苜蓿DUS測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種SSR分子標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建

閔學(xué)陽(yáng)，劉文獻(xiàn)*，張正社，韋興燚，齊曉，張義，劉志鵬，王彥榮*

(1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2.全國(guó)畜牧總站，全國(guó)草品種審定委員會(huì)辦公室，北京 100125；3.全國(guó)畜牧總站，北京100193)

苜蓿DUS測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種SSR分子標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建

閔學(xué)陽(yáng)1，劉文獻(xiàn)1*，張正社1，韋興燚1，齊曉2，張義3，劉志鵬1，王彥榮1*

(1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2.全國(guó)畜牧總站，全國(guó)草品種審定委員會(huì)辦公室，北京 100125；3.全國(guó)畜牧總站，北京100193)

苜蓿在育種過(guò)程中，由于其異花授粉特性和骨干親本的集中使用，導(dǎo)致品種間的遺傳差異日益縮小，品種之間通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定愈加困難。通過(guò)構(gòu)建苜蓿DUS測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，可以實(shí)現(xiàn)苜蓿品種的快速、準(zhǔn)確鑒定。本研究利用篩選得到的10個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)33個(gè)苜蓿DUS測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，10對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出69個(gè)等位基因，平均每個(gè)標(biāo)記可產(chǎn)生6.9個(gè)等位基因；多態(tài)性比率(PPB)從25%到90%不等，平均值為56.7%；各SSR標(biāo)記的多態(tài)信息含量(PIC)范圍為0.56～0.87，平均值為0.75。利用不同引物間的組合能有效區(qū)分33個(gè)苜蓿 DUS標(biāo)準(zhǔn)品種，并為每份標(biāo)準(zhǔn)品種建立了唯一標(biāo)識(shí)的指紋代碼，為苜蓿品種的審定和保護(hù)以及遺傳背景分析提供了技術(shù)依據(jù)。

苜蓿; SSR標(biāo)記; 指紋圖譜; 標(biāo)準(zhǔn)品種; DUS 測(cè)試

在過(guò)去的幾十年中，隨著植物育種和種子貿(mào)易的發(fā)展，植物新品種已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)建設(shè)的重要支撐和掌握農(nóng)業(yè)發(fā)展主動(dòng)權(quán)的關(guān)鍵，因此對(duì)植物新品種進(jìn)行保護(hù)就顯得尤為重要。植物特異性、一致性和穩(wěn)定性(distinctness, uniformity and stability, DUS)測(cè)試作為植物新品種保護(hù)的技術(shù)基礎(chǔ)，授權(quán)的科學(xué)依據(jù)和判斷品種真實(shí)性的技術(shù)手段，其重要性日益突出[1]。DUS測(cè)試技術(shù)體系包括以植物農(nóng)藝學(xué)形態(tài)特征測(cè)試為主導(dǎo)的傳統(tǒng)測(cè)試技術(shù)和對(duì)基因型測(cè)試的分子輔助技術(shù)兩部分。傳統(tǒng)的DUS測(cè)試雖然具有簡(jiǎn)單直觀、經(jīng)濟(jì)方便等優(yōu)點(diǎn)，但其測(cè)試周期長(zhǎng)，受環(huán)境條件影響大，穩(wěn)定性差，需要大面積的土地和專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人才。同時(shí)隨著骨干親本的集中使用，相近品種之間的形態(tài)學(xué)差異縮小，在實(shí)際操作過(guò)程中較難執(zhí)行，進(jìn)而阻礙了新品種授權(quán)的有效性和權(quán)威性[2-3]。

