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    降解聯(lián)苯菊酯微生物菌劑的制備及其穩(wěn)定性測(cè)定

    2017-11-22 17:06:55胡桂萍石旭平管幫富張國(guó)彪賀望興曹揮華龐博
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年19期

    胡桂萍 石旭平 管幫富 張國(guó)彪 賀望興 曹揮華 龐博

    摘要:為篩選適宜降解聯(lián)苯菊酯降解菌,采用正交試驗(yàn)對(duì)克雷伯氏菌LB-1固體發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行篩選,在篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上,對(duì)LB-1固體發(fā)酵條件、儲(chǔ)藏條件進(jìn)行優(yōu)化,并進(jìn)行菌劑穩(wěn)定性測(cè)定。結(jié)果表明,最佳載體配比為豆餅粉 ∶凹凸棒(90 ∶10)+10%麥麩+7%玉米粉+3%茶渣;菌劑LB-1制備的最佳接種量為15%,最適發(fā)酵溫度為 30 ℃,最適發(fā)酵時(shí)間為30 h,最適烘干時(shí)間為36 h,此時(shí)菌劑的有效活菌數(shù)和降解率均最高。同時(shí)菌劑在避光、溫度不高于25 ℃條件下90 d內(nèi)可以保持較高降解活性。聯(lián)苯菊酯微生物菌劑LB-1在優(yōu)化后固體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后降解性和穩(wěn)定性高,可為今后產(chǎn)品的商品化奠定基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:克雷伯氏菌;農(nóng)藥降解;聯(lián)苯菊酯;固體發(fā)酵

    中圖分類(lèi)號(hào): S481+.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2017)19-0257-04

    收稿日期:2016-04-29

    基金項(xiàng)目:國(guó)家科技支撐計(jì)劃(編號(hào):20151BBA13042);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(編號(hào):201303094-08)。

    通信作者:胡桂萍(1985—),女,福建龍巖人,博士研究生,助理研究員,研究方向?yàn)椴枞~副產(chǎn)物資源化開(kāi)發(fā)與利用和茶葉植保。E-mail:hugp__2007@163.com。 目前,以綠色、環(huán)保、有效為宗旨的農(nóng)業(yè)污染微生物修復(fù),在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展生產(chǎn)中起著越來(lái)越重要的作用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者,對(duì)于農(nóng)業(yè)環(huán)境中的污染物,如重金屬、農(nóng)藥殘留、稀土等開(kāi)展大量微生物修復(fù)研究,已獲得數(shù)百種具有降污效能的功能微生物,對(duì)其作用機(jī)制也已得到廣泛深入的研究和報(bào)道,但是對(duì)其規(guī)?;a(chǎn)的應(yīng)用技術(shù)相關(guān)報(bào)道較少,主要是由于缺乏成熟經(jīng)濟(jì)的發(fā)酵生產(chǎn)工藝。目前,微生物降污劑、農(nóng)殘降解劑、重金屬修復(fù)劑通常采用液體發(fā)酵報(bào)道居多,固體發(fā)酵報(bào)道較少。其中,液體發(fā)酵設(shè)備要求高、周期短、發(fā)酵產(chǎn)物活性強(qiáng),但成本較高、產(chǎn)品穩(wěn)定性較差、不易保存;而固體發(fā)酵雖產(chǎn)地需求大,發(fā)酵周期長(zhǎng),但其發(fā)酵材料來(lái)源豐富,可以以大量農(nóng)作物廢棄物作為優(yōu)良的固體培養(yǎng)基,具有生產(chǎn)成本低廉的特點(diǎn),發(fā)酵產(chǎn)品具有易保存及運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)[1],因此固體發(fā)酵是未來(lái)重要的生物修復(fù)劑等功能微生物產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)。一般而言,菌劑的穩(wěn)定性包括從制備到使用期間活菌數(shù)的變化速度和程度,這是評(píng)價(jià)菌劑質(zhì)量的重要參數(shù)[2],而對(duì)于降污劑菌制劑通常則以有效活菌數(shù)和降解效能為衡量發(fā)酵優(yōu)劣的核心指標(biāo)[3]。研究表明,在固體發(fā)酵過(guò)程中,除了溫度、含水量、pH值、傳質(zhì)等因素對(duì)發(fā)酵質(zhì)量關(guān)系密切[4-6],基質(zhì)特性也對(duì)微生物固體發(fā)酵的質(zhì)量和產(chǎn)量起關(guān)鍵作用[7]。微生物固體發(fā)酵的基質(zhì)組成結(jié)構(gòu),不僅關(guān)系微生物在發(fā)酵過(guò)程中供給的養(yǎng)分狀況,其顆粒大小等直接影響到微生物發(fā)酵過(guò)程中氧氣的供給速度和水分含量[8]。對(duì)功能微生物發(fā)酵成分和發(fā)酵條件的優(yōu)化不僅可以減少發(fā)酵成本,而且可提高發(fā)酵產(chǎn)物的數(shù)量和質(zhì)量,使得功能微生物的研究不局限于理論研究,加速其應(yīng)用推廣。

