5株優(yōu)良抑菌活性乳酸菌對全株玉米青貯品質(zhì)的影響

雷趙民，王建福，吳建平，何軼群，吳潤，姜輝，萬學(xué)瑞*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

5株優(yōu)良抑菌活性乳酸菌對全株玉米青貯品質(zhì)的影響

雷趙民1，王建福1，吳建平1，何軼群2，吳潤2，姜輝1，萬學(xué)瑞2*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

為了探討具有優(yōu)良抑菌活性的乳酸菌對全株玉米青貯過程不同時期營養(yǎng)品質(zhì)的影響，進(jìn)一步驗證并篩選出可提高玉米秸稈青貯品質(zhì)的乳酸菌接種劑，將實驗室前期從甘肅各地玉米秸稈青貯飼料中分離篩選獲得的5株產(chǎn)酸快、多，且具有抑菌活性的優(yōu)良乳酸菌分別添加到全株玉米秸稈中進(jìn)行青貯，共設(shè)置6個試驗組，分別在青貯第3、7、15、30天測定產(chǎn)物的干物質(zhì)(DM)、粗蛋白(CP)、可溶性碳水化合物(WSC)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和氨態(tài)氮(NH3-N)含量及第30 天乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)含量。結(jié)果顯示，發(fā)酵30 d后，5個處理組的DM、CP、ADF和LA含量顯著高于對照組(Plt;0.05)，NH3-N和WSC含量顯著低于對照組(Plt;0.05)，B3-1組NDF顯著高于對照組(Plt;0.05)，但與其他處理組差異不顯著(Pgt;0.05)，B3-1和B5-2組AA含量顯著高于對照組(Plt;0.05)，但與其他處理組差異不顯著(Pgt;0.05)；各組DM、CP、WSC含量均隨發(fā)酵時間延長而降低，而ADF、NDF和NH3-N含量均隨發(fā)酵時間的延長而升高；B3-1組在玉米秸稈全株青貯發(fā)酵各期的發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)最優(yōu)。以上結(jié)果表明5株乳酸菌均能顯著改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)，其中植物乳桿菌B3-1的效果最好。

全株玉米；營養(yǎng)品質(zhì)；植物乳桿菌B3-1；發(fā)酵品質(zhì)

青貯過程是一個復(fù)雜的微生物發(fā)酵體系，如何快速的讓乳酸菌迅速地成為優(yōu)勢菌群主導(dǎo)發(fā)酵過程是提高青貯質(zhì)量，減少干物質(zhì)和能量損失的核心問題，為彌補(bǔ)發(fā)酵底物中乳酸菌數(shù)量的不足，添加優(yōu)良乳酸菌以調(diào)控該微生物發(fā)酵體系是一個行之有效的方法，已經(jīng)有許多成功的例子[1-2]。如在意大利黑麥草(Loliummultiflorum)中添加乳酸菌使pH值及揮發(fā)性氮與全氮比值降低，提高了L(+)乳酸的生成比率，改善了青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)[3]。一般認(rèn)為，同型發(fā)酵乳酸菌因乳酸產(chǎn)率高，能迅速降低青貯飼料的pH值而抑制有害微生物的活動，從而能改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)；異型發(fā)酵乳酸菌雖然累積乳酸的能力不如同型發(fā)酵乳酸菌，但其除了能產(chǎn)生乳酸外，還可產(chǎn)生能有效抑制需氧性微生物如酵母菌和霉菌的乙酸，從而抑制青貯開封后的二次發(fā)酵，提高有氧穩(wěn)定性，減少取用和飼喂過程中的營養(yǎng)損耗[4-7]。目前，已報道能提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性的乳酸菌主要是布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)，如全株玉米(Zeamays)中添加布氏乳桿菌進(jìn)行青貯，可降低青貯飼料的乳酸濃度，提高乙酸濃度，降低酵母菌數(shù)量，提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性[8]。目前，國內(nèi)外已有許多生物添加劑成功應(yīng)用于飼料青貯，但由于這種生物添加劑受環(huán)境影響較大，出現(xiàn)了一些不同的研究結(jié)果[9]。因此，篩選更多的能促進(jìn)青貯發(fā)酵、改善青貯飼料品質(zhì)并具有抑制青貯飼料二次發(fā)酵潛力的優(yōu)勢乳酸菌勢在必行。