近年來(lái)，以PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于植物品種鑒定和指紋圖譜構(gòu)建[4-5]。與形態(tài)性狀不同，分子標(biāo)記因具有多態(tài)性高、測(cè)試周期短、不受環(huán)境影響、易于自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)，可以在DNA水平上揭示品種間基因型的差異，為種質(zhì)資源鑒定提供了一種直接、可靠和高效的途徑[6-7]。其中，SSR(simple sequence repeat)標(biāo)記在DNA指紋鑒定上具有信息含量高、標(biāo)記數(shù)量豐富、多態(tài)信息含量高、簡(jiǎn)單快速、重復(fù)性好及共顯性遺傳的獨(dú)特優(yōu)越性，已成為當(dāng)前多種農(nóng)作物標(biāo)準(zhǔn)品種指紋圖譜構(gòu)建及DUS 測(cè)試的首選標(biāo)記[6]。作為植物新品種 DUS快速測(cè)試的核心技術(shù)之一，SSR標(biāo)記分別對(duì)水稻(Oryzasativa)[8]、玉米(Zeamays)[9]、多花黑麥草(Loliummultiflorum)[10]和柱花草(Stylosanthesspp.)[11]等物種進(jìn)行了研究，并成功將這項(xiàng)技術(shù)運(yùn)用于植物標(biāo)準(zhǔn)品種指紋圖譜構(gòu)建和新品種DUS測(cè)試中。

苜蓿(Medicagosativa)作為最重要和廣泛種植的豆科飼料作物，具有較高的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。除此之外，其在飼草生產(chǎn)、生態(tài)治理和綠肥種植中都是首選物種[12-13]。栽培苜蓿為異花授粉的同源四倍體(2n=4x=32)，主要靠種子繁殖后代。由于其為四倍體遺傳，具有多個(gè)等位基因和顯著的近交繁殖抑制特性[14-15]。因此，采用多態(tài)性共顯性標(biāo)記，例如SSR分子標(biāo)記，可從分子水平區(qū)分和鑒定雜合和純合基因座，從而輔助選擇和提高苜蓿品種開(kāi)發(fā)的效率。

在農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)技術(shù)試驗(yàn)示范(國(guó)家草品種區(qū)域試驗(yàn))項(xiàng)目的資助下，本團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)近3年的測(cè)試分析及品種評(píng)價(jià)，驗(yàn)證和完善了48個(gè)苜蓿品種的19個(gè)基本性狀田間測(cè)試技術(shù)，篩選出的33個(gè)苜蓿標(biāo)準(zhǔn)品種列入中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南 紫花苜蓿和雜花苜蓿》(NY/T2747-2015)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)文本[16]，不僅填補(bǔ)了我國(guó)苜蓿DUS測(cè)試技術(shù)體系的空白，也進(jìn)一步促進(jìn)了我國(guó)苜蓿新品種的審定和保護(hù)。為了從分子水平研究苜蓿品種間基因型的差異，本研究采用基于苜蓿開(kāi)發(fā)的引物組合，對(duì)DUS測(cè)試指南中規(guī)定的33個(gè)苜蓿標(biāo)準(zhǔn)品種構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品種指紋圖譜，并在此基礎(chǔ)上對(duì)品種間的遺傳相似性進(jìn)行分析，從分子水平上為苜蓿品種的鑒定和保護(hù)提供更加準(zhǔn)確、公正和客觀的判定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2016年9-12月進(jìn)行。本研究所用的33個(gè)苜蓿品種由國(guó)內(nèi)和國(guó)外兩部分構(gòu)成，19份國(guó)外品種由美國(guó)農(nóng)業(yè)部提供，14份國(guó)內(nèi)品種由農(nóng)業(yè)部全國(guó)畜牧總站和國(guó)家草種質(zhì)資源庫(kù)提供，均為苜蓿DUS測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)品種(表1)。以上測(cè)試材料均種植在蘭州大學(xué)臨澤試驗(yàn)站。

1.2基因組DNA的提取

對(duì)每個(gè)苜蓿品種，采用30個(gè)單株的新鮮葉片混合取樣[17]。利用CTAB法提取苜?；蚪M總DNA[18]，以1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，并用Nanodrop分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)DNA濃度和質(zhì)量(OD260/OD280≈1.8)。將DNA樣品稀釋成25 ng/μL的工作液并置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 苜蓿品種鑒定試驗(yàn)材料Table 1 Alfalfa varieties in the experiment

