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    生物農(nóng)藥茶多酚微乳劑的制備及其對(duì)稻瘟病菌的抑制效果

    2017-11-22 17:09:55徐婧沈曉蘭周捷李東芳邱業(yè)先
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年19期
    關(guān)鍵詞:生物農(nóng)藥茶多酚

    徐婧 沈曉蘭 周捷 李東芳 邱業(yè)先

    摘要:為制備高效、穩(wěn)定的茶多酚微乳劑,延長(zhǎng)茶多酚的作用時(shí)間,使茶多酚在抑制植物病原真菌[稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)]方面發(fā)揮更好的作用。通過篩選助溶劑和乳化劑確定茶多酚微乳劑配方,研究水質(zhì)、儲(chǔ)存條件及酸堿度等因素對(duì)微乳劑穩(wěn)定性的影響;選擇平板速率法,研究茶多酚微乳劑對(duì)稻瘟病菌的抑制效果。結(jié)果表明,根據(jù)擬三元相圖分析,丙酮和PEG800作為茶多酚的助溶劑和乳化劑時(shí),微乳劑最穩(wěn)定且效果最好;不同劑型茶多酚對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用,茶多酚微乳劑>茶多酚丙酮溶劑>茶多酚水溶劑;其中茶多酚微乳劑的抑制效果最好,它對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)81%。表明選擇合適的乳化劑、溶劑種類和用量十分重要,茶多酚微乳劑對(duì)稻瘟病菌有較好的抑制作用。研究結(jié)果為植物源性農(nóng)藥微乳劑的研制提供了參考。

    關(guān)鍵詞:生物農(nóng)藥;茶多酚;微乳劑;稻瘟病菌;抑菌效果

    中圖分類號(hào): S435.111.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2017)19-0191-05

    收稿日期:2016-05-06

    基金項(xiàng)目:江蘇省蘇州市科技局科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(編號(hào):SNG201353)。

    作者簡(jiǎn)介:徐 婧(1992—),女,江蘇揚(yáng)州人,碩士研究生,主要從事生物催化轉(zhuǎn)化工程研究。E-mail:843173685@qq.com。

    通信作者:邱業(yè)先,博士,教授,主要從事蛋白質(zhì)、土壤微生物、土壤酶學(xué)及植物資源利用研究。E-mail:qyx542@163.com。 我國(guó)是世界上水稻生產(chǎn)量及需求量最多的國(guó)家之一,約占糧食作物總量的27%和38%,是我國(guó)三大糧食作物之一[1-2]。然而水稻和其他農(nóng)作物一樣,被許多病原微生物包圍,受到各種病害的干擾。世界公認(rèn)的水稻三大病害有稻瘟病(Magnaporthe grisea)、紋枯病(Rhizoctonia solani)和白葉枯?。╔anthomonas oryzae pv. oryzae)[3-4]。其中,稻瘟病是傳播最廣、危害最大的世界性病害之一,主要危害寄主植物的地上部分,是由子囊菌[Magnaprthegrisea(Hebert)Barr]引起的真菌性病害[5]。

    為了有效地進(jìn)行稻瘟病的綜合防治,保障水稻的產(chǎn)量與質(zhì)量,化學(xué)藥劑長(zhǎng)期以來都是防治稻瘟病的重要手段之一。但化學(xué)農(nóng)藥的弊端也逐漸嚴(yán)重——不僅造成環(huán)境污染、生態(tài)平衡的破壞,而且會(huì)損害人體健康。因此,用生物農(nóng)藥防治稻瘟病逐漸成為主流。生物農(nóng)藥是利用生物活體或其代謝產(chǎn)物針對(duì)農(nóng)業(yè)有害生物進(jìn)行殺滅或抑制的制劑。生物農(nóng)藥主要分為3類:動(dòng)物源農(nóng)藥、微生物源農(nóng)藥及植物源農(nóng)藥。其中,植物源農(nóng)藥因在自然環(huán)境中易降解、無公害的優(yōu)勢(shì),現(xiàn)已成為綠色生物農(nóng)藥首選之一。羅亞楠等發(fā)現(xiàn),復(fù)方白毛藤提取液對(duì)溫室盆栽水稻稻瘟病菌有較好的防治作用[6]。Hemingway等研究表明,印度楝樹種子的冷水提取物和油浸提取物對(duì)稻瘟病菌的生防效果很好[7]。邱業(yè)先等發(fā)現(xiàn),不同濃度的茶多酚對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)具有很強(qiáng)的抑制作用,其中500、10.00 mg/mL抑制效果最好,抑制率高達(dá)100%[8-10]。

