誘導(dǎo)型神經(jīng)干細(xì)胞對顱腦創(chuàng)傷后免疫細(xì)胞的影響

高謀 徐如祥 王海峰 許民輝 董勤 姚慧 張巖楊陽 黨圓圓 張洪鈿 楊志軍

·基礎(chǔ)研究·

誘導(dǎo)型神經(jīng)干細(xì)胞對顱腦創(chuàng)傷后免疫細(xì)胞的影響

高謀1徐如祥1王海峰2許民輝1董勤1姚慧1張巖1楊陽1黨圓圓1張洪鈿1楊志軍1

目的研究誘導(dǎo)型神經(jīng)干細(xì)胞（iNSCs）移植對顱腦創(chuàng)傷（TBI）后小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的影響。方法采用自由落體腦打擊裝置制備C57BL/6小鼠TBI模型，將1×106個iNSCs移植到TBI小鼠腦內(nèi)，于移植后7 d處死動物，取材進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究。用雙重免疫熒光染色，分別觀察iNSCs移植對TBI小鼠腦內(nèi)ED1和Iba1抗體雙陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞、GFAP抗體陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞以及NeuN抗體陽性神經(jīng)元的影響。結(jié)果TBI后小鼠腦內(nèi)可見大量ED1和Iba1抗體雙陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞和GFAP抗體陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，而iNSCs移植物明顯減少了ED1和Iba1抗體雙陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞和GFAP抗體陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，并且明顯減輕了NeuN抗體陽性的神經(jīng)元的凋亡。結(jié)論iNSCs移植物在TBI小鼠腦內(nèi)，可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)，抑制反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，有利于神經(jīng)元存活。

誘導(dǎo)型神經(jīng)干細(xì)胞； 小膠質(zhì)細(xì)胞； 星形膠質(zhì)細(xì)胞； 顱腦創(chuàng)傷； 移植

近年來，越來越多的研究報道了干細(xì)胞移植在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中所發(fā)揮的作用和機(jī)制[1]。既往研究已經(jīng)證實(shí)由個體體細(xì)胞經(jīng)過體外重編程操作而獲得的誘導(dǎo)型神經(jīng)干細(xì)胞（induced neural stem cells，iNSCs）可在同源宿主腦內(nèi)長期存活，并能分化為神經(jīng)細(xì)胞，且不形成腫瘤也不引起免疫排斥反應(yīng)[2-4]。此外，筆者發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)移植的iNSCs能夠促進(jìn)大腦中動脈栓塞動物的神經(jīng)功能恢復(fù)[2]。然而，有學(xué)者認(rèn)為iNSCs移植并未起到細(xì)胞替代的作用[5]?？梢?，針對iNSCs移植的療效和作用機(jī)制仍有待闡明。理論上，iNSCs的生物學(xué)特性類似于NSCs，現(xiàn)已知NSCs可與多種免疫細(xì)胞相互作用，抑制顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）后炎癥反應(yīng)，為神經(jīng)細(xì)胞存活創(chuàng)造適宜的微環(huán)境[6-8]。然而，國內(nèi)外少有研究報道iNSCs移植對TBI后炎癥反應(yīng)的作用。為此，本研究用自由落體腦打擊裝置制備了C57BL/6小鼠TBI模型，并將由C57BL/6小鼠胚胎成纖維細(xì)胞直接重編程產(chǎn)生的iNSCs經(jīng)立體定向注射到TBI小鼠腦內(nèi)，通過觀察腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，探討iNSCs移植是否影響TBI后炎癥反應(yīng)及其作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物

健康成年雄性C57BL/6小鼠40只，體質(zhì)量24～30 g。所有實(shí)驗(yàn)動物（無特定病原體級）均購于北京維通利華公司。

二、主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

儀器：CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），超凈工作臺（美國ESCO公司），倒置相差顯微鏡、CM1950冰凍切片機(jī)、TCS SP5Ⅱ激光共聚焦顯微鏡和DM3000熒光顯微鏡（德國Leica公司），小鼠數(shù)字化腦立體定向儀（美國Stoelting公司）。