作為青貯添加劑的優(yōu)良乳酸菌必須具有較強(qiáng)的附著能力和生長能力[10]，而從青貯原料或青貯飼料中分離篩選乳酸菌最容易滿足以上要求。雖然關(guān)于玉米青貯的乳酸菌已有較多報道[11-12]，但還沒有適合甘肅地區(qū)全株玉米青貯的乳酸菌接種劑，本實驗室前期從甘肅各地玉米秸稈青貯飼料中分離篩選獲得5株青貯用優(yōu)良乳酸菌，其中植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)B3-1產(chǎn)酸較快、較多，且其培養(yǎng)上清液對供試的金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門菌、大腸桿菌和酵母菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性，腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)B1-7、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)B2-3、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)B5-2、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)E2-3分別在分離的同類型乳酸菌中產(chǎn)酸和抑菌特性均最優(yōu)[13]。分別將以上5株乳酸菌作為接種劑，在實驗室條件下開展全株玉米青貯試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在青貯過程和有氧暴露后，分別添加5種篩選乳酸菌的各處理組乳酸菌總數(shù)均顯著高于對照組，而好氧細(xì)菌、酵母菌和霉菌數(shù)量均顯著低于對照組，pH亦低于對照組，其中植物乳桿菌B3-1處理組差異最為顯著，表明這5株乳酸菌尤其植物乳桿菌B3-1具有提高青貯飼料品質(zhì)和抑制二次發(fā)酵的潛力[14]。為驗證其對全株玉米青貯發(fā)酵過程營養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)的影響，本研究通過跟蹤分析青貯過程不同階段青貯飼料的營養(yǎng)成分、有機(jī)酸和氨態(tài)氮的動態(tài)變化，綜合評價接種的乳酸菌對全株玉米青貯的調(diào)控效果，進(jìn)一步驗證和篩選在青貯發(fā)酵過程不同階段起主要作用的優(yōu)良乳酸菌，為進(jìn)一步組合制備更適合甘肅地區(qū)全株玉米青貯用復(fù)合乳酸菌接種劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌種與儀器

供試乳酸菌包括：腸膜明串珠菌腸膜亞種B1-7、戊糖片球菌B2-3、植物乳桿菌B3-1、屎腸球菌B5-2、發(fā)酵乳桿菌E2-3均由本實驗室分離鑒定并保存。

1.2青貯飼料的調(diào)制

2012年9月，自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院產(chǎn)學(xué)研基地(甘肅省臨洮縣)采集蠟熟期青貯用全株玉米，經(jīng)切割機(jī)切成1～2 cm左右混勻即為青貯原料，用微波爐進(jìn)行快速干燥，以掌握含水量，當(dāng)萎蔫至含水量達(dá)到70%左右(過夜)進(jìn)行青貯。各供試乳酸菌用MRS(deMan-Rogosa-Sharpe)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，調(diào)濃度為1×109cfu/mL，按5 mL/kg青貯原料添加，即5×106cfu/g。試驗設(shè)6個處理：腸膜明串珠菌腸膜亞種B1-7組(B1-7)；戊糖片球菌B2-3組(B2-3)；植物乳桿菌B3-1組(B3-1)；屎腸球菌B5-2組(B5-2)；發(fā)酵乳桿菌E2-3組(E2-3)；不添加乳酸菌的液體MRS培養(yǎng)基為對照組(CK)。

將菌液用滅菌噴壺均勻噴灑于切碎的玉米秸稈上混勻。按500 g/袋裝入聚乙烯包裝袋中，按緊、壓實，利用真空封口機(jī)抽氣封口，每個處理30個重復(fù)。于恒溫環(huán)境(20 ℃)中進(jìn)行發(fā)酵，分別在青貯第3、7、15、30天取樣，每處理每次隨機(jī)取3袋，測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3營養(yǎng)成分分析

采集的青貯樣品于65 ℃烘干后粉碎過0.425 mm(40目)篩，干物質(zhì)(dry matter，DM)、粗蛋白(crude protein，CP)、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrates，WSC)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)等的分析按照《動物營養(yǎng)學(xué)實驗教程》中的方法進(jìn)行[15]。