1.3PCR 擴(kuò)增與檢測(cè)

本研究所用的SSR引物分別選自在苜蓿中具有通用性、多態(tài)性高、重復(fù)性好的MtTFSSR[18]，MsSSR[19]及MTRmiRSSR分子標(biāo)記。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表2)。PCR反應(yīng)體系為10 μL，在PTC-200熱循環(huán)儀上進(jìn)行：模板DNA 1 μL，2×Taq PCR MasterMix 5 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 2 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃變性30 s；60～56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，共5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；于4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行檢測(cè)。樣品點(diǎn)樣量為2 μL，200 V電壓下電泳110 min，凝膠用AgNO3溶液染色，照相保存。

表2 10對(duì)SSR引物信息Table 2 Information on SSR markers used in the study

TB: Total bands; PB: Polymorphic bands; PPB: Percentage of polymorphic bands; He: Expected heterozygosity; PIC: Polymorphic information content.

1.4數(shù)據(jù)分析

通過(guò)人工比對(duì)和軟件校正，對(duì)SSR 標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。按照擴(kuò)增條帶的分子量從大到小編號(hào)讀取，相同遷移位置有帶的記為1，無(wú)帶的記為0， 建立“0，1”矩陣。根據(jù)“0，1”矩陣，統(tǒng)計(jì)SSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的總條帶數(shù)(total bands, TB)、多態(tài)性條帶數(shù)(polymorphic bands, PB)、多態(tài)性條帶比率(percentage of polymorphic bands, PPB)、預(yù)計(jì)雜合度(expected heterozygosity, He)和多態(tài)信息量(polymorphic information content, PIC)[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1SSR產(chǎn)物多態(tài)性分析

本研究采用本課題組開(kāi)發(fā)的具有較高遺傳多樣性的10 對(duì)核心SSR引物，對(duì)33個(gè)苜蓿品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析(表2)，這些引物均可擴(kuò)增出多態(tài)性高且清晰的條帶。每對(duì)引物多態(tài)性條帶數(shù)量(PB)從1(MtTFSSR-20和MTRmiR078)到9(MtTFSSR-10)不等，平均值為 4.2；10對(duì)SSR引物的多態(tài)性比率(PPB)從25%(MtTFSSR-20)到90%(MtTFSSR-10)不等，平均值為56.7%；多態(tài)信息含量(PIC)范圍為 0.56(MTRmiR078)～0.87(MtTFSSR-19, Ms-50)，平均值為0.75，這表明本研究中的33個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種具有豐富的遺傳多樣性；每個(gè)標(biāo)記預(yù)計(jì)雜合度(He)范圍為0.64(MTRmiR078)～0.88(MtTFSSR-19, Ms-50)?；谝陨辖Y(jié)果， MtTFSSR-10的PB和PPB均為最大值，MtTFSSR-19和Ms-50的PIC和He均為最大值，因此，MtTFSSR-10、MtTFSSR-19和Ms-50這3對(duì)引物在苜蓿遺傳多樣性分析及品種鑒定中具有更大的潛力。

2.2SSR引物鑒定苜蓿品種效率分析

在篩選出的10對(duì)核心SSR多態(tài)性引物中，每個(gè)多態(tài)性引物分別能擴(kuò)增出1～9 條多態(tài)性條帶，不同引物能夠區(qū)分的苜蓿品種數(shù)不同，其范圍在1～7之間(表3)。例如，引物MtTFSSR-10能擴(kuò)增出10條多態(tài)性條帶，可以一次性區(qū)分7個(gè)品種；而引物MtTFSSR-20擴(kuò)增出4條多態(tài)性條帶，僅能鑒定出Ranger一個(gè)品種。但不同引物的組合可以大大提高對(duì)不同品種的鑒別能力。例如，MtTFSSR-10引物能鑒別7個(gè)品種，與引物MtTFSSR-19組合后可鑒別品種的數(shù)量增加到16個(gè)；引物MtTFSSR-19能鑒別3個(gè)品種，與引物MtTFSSR-41組合后能鑒別的品種數(shù)增至12個(gè)。采用以上10對(duì)SSR引物對(duì)33個(gè)品種進(jìn)行分析，14個(gè)品種具有特征譜帶(表3)，即僅用1個(gè)特征引物即可將該品種與其他品種區(qū)分開(kāi)。例如，MtTFSSR-10和MtTFSSR-19均在中蘭1號(hào)上具有特征譜帶；MTRmiR079在Abi 700中具有特征譜帶(圖1)。因此在對(duì)品種鑒定時(shí)可優(yōu)先采用相應(yīng)特征引物快速鑒定。