試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、B27、堿性成纖維細(xì)胞生長因子 （basic fibroblast growth factor，bFGF）、 表 皮 生 長 因 子 （epidermal growth factor，EGF）、Accutase 酶、左旋谷酰胺和磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffered solution，PBS）（美國Invitrogen公司），牛血清白蛋白 （bovine serum albumin，BSA）（美國 Sigma公司），ED1 抗體（工作濃度：5 μg/ml）和 Iba1 抗體（工作濃度：1 μg/ml）（美國Abcam 公司），GFAP 抗體 （工作濃度：0.5 μl/ml）（美國 CST 公司），NeuN 抗體（工作濃度：5 μg/ml）（美國Millipore公司），Alexa Fluor?633標(biāo)記驢抗小鼠ED1 抗體（工作濃度：2 μg/ml）、Alexa Fluor? 555 標(biāo)記驢抗山羊 Iba1 抗體 （工作濃度：2 μg/ml）、Alexa Fluor? 633標(biāo)記山羊抗兔GFAP抗體（工作濃度：2 μg/ml）和Alexa Fluor? 555標(biāo)記驢抗小鼠NeuN抗體 （工作濃度：2 μg/ml）（美國 Life Tech 公司），4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美國 SouthernBiotech 公司）。

三、C57BL/6小鼠iNSCs體外培養(yǎng)

由C57BL/6小鼠胚胎成纖維細(xì)胞經(jīng)過體外重編程操作而產(chǎn)生的iNSCs用含 2%B27、20 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF、0.05%BSA 和 2 mmol/l左旋谷酰胺的DMEM/F12與Neurobasal等體積混合培養(yǎng)基培養(yǎng)。用Accutase酶消化法制備單細(xì)胞懸液，并用PBS漂洗3遍，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個/μl放置于離心管中冰浴。

四、C57BL/6小鼠TBI模型制備和iNSCs移植

用異氟烷氣體麻醉劑麻醉小鼠，并將其固定于腦立體定向儀上，備皮消毒，鋪無菌洞巾，切開皮膚，暴露前囟，以lambda縫向喙側(cè)2.0 mm、中線偏右側(cè)2.0 mm為撞擊點(diǎn)。用自由落體腦打擊裝置，撞針直徑3.0 mm，制備TBI模型。設(shè)置假手術(shù)（sham）組（10只），僅切開頭皮，不實(shí)施撞擊。于傷后1 h對30只TBI小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分（neurological severity scores，NSS），將 NSS 為 4～8 分者（20 只）納入TBI組并隨機(jī)分為2組：iNSCs移植組 （10只）和PBS處理組（10只）。于TBI后12 h，再次麻醉小鼠，并將其固定于腦立體定向儀上，消毒鋪巾，暴露前囟，以lambda縫向喙側(cè)5.0 mm、中線偏右側(cè)1.0 mm、硬膜下2.0 mm為注射位點(diǎn)，用25 μl 22 s微量進(jìn)樣器以0.5 μl/min的速度注射5 μl細(xì)胞懸液，細(xì)胞總量為1×106個，結(jié)束后留針5 min，縫合頭皮。PBS處理組以同樣方式注射等體積PBS。

五、腦組織冰凍切片、病理染色和雙重免疫熒光染色

細(xì)胞移植后7 d采用隨機(jī)數(shù)字表法從各組中選取6只動物進(jìn)行處死，灌注固定后取出大腦，并作大腦冠狀面連續(xù)冰凍切片，切片厚度為10 μm。用蘇木素-伊紅染色觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)特征。根據(jù)病理染色結(jié)果挑選腦組織切片進(jìn)行雙重免疫熒光染色，用10%BSA/0.3%TritonX-100封閉1 h后，分別加入 ED1 抗體（工作濃度：5 μg/ml）、Iba1 抗體（工作濃度：1 μg/ml）、GFAP 抗體 （工作濃度：0.5 μl/ml）和NeuN 抗體（工作濃度：5 μg/ml）在 4℃孵育過夜。 用PBS漂洗后，分別加入Alexa Fluor?633標(biāo)記驢抗小鼠 ED1 抗體 （工作濃度：2 μg/ml）、Alexa Fluor?555標(biāo)記驢抗山羊Iba1抗體 （工作濃度：2 μg/ml）、Alexa Fluor?633標(biāo)記山羊抗兔GFAP抗體（工作濃度：2 μg/ml） 和 Alexa Fluor?555 標(biāo)記驢抗小鼠NeuN 抗體（工作濃度：2 μg/ml），室溫避光孵育 2 h。用DAPI染細(xì)胞核，封片后，在熒光顯微鏡下觀察，在20×鏡下隨機(jī)選取6個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)（特異性抗體標(biāo)記）和總細(xì)胞數(shù)（DAPI標(biāo)記），計算陽性細(xì)胞百分率（%）=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

