奧迪亞無核與玫瑰香型葡萄雜交胚挽救技術(shù)研究

月丫，張娜，田淑芬*，溫曉敏

（1. 天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2. 天津市設施農(nóng)業(yè)研究所/天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室，天津 300192）

奧迪亞無核與玫瑰香型葡萄雜交胚挽救技術(shù)研究

月丫1,2，張娜2，田淑芬2*，溫曉敏1,2

（1. 天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2. 天津市設施農(nóng)業(yè)研究所/天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室，天津 300192）

為了培育玫瑰香型、無核、大粒葡萄新品種，以二倍體奧迪亞無核葡萄做母本，以二倍體玫瑰香葡萄和四倍體巨玫瑰葡萄作父本雜交以及奧迪亞無核自交胚珠為材料，進行不同父本、取樣時期、發(fā)育培養(yǎng)基、萌發(fā)培養(yǎng)基、激素對無核葡萄胚挽救效果影響的研究。結(jié)果顯示：雜交組合奧迪亞無核×玫瑰香的胚發(fā)育率和胚萌發(fā)率較奧迪亞無核×巨玫瑰的要高；奧迪亞無核×玫瑰香、奧迪亞無核×巨玫瑰的雜交胚珠和奧迪亞無核自交胚珠均在授粉后54 d取種的胚發(fā)育率最高；適于雜交組合奧迪亞無核×玫瑰香、奧迪亞無核×巨玫瑰雜交胚發(fā)育的培養(yǎng)基為：Nitsch+1.5 mol/L IAA+0.5 mol/L 6-BA+0.5 mol/L GA3+60 g/L蔗糖+5 g/L瓊脂+1 g/L活性炭；1/2MS和WPM均可作為奧迪亞無核×玫瑰香的胚萌發(fā)培養(yǎng)基；0.1 mg/L 6-BA濃度是奧迪亞無核×巨玫瑰的雜交肧萌發(fā)的最佳濃度。

奧迪亞無核葡萄；玫瑰香型葡萄；肧挽救；影響因素

玫瑰香葡萄作為我國栽培面積較大、栽培歷史悠久的一個鮮食和釀酒并用的品種，不僅適應性強，而且耐鹽堿、豐產(chǎn)[1-2]，是天津濱海地區(qū)的優(yōu)勢產(chǎn)品和名牌產(chǎn)品，也是環(huán)渤海灣地區(qū)的主栽品種。天津農(nóng)科院葡萄研究中心利用分子生物技術(shù)和田間選種相結(jié)合的方法從茶淀玫瑰香葡萄中篩選出的玫瑰香優(yōu)系，較普通玫瑰香品種香氣濃郁，果穗松緊度適中，果粒均勻，且優(yōu)良性狀能穩(wěn)定遺傳[3]。本研究以早熟、品質(zhì)優(yōu)、豐產(chǎn)性好的二倍體奧迪亞無核葡萄做母本，以香氣濃郁的二倍體玫瑰香葡萄優(yōu)系和四倍體巨玫瑰葡萄作父本雜交以及奧迪亞無核自交胚珠為材料進行胚挽救育種[4-5]。在前人研究基礎上進一步篩選、探索雜交組合中不同親本的取樣時間、發(fā)育培養(yǎng)基、萌發(fā)培養(yǎng)基、激素對無核葡萄胚挽救效果的研究[6-7]。旨在篩選適于以奧迪亞無核葡萄為母本的胚挽救技術(shù)，提高無核葡萄胚挽救育種效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年4月～2017年3月在天津市農(nóng)業(yè)科學院葡萄研究中心武清試驗基地、天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室進行；試材均取自天津市農(nóng)業(yè)科學院葡萄研究中心武清試驗基地葡萄園，分別為奧迪亞無核葡萄、玫瑰香葡萄、巨玫瑰葡萄。