表3 14個(gè)苜蓿品種的5對(duì)特征引物列表Table 3 Five primer pairs with specific bands for 14 alfalfa varieties

圖 1 部分SSR引物在編號(hào)為1～33的苜蓿品種中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 SSR amplification results of alfalfa varieties coded from 1 to 33 with part of primers A: MtTFSSR-10; B: MtTFSSR-19; C: MTRmiR077;M:DNA marker.

2.3苜蓿標(biāo)準(zhǔn)品種指紋圖譜的構(gòu)建

33個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種的SSR引物擴(kuò)增條帶， 詳見(jiàn)表4。 在擴(kuò)增結(jié)果中， 有條帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”。10對(duì)引物組合在一起即為苜蓿的DNA指紋圖譜，如用所有10對(duì)SSR引物，擴(kuò)增Abi 700，得到的圖譜分別為1111111111、1100001110、 0111、 111111、 11111、 111111、 011、 1110、 000111011和100111101011， 將其組合到一起為1111111111-1100001110-0111-111111-11111-111111-011-1110-000111011-100111101011(表4)。 將10對(duì)SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果組合在一起，可得到由79個(gè)“0” 和“1” 組成的數(shù)字圖譜。這些組合的數(shù)字圖譜構(gòu)成了33個(gè)苜蓿品種的組合指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。當(dāng)33條字符串形成能夠唯一標(biāo)識(shí)一份品種的字符串時(shí)，即表明這10個(gè)SSR標(biāo)記能將33份材料全部區(qū)分開(kāi)，即每一條字符串可以作為每一份品種的分子身份證號(hào)碼。

表4 33個(gè)苜蓿品種的DNA指紋圖譜Table 4 DNA fingerprint of the 33 alfalfa varieties

A: MtTFSSR-10；B: MtTFSSR-19；C: MtTFSSR-20；D: MtTFSSR-41；E: MTRmiR072；F: MTRmiR077；G: MTRmiR078；H: MTRmiR079；I: MTRmiR124；J: Ms-50.

圖2 SSR引物擴(kuò)增結(jié)果相關(guān)性分析Fig.2 The correlation analyze based on the SSR productions

利用10對(duì)核心引物在33個(gè)苜蓿品種的電泳帶型對(duì)引物間擴(kuò)增結(jié)果的相關(guān)性進(jìn)行分析。相關(guān)性分析結(jié)果如圖2所示。10對(duì)引物間，MTRmiR079與MtTFSSR-20之間相關(guān)性最強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.94，兩者之間擴(kuò)增帶型差異最??；而Ms-50與MtTFSSR-20之間相關(guān)性最差， 相關(guān)系數(shù)為-0.09，他們之間的擴(kuò)增帶型差異最大。因此，根據(jù)引物間擴(kuò)增結(jié)果的相關(guān)性高低，可以進(jìn)一步輔助在進(jìn)行品種鑒定時(shí)進(jìn)行引物間的優(yōu)化組合，即利用相關(guān)性較差的引物組合可以更加利于進(jìn)行品種間的鑒定。同時(shí)，進(jìn)一步利用10對(duì)引物在不同品種中的擴(kuò)增產(chǎn)物所對(duì)應(yīng)的分子量大小對(duì)每個(gè)品種的DNA指紋圖譜進(jìn)行作圖，從而可以更直觀地對(duì)不同品種間的差異進(jìn)行比較(圖3)。

