, and control group was raised outside the hypobaric oxygen chamber. Elevated plus maze (EMP) test was used to investigate the negative emotions after high-altitude hypoxia exposure. The pathological morphology of hippocampal neurons in CA1 area was examined by HE staining. Expressions of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α), Bcelin-1 and microtubule-associated protein 1 light 3-II (LC3-II) was assayed by Western Blot.ResultsSignificant reductions after high altitude hypoxia exposure for 1, 3, and 14 d in the percentage of residence time and the entries in the open arms indicated by EMP test was observed. HE staining showed that the hippocampal neurons in CA1 area after high-altitude hypoxia exposure for 1, 3, and 14 d were arranged disorderly, with dilatate intercellular spaces and irregular shape and karyopyknosis. And compared with other treatment groups, injury of hippocampal neurons after 7 d high-altitude hypoxia exposure was attenuated relatively. The expressions of HIF-1α, Beclin-1 and LC3-II peaked after high altitude hypoxia exposure for 1 d and then decreased. At treatment for 7 d, there were no significant difference in the expressions of HIF-1α and LC3-II compared with the control group.ConclusionAt high-altitude hypoxia circumstances, increased negative emotions of mouse were related with the damage of hippocampal neurons, and the activation of autophagy may be involved in the damage of hippocampal neurons.

High-altitude hypoxia; Negative emotions; Hippocampal neurons; Autophagy

1671-2897(2017)16-120-04

R 651

A

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目資助項(xiàng)目 (81430043)

馬文科，碩士研究生，E-mail: mwkcqmu@163.com

*通訊作者： 費(fèi)舟，教授、主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail: feizhou@fmmu.edu.cn

2016-06-11；俢回日期：2016-09-10)