雜交組合設計見表1。

1.2 方法

1.2.1 田間雜交

于2016年5月，花穗5%左右的小花開放，開始葡萄花粉的采集工作，放入裝有干燥劑（變色硅膠）的瓶中注明品種名稱，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。于花?～3 d進行人工去雄，去雄后第2天進行授粉，每天授粉2次，連授3 d。每次授粉后即刻套袋，標注授粉時間和雜交組合。每種組合雜交15穗。

表1 葡萄雜交組合設計

1.2.2 幼果采集

從6月中旬開始，雜交胚珠的取樣時間從最后一次的授粉時期開始計算。授粉之后30 d開始，進行幼果的采集工作，每7 d采取1次雜交幼果，每次300粒，共采摘3次。將采下的幼果帶回實驗室，剪去果柄，用自來水沖洗數(shù)次，之后放入流水中沖洗10 min左右。然后將幼果放置于超凈工作臺上進行消毒，消毒步驟：用75%酒精沖洗一次，然后用無菌水沖洗幼果3次，接著放入次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，再用無菌水沖洗幼果3次。

1.2.3 胚發(fā)育階段胚珠培養(yǎng)

將消毒滅菌后的果粒放在滅菌后的培養(yǎng)皿中，無菌條件下用解剖刀切開漿果，注意不要損傷胚珠。取出胚珠之后，將其接種在胚珠發(fā)育培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，根據(jù)試驗設計對其進行不同的處理。每個150 mL三角瓶內(nèi)接種胚珠15個左右。胚發(fā)育培養(yǎng)基分別為：ER/Nitsch+0.5 mg/L GA3+1.5 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA+60 g/L蔗糖+1 g/L活性炭+5 g/L瓊脂兩種培養(yǎng)基中。

1.2.4 胚萌發(fā)階段胚培養(yǎng)

在發(fā)育培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 d后，在無菌情況下將胚珠取出，本試驗主要采用剝胚處理方式：在解剖鏡下，利用解剖針將雜交胚珠縱切剝開，在胚珠的內(nèi)喙端取出幼胚，注意不要損傷幼胚，將其接種到不同的幼胚萌發(fā)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)促進萌發(fā)成苗。胚萌發(fā)培養(yǎng)基為添加0.1 mg/L IBA的1/2MS培養(yǎng)基或添加不同濃度6-BA的WPM培養(yǎng)基，其中添加30 g/L蔗糖、5 g/L瓊脂，培養(yǎng)基pH5.8。30 d后進行調(diào)查。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

胚珠培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計胚發(fā)育率，胚萌發(fā)培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計胚萌發(fā)率。

胚發(fā)育率/%=(發(fā)育胚數(shù)/接種胚珠數(shù))×100

胚萌發(fā)率/%=(萌發(fā)胚數(shù)/接種胚珠數(shù))×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同父本對幼胚生長發(fā)育的影響

將雜交組合奧迪亞無核×玫瑰香、奧迪亞無核×巨玫瑰的雜交胚珠接種ER培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，研究不同父本對胚發(fā)育的影響，如表2所示。

由表2可以看出，不同雜交組合的胚發(fā)育率有很大差異，其中雜交組合奧迪亞無核×玫瑰香的胚發(fā)育率和胚萌發(fā)率相對較高，為58.45%和56.25%，雜交組合奧迪亞無核×巨玫瑰的胚發(fā)育率和胚萌發(fā)率相對較低，為11.90%和10.63%。由此可見，以奧迪亞無核葡萄作母本時玫瑰香葡萄作為父本更易胚挽救成功。

2.2 不同雜交組合取樣時期對幼胚生長發(fā)育的影響

將雜交胚珠在授粉47 d后，每隔一周取樣一次，共3次取樣后進行接種，統(tǒng)計不同取樣時期的胚珠發(fā)育率與幼胚萌發(fā)率，結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，奧迪亞無核×玫瑰香、奧迪亞無核×巨玫瑰的雜交胚珠和奧迪亞無核自交胚珠均在授粉后54 d取種的胚發(fā)育率最高，分別為58.08%、22.81%和22.51%，說明奧迪亞無核為母本與巨玫瑰和玫瑰香雜交的胚珠在授粉后54 d取種進行胚挽救更為有效。

