遠志總皂苷對癲癇模型大鼠學習記憶及海馬LTP的影響

景 瑋，馬 彪，李 艷，李新毅

遠志總皂苷對癲癇模型大鼠學習記憶及海馬LTP的影響

景 瑋1，馬 彪2，李 艷3，李新毅1

目的觀察遠志總皂苷(TEN)對戊四氮(PTZ)點燃癲癇模型大鼠空間學習記憶能力及海馬長時程增強(LTP)的影響。方法雄性Wister大鼠隨機分為對照組、癲癇模型組、TEN組，利用水迷宮法觀察各組大鼠的空間學習記憶能力，利用電生理學方法通過對高頻刺激前后海馬CA1區(qū)場興奮性突觸后電位(fEPSP)幅度比較檢測大鼠海馬LTP變化。結果與對照組相比較，癲癇模型組空間學習記憶能力顯著下降，海馬CA1區(qū)LTP受到顯著抑制(Plt;0.05)；TEN可改善上述指標的異常變化(Plt;0.05)。結論TEN可改善癲癇模型大鼠空間學習記憶能力及海馬LTP的抑制。

癲癇；學習記憶；遠志總皂苷；海馬；長時程增強

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，我國癲癇患病率高達0.7%[1]。有研究表明，癲癇病人常伴有學習記憶減退，注意力分散等認知功能障礙表現(xiàn)[2-3]。癲癇后認知功能損害的發(fā)病機制仍未闡明[4]，臨床缺乏有效防治手段。遠志是我國傳統(tǒng)的安神益智良藥，在提高學習記憶方面具有一定作用[5-6]，遠志總皂苷(tenuigenin，TEN)是其有效成分[7-10]。本研究利用Morris水迷宮法[11]觀察癲癇模型大鼠學習記憶能力，利用電生理方法記錄在體大鼠海馬長時程增強(long-term potentiation，LTP)[12]變化，同時觀察TEN對上述指標的影響，為臨床新藥研發(fā)提供新思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 成年清潔級雄性Wister大鼠，體重200 g～250 g，由北京海淀興旺動物養(yǎng)殖場提供。大鼠自由攝食飲水，自然光照，室溫25.5 ℃±2.0 ℃飼養(yǎng)。

1.1.2 藥品、試劑及實驗儀器 TEN在山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心提取，1 g TEN相當于生藥遠志25 g，4 ℃避光保存，實驗時以生理鹽水配置成溶液；PTZ購于Sigma公司，將其溶于生理鹽水配成1%溶液(10 mg/mL)后置于4 ℃環(huán)境保存；腦立體定位儀購于深圳瑞沃德公司，多道生理信號采集系統(tǒng)(6240C型)購于成都儀器廠，Morris水迷宮圖像采集分析系統(tǒng)購于荷蘭諾達思科技信息公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及造模 將32只雄性Wister大鼠隨機分為對照組(8只)、癲癇模型組(12只)、TEN組(12只)。癲癇模型組給予腹腔注射致驚厥劑量的戊四氮[Pentylenetetrazole，PTZ(40 mg/kg)]，注射時間為每日08：00～09：00，注射完觀察大鼠2 h，記錄發(fā)作次數(shù)和分級，每隔1日稱大鼠體重進行劑量調整，連續(xù)給藥28 d，停藥7 d；再以相同劑量點燃，以連續(xù)2次以上4級以上發(fā)作視為造模成功，驚厥發(fā)作以Racine法分級標準進行判斷。TEN組在腹腔注射PTZ同時灌服TEN溶液 (375 mg/kg)，給藥35 d，之后腹腔注射點燃。對照組則給予生理鹽水灌胃及腹腔注射。

1.2.2 Morris水迷宮實驗 造模成功后各組大鼠進行Morris水迷宮實驗。標準大鼠迷宮(直徑150 cm)分為均等的4個象限，入水點為4個象限貼壁的正中部位。迷宮上方給予參照物以供大鼠識別，將平臺放入第一象限的正中部位，將平臺放在水平面以下1 cm，水溫為23 ℃±2 ℃，實驗圖像由迷宮正上方攝像頭記錄，數(shù)據(jù)由攝像頭連接電腦記錄。實驗室要遮蔽太陽光，室內給予節(jié)能燈照明。實驗步驟：①定位航行實驗：此部分實驗持續(xù)5 d，每次將大鼠面向池壁分別從四個象限放入水中，由電腦系統(tǒng)記錄其找到平臺所需的時間，即逃避潛伏期。若大鼠可登上平臺，記錄時間并讓其停留10 s，以便強化記憶；若120 s內大鼠仍未登上平臺，則將其放至平臺10 s，實驗結束，記錄其逃避潛伏期為120 s；②空間探索實驗：第6天將原平臺撤離，讓大鼠在無平臺的情況在迷宮游泳120 s，記錄其跨越原平臺次數(shù)，此部分實驗進行2次。