1.4發(fā)酵品質(zhì)分析

乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)和丁酸(butyric acid，BA)的含量分析采用液相色譜法[5]，在蘭州大學(xué)化學(xué)測試中心進(jìn)行；氨態(tài)氮(ammonia nitrogen，NH3-N)含量測定采用苯酚-次氯酸鈉比色法進(jìn)行[16]，以NH3-N 占總氮(total nitrogen，TN)的百分比表示[16]。

1.5統(tǒng)計分析

已于2018年8月7日重新生效的第1245條要求，總統(tǒng)對“被認(rèn)定為在明知情況下直接或間接向伊朗銷售、供應(yīng)、轉(zhuǎn)移，或從伊朗轉(zhuǎn)移會被應(yīng)用于能源領(lǐng)域的石墨、金屬原料或半成品金屬（例如鋁、鋼、煤，以及集成工業(yè)過程中使用的軟件）”的人實施至少5項報復(fù)性制裁。

用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，試驗結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，Plt;0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1玉米青貯原料營養(yǎng)成分

青貯前全株玉米粉碎后測定的營養(yǎng)成分結(jié)果如表1所示，原料的含糖量和含水量符合青貯飼料調(diào)制要求。

2.2不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段DM的影響

不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段DM的影響見表2，各處理組和對照組的DM含量隨發(fā)酵進(jìn)行逐漸減小，青貯前7 d各處理組DM含量與對照組差異不顯著；從第15天開始有差異，到第30天時各處理組的DM含量與對照組相比均差異顯著(Plt;0.05)，其中B3-1處理組的DM含量最高，青貯過程中DM損失最少，為2.22%，而對照組的損失為4.15%。

表1 全株玉米青貯前營養(yǎng)成分Table 1 The chemical compositions of whole crop corn before ensiling

FM: Fresh weight; DM: Dry matter; CP: Crude protein; WSC: Water soluble carbohydrates; NDF: Neutral detergent fiber; ADF: Acid detergent fiber. 下同The same below.

2.3不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段WSC的影響

不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段WSC的影響見表3，隨著青貯時間延長，各處理組和對照組的WSC含量均逐漸降低，前7 d下降較快，之后下降速度減慢，且對照組的WSC含量始終高于各處理組。青貯初期，B1-7處理組和B5-2處理的WSC含量顯著低于其他處理組和對照組，從第15天開始，B3-1處理組的WSC含量最低，與對照組差異顯著(Plt;0.05)，但與其他處理組差異不顯著。

2.4不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段CP的影響

不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段CP的影響見表4，各處理組和對照組的CP含量隨青貯時間延長均逐漸緩慢降低，青貯最初7 d，各處理組和對照組的CP含量無顯著差異，從第15天開始，對照組的CP含量顯著低于各處理組；第30天時對照組的CP含量是原料的91.0%，相對下降最多，而 B3-1處理組變化最小，依然含有原料的96.2%。

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(Plt;0.05)，下同。

Notes: The different letters in the same row mean significant differences atPlt;0.05, the same below.

表3 不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段WSC的影響Table 3 Effect of different strains of lactic acid bacteria on WSC in whole corn silage process %, DM

表4 不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段CP的影響Table 4 Effect of different strains of lactic acid bacteria on CP in whole corn silage process %, DM

2.5不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段NDF的影響

由表5可見，在青貯過程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行各處理組和對照組的NDF含量均逐漸增加，最初7 d，變化幅度較小，且各組間無顯著差異；從第15天開始，變化幅度明顯增加，其中B3-1處理組變化最大，顯著高于對照組(Plt;0.05)，但與其他各處理組差異不顯著(Pgt;0.05)。

表5 不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段NDF的影響Table 5 Effect of different strains of lactic acid bacteria on NDF in whole corn silage process %, DM

2.6不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段ADF的影響

由表6可見，在青貯過程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行各處理組和對照組的ADF含量均逐漸增加，青貯初期各組間無顯著差異；從第15天開始，B3-1處理組的ADF含量顯著高于其他處理組和對照組(Plt;0.05)，但其他處理組間及其與對照組差異不顯著。

表6 不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段ADF的影響Table 6 Effect of different strains of lactic acid bacteria on ADF in whole corn silage process %, DM

2.7不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段NH3-N的影響

不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段NH3-N的影響見表7，青貯期各處理組和對照組的NH3-N含量均逐漸增加，且對照組始終最高，與各處理組差異顯著(Plt;0.05)，B3-1處理組始終較低。