    微生物降解菌對(duì)環(huán)境中的污染物、有毒有害物質(zhì)均有很好的修復(fù)和改良作用,具有很好的應(yīng)用前景。但是,目前微生物降解菌主要局限于菌種生物特性和降解特性及機(jī)理方面,而在實(shí)踐中應(yīng)用的案例鮮見(jiàn)報(bào)道,缺少切實(shí)可行的發(fā)酵技術(shù)。因此,本研究根據(jù)前期研究結(jié)果獲得聯(lián)苯菊酯降解菌,克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)LB-1[9],從聯(lián)苯菊酯降解菌株實(shí)際應(yīng)用方面出發(fā),使用廉價(jià)農(nóng)產(chǎn)品原料和農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物,豆餅粉、麥麩、玉米粉并首次添加茶渣作為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行菌株固體型菌劑制備材料及保存條件進(jìn)行研究,從而為聯(lián)苯菊酯降解菌克雷伯氏菌LB-1產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論參考和技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 菌株

    菌株LB-1為克雷伯氏菌,保存于江西省蠶桑茶葉研究所微生物菌種庫(kù)。

    1.2 藥品和試劑

    聯(lián)苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)品:純度99.8%(由福建省農(nóng)業(yè)廳農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心提供),丙酮、石油醚、無(wú)水硫酸鈉。

    1.3 培養(yǎng)基

    LB培養(yǎng)基[10]:10.0 g蛋白胨;5.0 g酵母提取物;10.0 g NaCl,加水定容至1 L,pH值為7.0~7.2。配制相應(yīng)的固體培養(yǎng)基須加入1.5%瓊脂粉。

    基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽(MSM)培養(yǎng)基[11-12]:1.5 g Na2HPO4·12H2O,1.5 g KH2PO4,1.0 g NH4NO3,0.2 g MgSO4·7H2O,0.01 g CaCl2·2H2O,0.001 g FeSO4·7H2O,0.050 g酵母提取物,加蒸餾水定容至1 L,pH值7.0~7.2。

    1.4 不同混合載體的篩選

    將麥麩、鋸末、茶渣、玉米粉、豆餅粉按一定比例(質(zhì)量百分比)配成混合載體,121 ℃滅菌2 h,冷卻后按1 ∶1(體積比)接種LB-1種子液。25 ℃通風(fēng)發(fā)酵培養(yǎng)24 h,通風(fēng)烘干48 h,研成粉末,定時(shí)取樣測(cè)定。結(jié)果用有效菌數(shù)表示,確定最佳混合載體配方組成。

    1.5 載體組合優(yōu)化

    以凹凸棒土和豆餅粉混合物為載體基料,分別以麥麩、茶渣、玉米粉作為添料按照質(zhì)量比添加到基料中,混合后,121 ℃ 滅菌2 h,冷卻后按照體積比(1 ∶1)的量接種LB-1種子液。25 ℃通風(fēng)發(fā)酵培養(yǎng)36 h,后烘干30 h,研成粉末,定時(shí)取樣測(cè)定。通過(guò)4因素3水平進(jìn)行優(yōu)化載體最佳組合配比(表1),結(jié)果用有效活菌數(shù)和降解率共同表示。