2.3 不同發(fā)育培養(yǎng)基對幼胚發(fā)育的影響

從表4中可以看出，經(jīng)過不同的發(fā)育培養(yǎng)基Nitsch和ER培養(yǎng)的雜交組合奧迪亞無核×玫瑰香、奧迪亞無核×巨玫瑰的胚發(fā)育率均不同。雜交組合奧迪亞無核×玫瑰香在發(fā)育培養(yǎng)基Nitsch中的胚發(fā)育率為20.45%，而在ER培養(yǎng)基中的胚發(fā)育率為10.71%，明顯低于在Nitsch培養(yǎng)基中的，所以適宜奧迪亞無核×玫瑰香發(fā)育的培養(yǎng)基為Nitsch培養(yǎng)基；雜交組合奧迪亞無核×巨玫瑰在發(fā)育培養(yǎng)基Nitsch中的胚發(fā)育率為16.66%，在ER培養(yǎng)基中的胚發(fā)育率為7.89%，明顯低于在Nitsch培養(yǎng)基中的，所以適宜奧迪亞無核×巨玫瑰發(fā)育的培養(yǎng)基為Nitsch培養(yǎng)基。這說明Nitsch培養(yǎng)基比ER培養(yǎng)基更適合2種雜交胚珠的發(fā)育。

2.4 不同萌發(fā)培養(yǎng)基對幼胚萌發(fā)的影響

由表5可以看出，奧迪亞無核×巨玫瑰的雜交胚接種在1/2MS和WPM不同的萌發(fā)培養(yǎng)基中萌發(fā)率都很高，差異不是很大，說明1/2MS和WPM均可作為奧迪亞無核×玫瑰香的萌發(fā)培養(yǎng)基。

2.5 不同濃度6-BA對胚萌發(fā)的影響

由表6可以看出，奧迪亞無核×巨玫瑰的雜交胚在不同濃度6-BA的WPM培養(yǎng)基中有不同的胚萌發(fā)率，當6-BA的濃度為0.1 mg/L時雜交組合奧迪亞無核×玫瑰香的胚萌發(fā)率最高，為100.00%。說明0.1 mg/L6-BA濃度是奧迪亞無核×巨玫瑰的雜交胚萌發(fā)的最佳濃度。增加6-BA濃度萌發(fā)率反而降低，說明高濃度的6-BA可能抑制奧迪亞無核×玫瑰香胚的萌發(fā)。

表2 不同親本基因型下幼胚的生長發(fā)育狀況

表3 取樣時期對離體胚珠培養(yǎng)生長發(fā)育的影響

表4 不同培養(yǎng)基對胚珠發(fā)育的影響

表5 不同萌發(fā)培養(yǎng)基對奧迪亞無核×巨玫瑰胚萌發(fā)的影響

表6 不同濃度6-BA對奧迪亞無核×玫瑰香胚萌發(fā)的影響

3 討論與結(jié)論

影響胚挽救成功的重要因子之一是接種時期，胚珠接種時間過早或過晚都會影響到胚的發(fā)育和成苗[8]；本試驗中選取的3個組合分別為：奧迪亞無核×玫瑰香、奧迪亞無核×巨玫瑰、奧迪亞無核自交胚珠均在授粉后54 d取種的胚發(fā)育率最高，分別為58.08%、22.81%和22.51%，說明奧迪亞無核為母本與巨玫瑰和玫瑰香雜交的胚珠在授粉后54 d取種進行胚挽救更為有效。無核葡萄胚珠培養(yǎng)成功與否，主要取決于母本基因型，母本品種胚的可挽救性是無核葡萄品種雜交能否成功的最關鍵因素[9-10]，父本的基因型對胚挽救的成功與否也有非常重要的關系。本試驗中的奧迪亞無核×玫瑰香和奧迪亞無核×巨玫瑰的試驗結(jié)果說明不同雜交組合的胚發(fā)育率有很大差異，其中雜交組合奧迪亞無核×玫瑰香的胚發(fā)育率和胚萌發(fā)率相對較高，為58.45%和56.25%，雜交組合奧迪亞無核×巨玫瑰的胚發(fā)育率和胚萌發(fā)率相對較低，為11.90%和10.63%。由此可見，以奧迪亞無核葡萄作母本時玫瑰香葡萄作為父本更易胚挽救成功。奧迪亞無核×玫瑰香的雜交是二倍體和二倍體的雜交組合，而奧迪亞無核×巨玫瑰的雜交是二倍體與四倍體的雜交組合，不同倍性葡萄雜交存在較為嚴重的雜交障礙，因此用二倍體×四倍體葡萄雜交的方法獲得后代比較困難[11-12]，這是以奧迪亞無核作母本時巨玫瑰作為父本比較不易胚挽救成功的主要原因。