3 討論

隨著我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展，牧草種子的市場(chǎng)需求量日趨增大，新的牧草品種急劇增加。因此，如何快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)品種純度與真實(shí)性的工作也變得越來(lái)越重要。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定法具有耗時(shí)長(zhǎng)、受環(huán)境限制、需要大量的土地面積等缺點(diǎn)[4]。隨著以PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，解決了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定法、同工酶蛋白和電泳鑒定中存在的多個(gè)問(wèn)題。目前，該技術(shù)已被成功地運(yùn)用于水稻、玉米和多花黑麥草等植物的品種鑒定中。同時(shí)，大量研究表明SSR標(biāo)記由于具有高分辨力特性及共顯性的遺傳方式，使其成為指紋構(gòu)建和品種鑒定的理想標(biāo)記技術(shù)[6,8,21]。

苜蓿品種大多為通過(guò)表型輪回選擇或大量自然選擇培育的綜合品種(群體)，有多個(gè)親本參與雜交，這就造成部分育成品種間或多或少有著親緣關(guān)系。品種的遺傳多樣性分析重在揭示品種間的親緣關(guān)系及遺傳基礎(chǔ)，在研究中只要品種間一個(gè) DNA 位點(diǎn)(片段)的基因型(帶型)不同, 便視為不同品種，篩選核心引物的重要指標(biāo)之一是可以利用DNA帶型區(qū)分更多的品種。品種指紋圖譜作為植物品種特異性檢測(cè)的分子標(biāo)記，不僅需要區(qū)別盡可能多的品種，還應(yīng)能從眾多品種中篩查出相似度高的品種。苜蓿指紋圖譜則是通過(guò)統(tǒng)計(jì)多態(tài)性條帶信息構(gòu)建的，而不同苜蓿品種的遺傳多樣性正是通過(guò)多態(tài)性位點(diǎn)差異體現(xiàn)的。本研究把10對(duì)SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果組合在一起就可以將33個(gè)苜蓿品種完全區(qū)分開(kāi)，即每個(gè)苜蓿品種都有能夠唯一標(biāo)識(shí)的一份品種字符串。苜蓿SSR指紋圖譜的構(gòu)建不僅可以為SSR標(biāo)記技術(shù)在苜蓿DUS測(cè)試中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，而且在育種策略調(diào)整和選配優(yōu)良雜交組合培育新品種等方面具有現(xiàn)實(shí)意義。

本研究中所選用10對(duì)引物中，有5對(duì)引物具有特征條帶，可以直接對(duì)14個(gè)苜蓿品種進(jìn)行鑒定。因此，若想獲得其他品種的特異性譜帶，還需要擴(kuò)大引物的篩選范圍。同時(shí)，隨著參試品種數(shù)量的增加，一些特征譜帶可能會(huì)失去其特異性，只能對(duì)特定的材料有效。研究表明，通過(guò)不同引物的有限組合能夠提高引物的鑒別效率。如張玉翠等[22]通過(guò)5對(duì)引物的有效組合，即可將32個(gè)棉花(Gossypiumhirsutum)品種完全區(qū)分開(kāi)。羅永聰?shù)萚10]利用12對(duì)引物的組合提高了引物在多花黑麥草品種間的鑒別能力，例如，01-01B引物可以鑒別12個(gè)品種，但是與引物12-10F組合后即能鑒別全部供試的21個(gè)品種。本研究結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論，如引物MtTFSSR-10能鑒別6個(gè)品種，引物MtTFSSR-19能鑒別3個(gè)品種，但是將這兩個(gè)引物組合就可以鑒別14(42%)個(gè)品種，表明本研究篩選的10對(duì)SSR引物具有多態(tài)性高和穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)，可作為一套鑒定苜蓿品種的核心引物。