    1.6 菌劑制備工藝條件優(yōu)化

    以?xún)?yōu)化后的載體組合進(jìn)行菌劑制備最佳工藝條件優(yōu)化,分別通過(guò)單因素試驗(yàn)分析接種量(10%、15%、20%、25%、30%)、發(fā)酵溫度(20、25、30、35、40 ℃)、發(fā)酵時(shí)間(18、24、30、36、42、48 h)、烘干時(shí)間(10、15、20、25、30 h)對(duì)菌劑有效活菌數(shù)和降解率的影響。endprint

    1.7 菌劑儲(chǔ)藏條件的優(yōu)化

    比較菌制劑分別在有光(透明玻璃瓶)、黑暗避光(避光棕色玻璃瓶)以及在不同儲(chǔ)藏溫度下放置30 d后的有效活菌數(shù)和降解率。

    1.8 菌劑穩(wěn)定性驗(yàn)證

    將制備好的菌劑分別在室溫25 ℃條件下保存,分別在處理后10、30、45、60、75、90、105、120 d取樣測(cè)定有效活菌數(shù)和降解率,檢測(cè)菌劑的穩(wěn)定性。

    1.9 有效活菌數(shù)檢測(cè)方法

    有效活菌數(shù)采用菌落計(jì)數(shù)方法,采用稀釋平板涂布法,每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù),培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基,25 ℃培養(yǎng)24 h,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

    1.10 降解率測(cè)定方法

    菌劑對(duì)聯(lián)苯菊酯降解率的測(cè)定參照胡桂萍等方法[13],挑取菌落計(jì)數(shù)后平板上的單菌落在LB培養(yǎng)基中活化24 h,然后用緩沖液清洗,制備菌懸液。然后按照10%的接種量,接入含有50 mg/mL的聯(lián)苯菊酯無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,150 r/min培養(yǎng)96 h后取30 mL添加農(nóng)藥的培養(yǎng)液,分別加入60 mL丙酮,采用超聲波提取法提?。?×15 min)。提取液經(jīng)鋪2層濾紙的布氏漏斗減壓抽濾,將濾液全部移入500 mL分液漏斗,加入60 mL石油醚,搖勻,振蕩30 min,靜置,分層,棄下層溶液,取石油醚層溶液,用20 g無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾至250 mL圓底燒瓶。分液漏斗和無(wú)水硫酸鈉用45 mL石油醚分3次洗滌,洗液并入燒瓶濾液中,50 ℃恒溫濃縮,將濃縮液全部轉(zhuǎn)入 10 mL 刻度試管,并用3 mL石油醚分3次洗滌圓底燒瓶,定容至5 mL,取2 mL經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜注射式過(guò)濾器過(guò)濾,濾液收集于試管中,以供GC檢測(cè)。

    氣相色譜條件:Agilent 6890N(μECD檢測(cè)器),毛細(xì)管柱HP-5,5% Phenyl methyl Siloxane,30.0 m×320 μm×0.25 μm。程序升溫:柱箱溫度初始80 ℃,保持1 min,運(yùn)行時(shí)間為1 min,第一階段以10 ℃/min升溫到140 ℃,保持 1.000 min,運(yùn)行時(shí)間為8.000 min,第二階段以20 ℃/min升溫到280 ℃,保持18.000 min,運(yùn)行時(shí)間為33.000 min。進(jìn)樣口溫度220 ℃,檢測(cè)器溫度330 ℃。載氣為高純氮?dú)?20.0 mL/min,不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣量為1 μL。在此條件下測(cè)得聯(lián)苯菊酯2個(gè)異構(gòu)體的保留時(shí)間分別為18.304 min。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=26 404x-22 012,確定系數(shù)為R2=0.995。其中x為聯(lián)苯菊酯濃度,y為峰面積。采用外標(biāo)法測(cè)定樣品中聯(lián)苯菊酯的含量,求出其降解率。

    聯(lián)苯菊酯降解率=[1-(實(shí)測(cè)殘量/對(duì)照實(shí)測(cè)殘量)]×100%。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同混合載體的篩選

    由表2可知,不同混合載體的篩選結(jié)果,茶渣和麥麩等6種載體按照排列組合組成A~F共6組混合載體,利用稀釋平板涂布相同條件下測(cè)定有效活菌數(shù),可見(jiàn)A組合有效活菌數(shù)最高,為42.65億CFU/g,所以采用A組合當(dāng)中的豆餅粉、麥麩、茶渣、玉米粉、凹凸棒作為混合載體的組成成分。