    茶多酚提取工藝簡(jiǎn)單,生產(chǎn)成本低,且對(duì)人體、環(huán)境無副作用。其抑制微生物的作用機(jī)制由多種因素共同作用,最重要的特性是絡(luò)合蛋白質(zhì)[11]。已有大量研究表明,茶多酚對(duì)病原細(xì)菌尤其對(duì)醫(yī)學(xué)和食品致病細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用。而茶多酚對(duì)病原真菌的抑制作用主要集中于皮膚真菌、生殖系統(tǒng)真菌,對(duì)植物真菌的抑制作用報(bào)道還較少,因此將茶多酚作為一種綠色植物源病原菌防治藥物,有極大的開發(fā)潛力。但不同結(jié)構(gòu)的茶多酚溶解度不同,對(duì)真菌的抑制效果會(huì)存在較大的差異。大部分茶多酚屬于類黃酮化合物及其衍生物,一般黃酮苷元難溶或不溶于水,卻易溶于甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙醚等有機(jī)溶劑或稀堿液中[12]。因此,可選用水乳劑、微乳劑、水分散性粒劑等水基化新劑型研制茶多酚微乳劑(micro-emulsion,簡(jiǎn)稱ME)[13]。

    微乳劑又稱水性乳油,是用水代替有機(jī)溶劑作分散介質(zhì),由水—表面活性劑—農(nóng)藥原油配制成的一種在熱力學(xué)上穩(wěn)定的、膨脹的、大的膠柬分散體系。借助表面活性劑的作用,將液態(tài)或固態(tài)農(nóng)藥均勻分散在水中形成透明或半透明的農(nóng)藥微乳劑。與傳統(tǒng)劑型——乳油相比,微乳劑基本不用或較少使用有機(jī)溶劑,從而降低了制劑對(duì)人和環(huán)境的污染。微乳劑劑型相對(duì)其他劑型有穩(wěn)定性好、藥效高、使用安全、高傳遞效率以及環(huán)境相容性好等特點(diǎn)。并且,農(nóng)藥微乳劑的開發(fā)歷史較短,產(chǎn)品配方、加工工藝及技術(shù)指標(biāo)等方面都有待深入研究和完善[13-14]。

    茶多酚微乳劑在國(guó)內(nèi)的科學(xué)研究工作才剛起步,因此本試驗(yàn)選用茶多酚為研究對(duì)象,助溶劑、微乳劑作為研制劑型,篩選并研制茶多酚微乳劑的最佳助溶劑。運(yùn)用選擇平板速率法試驗(yàn)來確定茶多酚微乳劑對(duì)稻瘟病菌的抑制效果,為植物源性農(nóng)藥微乳劑的研制提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    98%茶多酚粉末;稻瘟病菌;水稻種為圣稻16號(hào);溶劑有甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸甲酯(均為分析純);乳化劑有吐溫-80、吐溫-20、司盤-20、司盤-60、農(nóng)乳 600#、PEG800。

    1.2 方法

    1.2.1 微乳劑組分篩選 (1)助溶劑的初選:取10個(gè)錐形瓶,向每瓶中加入0.5 g茶多酚粉劑,再分別加入10 mL待篩選助溶劑,振蕩均勻后,觀察溶解情況,選出能澄清且透明的溶劑。再各稱取0.5 g茶多酚粉劑,分別溶于10 mL篩選出的溶劑中,溶解混勻,然后依次添加0.1 g茶多酚粉劑,每次同量,直至不能再溶解,得出每10 mL助溶劑最多能溶解的茶多酚質(zhì)量,選擇用量少、溶解完全的溶劑進(jìn)入復(fù)選。(2)乳化劑的初選:按照GB/T 1603—1979《農(nóng)藥乳化劑穩(wěn)定性測(cè)定方法》的要求,對(duì)乳化劑單劑種類進(jìn)行選擇。稱取2.0 g茶多酚粉劑,溶解于20 mL助溶劑中,并按1.5 g/份,再稱取35 g各類乳化劑單體分別加入溶液中,混合均勻,然后在攪拌的情況下加入蒸餾水,定容至10 mL,在室溫下觀察是否能形成透明、穩(wěn)定、均一的體系,能形成的乳化劑進(jìn)入復(fù)選[10]。(3)復(fù)篩(擬三元相圖的繪制):稱取茶多酚5.0 g溶于50 mL有機(jī)溶劑中制成母液,作為100%油相,標(biāo)記為O相;各類乳化劑單劑作為表面活性劑相,標(biāo)記為S相,然后按照體積比 9 ∶1、8 ∶2、7 ∶3、6 ∶4、5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7、2 ∶8、1 ∶9把母液和乳化劑配成均相,在錐形瓶中混勻靜置,用去超純水滴定至 50.00 mL (水相,標(biāo)記為W相),并記錄滴定過程中及終點(diǎn)處的現(xiàn)象。運(yùn)用Origin 8.0軟件繪制出溶劑—乳化劑—水的擬三元相圖,通過對(duì)擬三元相圖的微乳區(qū)大小進(jìn)行分析比較,篩選出其中微乳區(qū)范圍比較廣的試劑組合。endprint