表7 不同乳酸菌對全株玉米青貯不同階段NH3-N的影響Table 7 Effect of different strains of lactic acid bacteria on NH3-N in whole corn silage process %, TN

2.8不同乳酸菌對全株玉米青貯飼料有機(jī)酸的影響

青貯發(fā)酵第30 天產(chǎn)物中有機(jī)酸含量結(jié)果見表8，各處理組及對照組均未檢測到丙酸和丁酸，B3-1、B2-3和B5-2組的LA含量最高，顯著高于對照組和其他兩組(Plt;0.05)，B3-1和B5-2組AA含量最高，顯著高于對照組(Plt;0.05)，但與其他3個處理組差異不顯著(Pgt;0.05)。B3-1組LA+AA的含量最高，對照組最低，B2-3組的LA/AA最高，B1-7組LA/AA最低。

表8 不同乳酸菌對全株玉米青貯飼料有機(jī)酸的影響Table 8 Effect of different strains of lactic acid bacteria on organic acid in whole corn silage

注：“-”表示未檢出。

Notes: “-” means organic acid was undetected.

3 討論

青貯發(fā)酵能否成功取決于以下3個必要條件[10]：適合的微生物菌群結(jié)構(gòu)，即青貯原料中的有益微生物如乳酸菌需達(dá)到一定數(shù)量，若能達(dá)到105cfu/g則有希望獲得品質(zhì)優(yōu)良的青貯飼料[17]，而有害微生物如腐敗菌、酵母菌和霉菌等的數(shù)量應(yīng)相對較低；充足的可溶性碳水化合物，提供乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸所需的底物；適當(dāng)?shù)奈锢?化學(xué)環(huán)境，即通過規(guī)范的青貯技術(shù)和有益微生物的活動創(chuàng)造厭氧和酸性環(huán)境。本試驗所使用的全株玉米收獲切割后萎蔫至含水量為71.14%，可溶性碳水化合物含量為干物質(zhì)的14.92%，可滿足秸稈類作物表面附生的乳酸菌及添加的乳酸菌生長繁殖的需要；中性洗滌纖維含量比較高，為干物質(zhì)的52.17%，這一部分是秸稈類飼料利用率的瓶頸，若青貯添加劑中含有分解這類纖維類物質(zhì)的酶或產(chǎn)酶微生物，不僅有利于乳酸菌的發(fā)酵，還能提高青貯飼料的營養(yǎng)價值。

全株玉米是制作青貯飼料的主要原料，只要掌握好合適的水分含量，青貯就容易成功，但其自身的乳酸菌數(shù)量往往較低，不能在較短的時間內(nèi)快速成為優(yōu)勢菌群，從而造成青貯原料營養(yǎng)和能量的損失，且開窖后容易發(fā)生二次發(fā)酵，引起青貯飼料營養(yǎng)和能量的進(jìn)一步損失，甚至腐爛變質(zhì)。在青貯過程中加入乳酸菌制劑可以提高其青貯發(fā)酵品質(zhì)[18]，添加植物乳桿菌能顯著降低青貯飼料的pH值并提高乳酸含量[19]，本試驗結(jié)果表明，在青貯第30天，添加乳酸菌各處理組的LA和AA含量均顯著高于對照組(Plt;0.05)，表明添加的各乳酸菌均能很好的定植，并能在青貯發(fā)酵過程中起到重要的作用；其中同型發(fā)酵乳酸菌B3-1、B2-3、B5-2處理組的LA含量相近，顯著高于異型發(fā)酵乳酸菌B1-7和E2-3處理組，B3-1處理組最高，這主要是因為同型發(fā)酵乳酸菌在青貯發(fā)酵過程中的主要產(chǎn)物是乳酸。另外，以上3個同型發(fā)酵乳酸菌處理組的AA含量也較高，可能與青貯原料上本來附著的乳酸菌的類型和數(shù)量有關(guān)，推測原料中附著的乳酸菌可能以異型發(fā)酵乳酸菌為主。因原料中附著的乳酸菌數(shù)量較大，達(dá)到8.61×105cfu/g，與添加的乳酸菌數(shù)量相當(dāng)，因此添加的同型乳酸菌快速產(chǎn)酸，抑制了有害微生物的繁殖，同時有利于附著異型發(fā)酵乳酸菌的繁殖，導(dǎo)致LA和AA含量均升高。有研究報道同型乳酸菌發(fā)酵能提高青貯飼料品質(zhì)，但是在青貯窖打開后的有氧穩(wěn)定性降低了[20-21]，是因為乙酸的產(chǎn)量較低，降低了其抑制霉菌等有害菌的能力，故在青貯發(fā)酵試驗中乙酸的產(chǎn)量增加也不能片面地認(rèn)為青貯品質(zhì)降低。