胚珠離體培養(yǎng)需要培養(yǎng)基供給充足養(yǎng)分，胚發(fā)育和胚萌發(fā)營養(yǎng)需求不同，需分別探究其適宜的培養(yǎng)基[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，Nitsch培養(yǎng)基比ER培養(yǎng)基更適合奧迪亞無核×玫瑰香和奧迪亞無核×巨玫瑰2種雜交胚珠的發(fā)育。本試驗采用奧迪亞無核×巨玫瑰的雜交胚接種在1/2MS和WPM不同的萌發(fā)培養(yǎng)基中萌發(fā)率，發(fā)現(xiàn)差異不是很大，說明1/2MS和WPM均可作為奧迪亞無核×玫瑰香的萌發(fā)培養(yǎng)基。奧迪亞無核×巨玫瑰的雜交胚在不同濃度6-BA的WPM培養(yǎng)基中有不同的胚萌發(fā)率[13]。本研究得出1 mg/L 6-BA濃度是奧迪亞無核×巨玫瑰的雜交胚萌發(fā)的最佳濃度，高濃度的6-BA可能抑制奧迪亞無核×玫瑰香胚的萌發(fā)。

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Research on embryo rescue techniques of the reciprocal crosses between Otlia Seedless grape and the Muscat grape

YUE Ya1,2, ZHANG Na2, TIAN Shufen2*, WEN Xiaomin1,2
(1. College of Life Science, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China; 2. Tianjin Facility Agriculture Research Institute/Tianjin Enterprise Key Laboratory of Grape Genetics and Breeding, Tianjin 300192, China）

To gain the seedless grape variety with large berry and muscat flavor, the ovules from hybrids of Otilia×Muscat Hamburg, Otilia×Jumeigui and Otilia selfing as experimental materials were cultured in vitro.Factors including the parent's selection, genotypes, sampling dates, development medium types and development temperature were studied. The results were as follows: the cross combination of Otilia×Muscat Hamburg,percentages of embryo development and germination were higher than the combination of Otilia×Jumeigui. The optimal sampling dates was 54 days after bloom. The medium of Nitsch+1.5 mol/L IAA+0.5 mol/L 6-BA+0.5 mol/L GA3+60 g/L sucrose+5 g/L agar+1 g/L activated charcoal was suitable for embryo development of Otilia×Muscat Hamburg and Otilia×Jumeigui. 1/2 MS and WPM could be used as the medium for embryo germination of Otilia×Muscat Hamburg. 0.1 mg/L 6-BA was the optimum concentration for embryo development in Otilia×Jumeigui.

Otlia Seedless; Muscat Hamburg; embryo rescue; infection factor

S663.1；S603.6

A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.06.004

2017-10-23

天津市科技計劃項目（16ZXZYNC00160）；天津市農(nóng)業(yè)科學院院長基金（15010）

月丫（1992-），女，在讀碩士研究生

*通訊作者：田淑芬（1966-），女，博士，研究員，主要從事葡萄栽培與選育種方面的研究。E-mail: tianshufen@263.net