六、統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理分析。小鼠腦內(nèi)ED1和Iba1抗體雙陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞、GFAP抗體陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞和NeuN抗體陽性神經(jīng)元的數(shù)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，資料先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計算F值和P值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、INSCs移植物減少TBI小鼠腦內(nèi) ED1和Iba1抗體雙陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量

在TBI后7 d，sham組小鼠腦組織中少見Iba1抗體陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)ED1（圖1）。與之相比，PBS處理組小鼠腦組織中可見大量ED1和Iba1抗體雙陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞 （圖1）。此外，研究發(fā)現(xiàn)iNSCs移植組小鼠腦組織中雖然可見大量Iba1抗體陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞，但是僅有少數(shù)Iba1抗體陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)ED1（圖1）。經(jīng)統(tǒng)計分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)：與sham組相比，PBS處理組和iNSCs移植組小鼠腦組織中ED1和Iba1抗體雙陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表 1）。然而，與PBS處理組相比，iNSCs移植組小鼠腦組織中ED1和Iba1抗體雙陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表 1）。

二、iNSCs移植物減少TBI小鼠腦內(nèi)GFAP抗體陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量

在TBI后7 d，sham組小鼠腦組織中少見GFAP抗體陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，而可見大量排列規(guī)則的NeuN抗體陽性的神經(jīng)元（圖2）。與之相比，PBS處理組小鼠腦組織中可見大量GFAP抗體陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞而少見NeuN抗體陽性的神經(jīng)元 （圖2）。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：與sham組相比，PBS處理組和iNSCs移植組小鼠腦組織中GFAP抗體陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表 1）。 然而，與 PBS 處理組相比，iNSCs移植組小鼠腦組織中GFAP抗體陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。 此外，與sham組相比，PBS處理組和iNSCs移植組小鼠腦組織中NeuN抗體陽性的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表 1）。 而與 PBS 處理組相比，iNSCs移植組小鼠腦組織中NeuN抗體陽性的神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表 1）。

圖1 誘導(dǎo)型神經(jīng)干細(xì)胞移植物減少顱腦損傷小鼠腦內(nèi)ED1和Iba1抗體雙陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量（×400）

討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞是TBI后炎癥反應(yīng)的重要參與者，二者可接受多種類型的刺激，通過調(diào)整自身活化狀態(tài)，做出應(yīng)答，從而在介導(dǎo)神經(jīng)損傷與修復(fù)等病理生理過程中發(fā)揮出關(guān)鍵性作用[9-11]。與既往文獻(xiàn)報道相符，筆者觀察到TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并以ED1抗體陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞活化為主[12,13]。ED1抗體陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，因而ED1抗體陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量與TBI后炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)iNSCs移植物可有效減少TBI小鼠腦內(nèi)ED1抗體陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，這不僅再次證明了iNSCs移植物在同源宿主腦內(nèi)不會引起免疫排斥反應(yīng)，也表明了iNSCs移植物可通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)從而減輕TBI后炎癥反應(yīng)。