1.2.3 電生理實驗 腹腔注射烏拉坦(1.5 g/kg)將大鼠麻醉，室溫保持在23 ℃～25 ℃。腦立體定位固定大鼠頭部，頭顱頂部備皮，做正中切口，從雙眼連線中心后側0.5 cm向后切開約2 cm，采用10%過氧化氫浸潤的棉球破壞清理筋膜，根據(jù)《大鼠顱腦定位圖譜》對大鼠海馬準確定位，并以前后囟點為參考點將大鼠頭部調整為同一水平線，按照坐標(刺激電極為X：-4.2 mm，Y：3.8 mm；記錄電極為X：-3.4 mm，Y：2.5 mm)定位后，將顱骨部位定位Z軸為0 mm。將同心圓雙極刺激電極和自制單極記錄電極捆綁以固定其相對位置垂直插入腦組織[13]，測試為正電流，設定刺激電流強度1.2 A，波寬0.2 ms，10 次/min持續(xù)刺激，調節(jié)腦立體定位儀使電極沿Z軸逐漸下降(以0.1 mm為單位)，出現(xiàn)場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential，fEPSP)波形時繼續(xù)緩慢下降(以0.01 mm為單位)，直至fEPSP波形不再增大，此時電極已到目標區(qū)域，即為刺激(schafer側支)和記錄部位(CA1區(qū)放射層)。選取的基礎電流為引起最大幅度fEPSP 50%時電流強度，波寬為0.2 ms，間隔6 s，記錄30 min以上確保突觸傳遞穩(wěn)定。誘發(fā)LTP的高頻刺激(HFS)為200 Hz，時程1 s，共3個串刺激，串間隔30 S ，HFS后fEPSP增長為基礎波150%以上視為誘導LTP成功；若成功則記錄1 h，并由多通道生理信號采集系統(tǒng)在電腦上儲存和分析。

2 結 果

2.1 癲癇模型結果 對照組8只大鼠均存活；模型組大鼠由于癲癇發(fā)作死亡3只，未達點燃標準1只，造模成功8只；遠志防治組大鼠癲癇發(fā)作死亡2只，未達點燃標準1只，造模成功9只。

2.2 Morris水迷宮結果 各組大鼠逃避潛伏期均呈現(xiàn)縮短趨勢，提示各組大鼠均具有空間學習記憶能力。模型組的逃避潛伏期較對照組，顯著延長(Plt;0.05)；TEN組的逃避潛伏期較模型組，顯著縮短(Plt;0.05)。詳見表1。

組別n第1天第2天第3天第4天第5天對照組871.89±14.23 31.50±18.78 28.36±11.85 15.43±5.61 11.33±5.53 模型組895.25±16.951)63.36±14.781)44.75±12.931)30.88±6.901)21.81±6.331)TEN組973.17±15.862)44.75±14.262)30.57±10.282)19.83±4.562)12.50±7.502) 與對照組比較,1)Plt;0.05;與模型組比較,2)Plt;0.05。

2.2 大鼠空間探索實驗結果比較 與對照組比較，模型組跨臺次數(shù)，顯著減少(Plt;0.05)；TEN組與模型組比較，跨臺次數(shù)顯著增多(Plt;0.05)。詳見表2。

組別n跨越原平臺次數(shù)對照組89.50±1.60 模型組84.13±1.251)TEN組98.25±1.492) 與對照組比較,1)Plt;0.05;與模型組比較,2)Plt;0.05。

2.3 電生理實驗結果 模型組高頻刺激后相同時間點的斜率分與對照組比較顯著降低(Plt;0.05)；TEN組高頻刺激后相同時間點的斜率與模型組比較顯著升高(Plt;0.05)。詳見表3。

組別n1min30min60min對照組8218.41±11.36 196.58±10.08 183.10±11.36 模型組8173.31±15.761)149.61±12.871)125.96±13.021)TEN組9190.98±10.162)174.19±12.142)152.61±8.912) 與對照組比較,1)Plt;0.05;與模型組比較,2)Plt;0.05。