在青貯發(fā)酵初期，各添加乳酸菌的處理組DM、CP、NH3-N、NDF、ADF和WSC的含量與對照組無顯著差異，從青貯第7天開始有變化，到青貯第30天，各處理組的DM、CP、NDF和ADF含量顯著高于對照組，而WSC和NH3-N含量顯著低于對照組，B3-1處理組差異最為顯著，表明青貯發(fā)酵過程中添加的和附著的乳酸菌活動消耗了一定量的WSC，同時產(chǎn)生的有機(jī)酸抑制了有害微生物活動，抑制了腐敗微生物對含氮化合物的分解，從而減少了DM和CP損失[22-23]，增加了NDF和ADF在干物質(zhì)中所占比率，其中B3-1處理組的DM損失僅為2.22%，CP損失為3.8%，NH3-N占總氮的6.05%，小于10%[24]，品質(zhì)最優(yōu)。

4 結(jié)論

添加乳酸菌能有效地增加全株玉米青貯過程中LA、AA的含量，減少CP損失，降低NH3-N含量，顯著改善了青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)，其中植物乳桿菌B3-1的效果最好。

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Effectof5strainsofLacticacidbacteriawithantibacterialactivityonthecornsilagequality

LEI Zhao-Min1, WANG Jian-Fu1, WU Jian-Ping1, HE Yi-Qun2, WU Run2, JIANG Hui1, WAN Xue-Rui2*

1.College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2.College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China

To investigate the effect of lactic acid bacteria (LAB) with antibacterial activity on the quality of corn silage during ensiling, and screen LAB inoculant that could improve the quality of silage, 5 strains of LAB (B1-7, B2-3, B3-1, B5-2, E2-3) isolated from corn silage across Gansu province were added to make corn silage, the contents of dry matter (DM), crude protein (CP), water soluble carbohydrates (WSC), neutral detergent fiber (NDF), acid detergent fiber (ADF), ammonia nitrogen (NH3-N), lactic acid (LA), acetic acid (AA), propionic acid (PA) and butyric acid (BA) were analyzed. Results showed that for silage at 30 days, the content of DM, CP, ADF and LA was significantly increased in 5 LAB strains treatment groups compared with the control group, and the content of NH3-N and WSC was decreased. The NDF content in silage inoculated with the B3-1 LAB strain was significantly higher than the control (Plt;0.05), with the other 4 LAB strains being intermediate, while the content of AA in B3-1 and B5-2 treated silages was significantly higher than the control but not the other 3 treatment groups. Along with the fermentation time the content of dry matter, crude protein, water soluble carbohydrates in silages of each group was decreased and the content of ADF, NDF and NH3-N increased. Overall, the silages inoculated with the B3-1 strain showed best fermentation quality and nutritive value characteristics. These results indicated that all added LAB strains improved the quality of silage, withLactobacillusplantarumB3-1 being the most effective.

whole corn; silage quality;LactobacillusplantarumB3-1; ferment quality

10.11686/cyxb2017145http//cyxb.lzu.edu.cn

雷趙民, 王建福, 吳建平, 何軼群, 吳潤, 姜輝, 萬學(xué)瑞. 5株優(yōu)良抑菌活性乳酸菌對全株玉米青貯品質(zhì)的影響. 草業(yè)學(xué)報, 2017, 26(11): 77-84.

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2017-03-28；改回日期：2017-05-31

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目(GNSW. 2012-25)，農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(20130305907)，蘭州市科技局科技計劃項目(農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)；2012-2-159)，農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(201503134)，甘肅省科技重大專項(143NKDC017)，甘肅省農(nóng)牧廳秸稈飼料化利用研究專項([2016]269號)和甘肅省科技重大專項“肉牛高效生態(tài)營養(yǎng)技術(shù)體系研究與示范”(17ZD2NC020)資助。

雷趙民(1967-)，男，甘肅正寧人，教授。E-mail：leizm@gsau.edu.cn

*通信作者Corresponding author. E-mail：383921499@qq.com