    2.2 載體配比對(duì)菌劑制備的影響

    試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)4因素3水平設(shè)計(jì),以L9(34)為正交試驗(yàn)方案,對(duì)選用的載體材料混合用量進(jìn)行了優(yōu)化,以1 ∶1(載體質(zhì)量 ∶菌體質(zhì)量)與發(fā)酵干料均勻混合制成小球狀,避光常溫(25 ℃)放置45 d后測(cè)定活菌生物量和存活率。以k值和R值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,k值大,表示在用一個(gè)因素中該水平對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響大,反則小之。R值大,說(shuō)明該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響大,反之小。結(jié)果(表3)表明,各因素的主次順序?yàn)槎癸灧?∶凹凸棒>麥麩接種量>玉米粉接種量>茶渣接種量,最佳配方為A3B2C3D3,即豆餅粉 ∶凹凸棒(90 ∶10)+10%麥麩+7%玉米粉+3%茶渣。

    2.3 菌劑最佳制備工藝條件

    單因素分析菌劑制備工藝條件得到,菌劑有效活菌數(shù)隨著接種量增加而上升,菌劑降解率在接種量為15%時(shí)為最高,而大于15%的接種量反而使降解率降低(圖1)。發(fā)酵溫度選擇在30 ℃時(shí)菌體在載體中生長(zhǎng)最旺盛,降解率也最高(圖2),溫度過(guò)高或者過(guò)低均會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)和降解率。發(fā)酵時(shí)間為30 h時(shí),即可聞到一種甜醋味,此時(shí)的活菌數(shù)最高,降解率也最高(圖3),表明此時(shí)菌體生長(zhǎng)已達(dá)到最大化,發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易導(dǎo)致菌體缺乏營(yíng)養(yǎng)供給而細(xì)胞死亡,發(fā)酵時(shí)間不足則會(huì)使載體的吸菌量不夠,從而導(dǎo)致降解率低。制備好的菌劑選擇烘干時(shí)間36 h后粉碎,得到的菌劑細(xì)度好,活菌數(shù)量最高,降解率最高(圖4),烘干時(shí)間過(guò)短,菌劑的含水量大,不易保存,而烘干時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)使菌體大量死亡,降解率變低。因此, 菌劑LB-1制備的最佳接種量為15%, 最適發(fā)酵溫度為30 ℃,最適發(fā)酵時(shí)間為30 h,最適烘干時(shí)間為36 h。

    2.4 菌劑儲(chǔ)藏條件優(yōu)化

    將制備好的菌劑分別在透明玻璃瓶和避光棕色玻璃瓶中保存,25 ℃ 放置10 d后取出測(cè)定菌劑的有效活菌數(shù)和降解率得到(圖5),透明玻璃瓶下(光照)菌劑的降解率和有效活菌數(shù)明顯低于避光棕色玻璃瓶中菌劑。另外,將制備好的菌劑儲(chǔ)藏在不同溫度下,避光放置30 d后進(jìn)行降解率和有效活菌數(shù)的測(cè)定(圖6),30 d后,儲(chǔ)藏溫度在0 ℃時(shí),有效活菌數(shù)和降解率為最高;而儲(chǔ)藏溫度為0~25 ℃時(shí),10 d后菌劑的有效活菌數(shù)高于88.00億CFU/g,降解率保持較高的活性,均高于70%;而當(dāng)儲(chǔ)藏溫度高于25 ℃時(shí),10 d后菌劑的有效活菌數(shù)和降解率明顯下降。上述試驗(yàn)表明,在避光且儲(chǔ)藏溫度不高于25 ℃條件下,菌劑均可以保持較高的有效活菌數(shù)和降解活性。

    2.5 菌劑穩(wěn)定性測(cè)定

    菌劑在黑暗、25 ℃下儲(chǔ)藏90 d,菌制劑均可以保持較高的有效活菌數(shù)和較高的降解率(圖7),有效活菌數(shù)均高于 70億CFU/g,降解率高于78%;當(dāng)存放時(shí)間為105 d時(shí),菌劑的有效活菌數(shù)開(kāi)始下降,降解率也隨著下降;當(dāng)存放時(shí)間為120 d時(shí),菌劑的有效活菌數(shù)低于60億CFU/g,降解率也更低,約60%。說(shuō)明該菌劑在儲(chǔ)藏時(shí)間不超過(guò)90 d時(shí),穩(wěn)定性好。endprint