3 討 論

癲癇與認知功能損害的關系引起醫(yī)學界廣泛關注，目前認為癲癇后認知功能損害主要與起病年齡[14]、癲癇發(fā)作次數(shù)、嚴重程度[15]、治療藥物[16-18]有關。迄今為止對癲癇后認知功能障礙的發(fā)病機制仍未完全闡明且無有效治療手段。中藥遠志是一味益智安神的良藥，在臨床上應用已有千年歷史。近年來有關遠志及其有效成分TEN對學習記憶作用的研究日益增多[5-10，19-20]，但遠志及TEN對癲癇后認知功能障礙方面的研究報道較少。

本實驗應用PTZ誘導癲癇動物模型對癲癇后認知障礙進行研究[21]，由于PTZ不損害腦組織結構，對大鼠記憶能力和運動功能無明顯影響，因此該癲癇模型常作為研究癲癇與認知功能障礙關系的理想模型。水迷宮結果顯示模型組與對照組比較，逃避潛伏期明顯延長，撤離平臺后，跨越原平臺次數(shù)明顯減少，表明癲癇模型組大鼠出現(xiàn)空間學習記憶能力減退，TEN組與模型組比較，逃避潛伏期縮短，撤離平臺后，跨越原平臺次數(shù)增多，說明TEN可改善癲癇模型大鼠空間學習記憶能力。

海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與學習記憶密切相關的腦區(qū)之一，LTP是一種由強直刺激作用興奮性突觸傳遞通路誘發(fā)的突觸傳遞效率長時間增強的現(xiàn)象。海馬LTP已廣泛認為是學習和記憶機制的細胞學模型之一[12]。本實驗正常組大鼠高頻刺激后fEPSP值即刻達到約218%，30 min時降到約196%，60 min時仍維持在約183%；癲癇模型大鼠高頻刺激誘發(fā)的fEPSP值約173%，60 min時約125%，明顯低于正常組；TEN組高頻刺激后fEPSP值即刻達到約190%，60 min末仍維持在約152%，明顯高于模型組，表明TEN可提高海馬突觸傳遞效能，改善癲癇后LTP的抑制。

綜上所述，TEN可改善癲癇模型大鼠空間學習記憶能力及海馬LTP抑制。既往研究表明，TEN改善癲癇后認知障礙的部分機制可能是通過提高癲癇模型大鼠海馬CA1區(qū)的N-甲基-D-d冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體表達[20]及CA1區(qū)煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor subunit alpha-7，nAChRɑ7)實現(xiàn)。因此，TEN可能通過刺激谷氨酸能及膽堿能信號通路參與學習記憶過程的形成，本研究為臨床新藥研發(fā)提供新思路和依據(jù)。

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2017-03-03)

(本文編輯 薛妮)

The Influence of Tenuigenin on the Ability of Spatial Learning Memory and Hippocampal Long-term Potentiation in Epilepsy Model Rats

Jing Wei，Ma Biao，Li Yan， Li Xinyi

Shanxi Dayi Hospital，Shanxi Academy of Medical Science，Taiyuan 030032， Shanxi China

Objective To observe the effects of Tenuigenin (TEN) on the ability of spatial learning and memory and long-term potentiation (LTP) in epilepsy model rats by intraperitoneal injection of Pentylenetetrazole (PTZ) solution. Methods Male wistar rats were randomly divided into control group，epilepsy model group，and tenuigenin group.Morris water maze test was performed to assess the ability of spatial learning and memory of animals. Additionally， electrophysiological technique was used to observe the changes in rat hippocampal LTP through the comparison of field excitatory postsynaptic potential (fEPSP) amplitudes in hippocampal CA1 region before and after high stimulation(HFS). Meanwhile， the regulation effect of TEN on above indices were studies.Results Compared with control group，the ability of spatial learning and memory as well as LTP were obviously decreased in epilepsy model group，however，TEN improved the abnormal changes of above indices.Conclusion TEN can improve the ability of learning and memory abilities and promote in vivo hippocampal LTP.

epilepsy；learning memory；Tenuigenin；hippocampus；long-term potentiation

R741 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.20.007

1672-1349(2017)20-2540-03

山西省青年科技研究基金(No.2013021036-1)

1.山西醫(yī)學科學院/山西大醫(yī)院(太原 030032) ，E-mail：jingweistar@163.com；2.山西省晉中市第一人民醫(yī)院；3.汾西礦務局集團職工總醫(yī)院

信息：景瑋，馬彪，李艷，等.遠志總皂苷對癲癇模型大鼠學習記憶及海馬LTP的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(20)：2540-2542.