    1.2.2 茶多酚微乳劑的制備工藝 采用轉(zhuǎn)相法制備微乳劑,將茶多酚溶于有機(jī)溶劑中作為油相,乳化劑加入油相中。攪拌成透明溶液,然后將水慢慢滴入油相中,邊滴加邊攪拌,剛開始時(shí)形成的是W/O型微乳劑,隨著水量的增加,發(fā)生轉(zhuǎn)相,最終形成O/W型微乳劑。

    1.2.3 茶多酚微乳劑穩(wěn)定性的研究 (1)冷儲(chǔ)、熱儲(chǔ)及常溫儲(chǔ)存對(duì)穩(wěn)定性的影響:取12份等體積的茶多酚微乳劑在 100 mL 錐形瓶中,平均分為4組。其中第1組放置在(54±2)℃的培養(yǎng)箱中15 d,并進(jìn)行外觀觀察;記外觀保持均勻透明為合格,如果分層,要在室溫振蕩下恢復(fù)原狀,否則視為不合格。第2組放在冰箱中(0±1) ℃冷儲(chǔ),保持15 d,并記錄其外觀;觀察有無沉淀,振蕩后有無可見的粒子或油狀物,沒有沉淀和分層現(xiàn)象,或者有沉淀、渾濁現(xiàn)象,但在室溫下漸漸消失,恢復(fù)透明狀態(tài)的視為合格。第3組放在冰箱中-5 ℃冷儲(chǔ),保持15 d,并記錄其外觀結(jié)果。第4組放在室溫下儲(chǔ)存,保持15 d,并分別記錄其外觀結(jié)果。(2)水質(zhì)對(duì)微乳劑穩(wěn)定性的影響:選出最佳配方,分別用蒸餾水、去離子水、自來水和硬水,以合適的配比來制備該配方的微乳劑,并與超純水比較,觀察剛配制完,靜置一段時(shí)間后微乳劑的外觀,記錄結(jié)果。(3)酸堿度對(duì)微乳劑穩(wěn)定性的影響:將配好的微乳劑分為等體積的2份,一份用HCl溶液一邊慢慢調(diào)成酸性,一邊觀察其變化;另一份用配好的NaOH溶液一邊慢慢調(diào)成堿性,一邊觀察其變化。

    1.2.4 茶多酚微乳劑抑制稻瘟病菌效果研究 配制等濃度的茶多酚水溶液、茶多酚丙酮溶劑、茶多酚微乳劑3種溶液,并以無菌水(CK)為對(duì)照,共4個(gè)處理,每個(gè)處理作4個(gè)平板。先在滅菌的培養(yǎng)皿中加入配好的1.00 mL各個(gè)溶液,對(duì)照組加1.00 mL無菌水,用滅了菌的打孔裝置在稻瘟病菌菌落邊緣生長(zhǎng)旺盛的部位打取菌圓片,用無菌鑷子輕挑放入凝固的培養(yǎng)基中央,且將有菌一面貼著培養(yǎng)基,每種溶液作3個(gè)處理,置于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d,每24 h觀察1次,測(cè)量菌落直徑,觀察菌落形態(tài)、生長(zhǎng)狀況并拍照[11]。

    抑菌率=對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑對(duì)照菌落直徑×100%。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 微乳劑組分的篩選

    2.1.1 助溶劑的初選 根據(jù)茶多酚的理化性質(zhì),從中選擇甲醇、乙醇、丙三醇、異戊醇、正丁醇、乙酸甲酯、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮9種有機(jī)溶劑進(jìn)行助溶劑的初選,篩選結(jié)果見表1。

    2.1.2 乳化劑的初選 乳化劑是制備微乳劑的重要條件,選擇不對(duì),就不能制成穩(wěn)定的微乳劑。選擇溶解度最高的丙酮為助溶劑,溶解茶多酚,作為原液。原液1.5 g,乳化劑3.5 g,然后加水定容至10 mL。配制一系列配方樣品,選擇可以形成均一透明的微乳劑體系,確定乳化劑單體,結(jié)果見表3。