值得注意的是，本研究中所用的大部分品種來(lái)源于國(guó)外，由于某些原因難以獲得其育種系譜關(guān)系，加之苜蓿為典型的異花授粉植物，具有復(fù)雜的品種遺傳基礎(chǔ)，增大了研究品種間遺傳相似性關(guān)系的難度。因此，對(duì)于異花授粉的植物，在構(gòu)建指紋圖譜及遺傳關(guān)系分析時(shí)應(yīng)該特別注意系譜關(guān)系的收集，以便于后續(xù)的分析，進(jìn)而建立更為完善的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。

4 結(jié)論

本研究以10對(duì)核心引物構(gòu)建了33個(gè)用于苜蓿DUS測(cè)試的品種的DNA指紋圖譜，可以從分子水平快速準(zhǔn)確鑒別和了解苜蓿品種的遺傳多樣性，能夠在品種鑒定和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等方面發(fā)揮積極作用，為合理利用苜蓿種質(zhì)資源和選配優(yōu)良雜交組合培育新品種提供理論依據(jù)。

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ConstructionofSSRmarkerfingerprintdatabaseofstandardalfalfavarietiesutilizingDUStests

MIN Xue-Yang1, LIU Wen-Xian1*, ZHANG Zheng-She1, WEI Xing-Yi1, QI Xiao2, ZHANG Yi3, LIU Zhi-Peng1, WANG Yan-Rong1*

1.State Key Laboratory of Grassland Argo-ecosystems, Key Laboratory of Grassland Livestock Industry Innovation, Ministry of Agriculture, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China; 2.National Animal Husbandry Service, Office of the Chinese Herbage Cultivar Registration Board, Beijing 100125, China; 3.National Animal Husbandry Service, Beijing 100193, China

Due to cross-pollinating characteristic and the excessive use of backbone materials during the alfalfa breeding, the genetic diversity of alfalfa varieties is declining, and the discrimination of different varieties through phenotypical characteristics is becoming more difficult. The construction of a DNA fingerprint database of standard alfalfa varieties through the distinctness, uniformity and stability (DUS) test can facilitate the identification of alfalfa varieties. In this study we analyzed the genetic diversity among 33 standard alfalfa varieties with a DUS test and the DNA fingerprint of each variety was constructed based on 10 SSR markers. The results showed that a total of 69 alleles were generated from the 10 SSR markers, with an average of 6.9 alleles per marker; the polymorphic ratio varied from 25% to 90%, with an average of 56.7%. The polymorphic information content per SSR marker varied from 0.56～0.87, with an average of 0.75. The 33 varieties could be clearly distinguished by the 10 SSR markers. The DNA fingerprint of each variety was established providing a technical basis for the validation and conservation of alfalfa varieties and genetic background analysis.

alfalfa; SSR markers; DNA fingerprinting; example varieties; DUS testing

10.11686/cyxb2017038http//cyxb.lzu.edu.cn

閔學(xué)陽(yáng), 劉文獻(xiàn), 張正社, 韋興燚, 齊曉, 張義, 劉志鵬, 王彥榮. 苜蓿DUS測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種SSR分子標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(11): 47-56.

MIN Xue-Yang, LIU Wen-Xian, ZHANG Zheng-She, WEI Xing-Yi, QI Xiao, ZHANG Yi, LIU Zhi-Peng, WANG Yan-Rong. Construction of SSR marker fingerprint database of standard alfalfa varieties utilizing DUS tests. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(11): 47-56.

2017-02-14；改回日期：2017-04-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31502000)，教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(IRT_17R50)，高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃(B12002)，國(guó)家草品種區(qū)域試驗(yàn)項(xiàng)目(21301060001)和蘭州大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金(lzujbky-2016-8)資助。

閔學(xué)陽(yáng)(1991-)，男，甘肅張掖人，在讀碩士。E-mail: minxy15@lzu.edu.cn

*通信作者Corresponding author. E-mail： liuwx@lzu.edu.cn， yrwang@lzu.edu.cn