在TBI后，小膠質(zhì)細(xì)胞激活的同時會伴有反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生[15,16]。與ED1抗體陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞相似，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的程度也可反映TBI后炎癥反應(yīng)的程度[17,18]。現(xiàn)已知，TBI后炎癥反應(yīng)中，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生對神經(jīng)修復(fù)和神經(jīng)再生而言是一柄雙刃劍，可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，也可因?yàn)檫^度增生而引起繼發(fā)性神經(jīng)損傷[19]。在TBI小鼠腦內(nèi)，筆者觀察到反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生形成的膠質(zhì)瘢痕，這些膠質(zhì)瘢痕能夠形成一種屏障，阻礙軸突生長而不利于神經(jīng)發(fā)生。通過移植iNSCs，本研究發(fā)現(xiàn)TBI小鼠腦內(nèi)膠質(zhì)瘢痕明顯減少了，這說明iNSCs移植物能夠抑制反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，起到減輕炎癥反應(yīng)的作用。此外，在接受iNSCs移植物的TBI小鼠腦內(nèi)，可發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元數(shù)量明顯增加了，由此可知，移植iNSCs發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)的作用。

表1 顱腦損傷后7 d，各組小鼠腦內(nèi)特異性抗體標(biāo)記細(xì)胞的百分率（x±s，%）

圖2 誘導(dǎo)型神經(jīng)干細(xì)胞移植物減少顱腦損傷小鼠腦內(nèi)GFAP抗體陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量（×400）

綜上所述，iNSCs移植物可影響TBI后炎癥反應(yīng)中小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。在TBI后早期移植iNSCs能通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)，抑制反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，減輕炎癥反應(yīng)，起到神經(jīng)保護(hù)作用，從而有利于神經(jīng)元存活。雖然本研究也已明確iNSCs能抑制TBI后炎癥反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并基本闡明其作用機(jī)制是iNSCs與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)免疫效應(yīng)細(xì)胞間的相互作用，但在后續(xù)研究中，筆者仍將重點(diǎn)關(guān)注iNSCs是如何影響小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的。

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Effects of induced neural stem cells on immune cells following traumatic brain injury

Gao Mou1, Xu Ruxiang1,Wang Haifeng2,Xu Minhui1,Dong Qin1,Yao Hui1,Zhang Yan1,Yang Yang1,Dang Yuanyuan1,Zhang Hongtian1,Yang Zhijun1.1Affiliated Bayi Brain Hospital,General Hospital of PLA Army,Beijing 100700,China;2Department of Neurotrauma,First Hospital of Jilin University,Changchun 130021,China

Xu Ruxiang,Email:zjxuruxiang@163.com

Objective To study the effects of grafted induced neural stem cells (iNSCs)on microglia activation states and reactive astrogliosis following traumatic brain injury(TBI). Methods TBI models were established using a standardized weight-drop device.At 12 h after TBI,a total of 1×106iNSCs were transplanted into the brains of TBI mice.On day 7 after TBI,animals were sacrificed for morphological analysis.Double-labeling experiments were utilized to determine the effects of iNSC grafts on ED1-and Iba1-positive microglia,GFAP-positive astrocytes and NeuN-positive neurons in the brains of TBI mice. Results Following TBI,we observed dramatic increases in the numbers of ED1-and Iba1-positive microglia and GFAP-positive astrocytes in the brains of TBI mice.However,grafted iNSCs significantly suppressed the numbers of ED1-and Iba1-positive microglia and GFAP-positive astrocytes in the brains of TBI mice.Additionally,iNSC grafts substantially reduced the levels of apoptotic NeuN-positive neurons in the brains of TBI mice. Conclusion INSC grafts can modulate microglia activation states and inhibit reactive astrogliosis to promote neuronal survival post-TBI.

Induced neural stem cell; Microglia; Astrocyte; Traumatic brain injury;Transplantation

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.06.008

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81671189；全軍“十三五”軍事醫(yī)學(xué)創(chuàng)新工程項(xiàng)目（16CXZ001）

100700 北京，陸軍總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院1；130021長春，吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)創(chuàng)傷外科2

徐如祥，Email：zjxuruxiang@163.com

2017-10-26）

馬帥）

高謀,徐如祥,王海峰,等.誘導(dǎo)型神經(jīng)干細(xì)胞對顱腦創(chuàng)傷后免疫細(xì)胞的影響[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2017,3(6):355-359.