    3 討論

    固體發(fā)酵技術(shù)是微生物實(shí)現(xiàn)環(huán)境降污和生物修復(fù)的重要工具,而發(fā)酵基質(zhì)是固體發(fā)酵效果影響的重要因素之一,因此選擇生產(chǎn)效率高、功能作用性強(qiáng)的基質(zhì)和載體是微生物固體發(fā)酵的重要前提[13-14]。良好的載體是保證菌株活力的有效措施,對(duì)陽(yáng)光具有吸收和分散作用,可以保護(hù)菌制劑免受紫外光線(xiàn)的照射;對(duì)水分的吸附,可以一定程度上緩沖干燥的環(huán)境條件,適宜載體可以?xún)?yōu)化并穩(wěn)定菌劑發(fā)揮效果的微生態(tài)環(huán)境。

    本研究通過(guò)對(duì)現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中常用的發(fā)酵基質(zhì)和吸附劑,豆餅粉[15-16]、凹凸棒[17-18]、麥麩[19]、玉米粉[20]以及添加茶樹(shù)副產(chǎn)物茶渣,采用正交試驗(yàn)優(yōu)化LB-1固體發(fā)酵基質(zhì)配方,其載體的最佳配比為 ∶豆餅粉 ∶凹凸棒(90 ∶10)+10%麥麩+7%玉米粉+3%茶渣。發(fā)酵基質(zhì)中添加茶渣,一方面是LB-1菌株來(lái)源于茶園環(huán)境中,而添加茶渣可以?xún)?yōu)化發(fā)酵基質(zhì)環(huán)境,使LB-1發(fā)酵環(huán)境與其原生境相仿,提高菌株的生長(zhǎng)量;另一方面茶渣含有纖維素,多糖,鈣、鉀、鎂常見(jiàn)元素,鐵、銅、錳、鋅、硒等微量元素,以及多種維生素和礦物元素,是一種良好的微生物基質(zhì),有助于發(fā)酵菌株的快速生長(zhǎng)。目前,農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物作為生物發(fā)酵基質(zhì)可以有助于資源綜合開(kāi)發(fā)利用。如羅洋等也利用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物橘皮與麥麩進(jìn)行里氏木霉FS10-C固體發(fā)酵[21]。本研究中發(fā)酵基質(zhì)以凹凸棒作為載體,不僅降低制作成本,制作工藝簡(jiǎn)單,而且極大提高了菌劑的存活率和儲(chǔ)藏期,為L(zhǎng)B-1固體菌劑的實(shí)用生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    除了發(fā)酵基質(zhì)種類(lèi)、基質(zhì)配比外,菌株接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、烘干時(shí)間等均直接影響到固體發(fā)酵產(chǎn)物的數(shù)量和質(zhì)量。本研究通過(guò)對(duì)固體發(fā)酵條件初步分析得到,菌劑 LB-1 制備的最佳接種量為15%,最適發(fā)酵溫度為30 ℃,最適發(fā)酵時(shí)間為30 h,最適烘干時(shí)間為36 h且分別在這些條件下菌劑的有效活菌數(shù)量和降解率均表現(xiàn)較高活性。同時(shí),對(duì)于儲(chǔ)藏方式進(jìn)行分析得到,制備好的菌制劑放置于避光條件,且溫度不高于25 ℃時(shí),可以保證菌制劑具有良好的活性。另外,對(duì)菌制劑的穩(wěn)定性進(jìn)行分析,得到菌制劑在90 d內(nèi)菌劑的質(zhì)量較好,90 d后菌制劑的有效活菌數(shù)和降解率均明顯降低,但這與當(dāng)前微生物肥料或者農(nóng)藥大于6個(gè)月有效期還有差距[8]。這可能與菌制劑的含水量、載體種類(lèi)和含量均有關(guān)系,因此,如何通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化制備工藝和調(diào)整發(fā)酵基質(zhì)配方來(lái)提高菌制劑產(chǎn)品的質(zhì)量和保質(zhì)期是下一步研究重點(diǎn)。

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