    2.1.3 微乳劑最優(yōu)助溶劑與乳化劑的復(fù)篩 采用轉(zhuǎn)相法制備微乳劑。針對(duì)初選出的助溶劑甲醇、乙醇和丙酮,先確定單一的乳化劑進(jìn)行試驗(yàn),進(jìn)而挑選出最理想的助溶劑。繪制出母液-乳化劑-去離子水的擬三元相圖,通過對(duì)擬三元相圖微乳區(qū)域的分析比較,篩選出其中微乳區(qū)范圍比較廣的試劑組合。上述3種助溶劑的擬三元相圖如圖2至圖4所示。

    通過比較擬三元相圖的微乳區(qū)面積,可以看出復(fù)配液丙酮-吐溫20-水的微乳范圍(即共溶區(qū))最大,所以選擇丙酮為最佳助溶劑。

    選擇丙酮為助溶劑與上一步試驗(yàn)初選的乳化劑復(fù)配,利用相同的方法,挑選出最理想的乳化劑。作擬三元相圖見圖5至圖7。

    通過比較擬三元相圖的微乳區(qū)面積,可以看出復(fù)配液丙酮-PEG800-水的微乳范圍最大,所以選擇PEG800為最佳乳化劑,復(fù)配液丙酮-PEG800-水為最佳微乳劑體系。

    2.2 微乳劑穩(wěn)定性的研究

    根據(jù)丙酮和PEG800的擬三元相圖,選取茶多酚含量較高的邊界比例7 ∶3來配制微乳劑,取1 g茶多酚粉劑溶于10 mL 丙酮中,稱取7 g茶多酚丙酮溶液與3 g PEG800混合均勻,制成茶多酚微乳劑。

    2.2.1 冷儲(chǔ)、熱儲(chǔ)及常溫儲(chǔ)存對(duì)穩(wěn)定性的影響 分別取等體積的微乳劑于不同溫度下放置,并分別在0、3、6、9、12、15 d時(shí)記錄其外觀。冷凍起來的一組于室溫下化開再觀察,結(jié)果見表4。

    在可能儲(chǔ)藏的溫度范圍內(nèi),冷儲(chǔ)或熱儲(chǔ)對(duì)茶多酚微乳劑基本無影響。熱儲(chǔ)期間,溶液澄清透明,符合要求,但是隨著時(shí)間的推移,微乳劑中的水分蒸發(fā)附著在試管壁上或散失,導(dǎo)致微乳劑變得黏稠。冷儲(chǔ)和常溫下的結(jié)果一致,微乳劑仍然保持澄清透明,說明茶多酚微乳劑能適應(yīng)的環(huán)境溫度變化范圍較寬,能滿足相關(guān)要求。

    2.2.2 水質(zhì)對(duì)微乳劑穩(wěn)定性的影響 用蒸餾水、去離子水、硬水、自來水分別配制微乳劑,超純水作為對(duì)照,觀察并記錄水質(zhì)對(duì)微乳劑外觀的影響,結(jié)果見表5。初始外觀與靜置1 h后現(xiàn)象相同,所有溶液都形成穩(wěn)定均一的微乳劑體系,水質(zhì)對(duì)所配制的微乳劑的影響不大,說明該微乳劑復(fù)配體系對(duì)水質(zhì)的適應(yīng)能力很強(qiáng),自來水即可滿足要求。

    2.2.3 酸堿度對(duì)穩(wěn)定性的影響 按照前面的方法配好微乳劑,調(diào)節(jié)pH值,結(jié)果見表6。茶多酚微乳劑在調(diào)pH值至875時(shí)微乳劑顏色變深,但仍保持澄清,一直調(diào)至12.0時(shí)顏色已深到肉眼無法分辨溶液是否澄清。一般酸性水稻土或堿性水稻土在被水淹后,田中pH值偏中性,范圍在4.6~8.0之間,這個(gè)區(qū)間pH值對(duì)微乳劑的影響不大。

    2.3 茶多酚微乳劑抑制稻瘟病菌的效果

    結(jié)果如圖8所示,10.00 mg/mL的茶多酚水溶液、茶多酚丙酮溶液、茶多酚微乳劑與無菌水(CK)處理的稻瘟病菌菌落直徑不同,其中無菌水(CK)的菌落直徑最大,在7 d時(shí)達(dá)到8.641 cm,茶多酚微乳劑處理的菌落直徑最小,為1.640 cm,抑菌率為81% ;其次是茶多酚丙酮溶液和茶多酚水溶液處理的菌落,直徑分別為2.781、3.469 cm,抑菌率分別為68%、60%。由圖8可知,4個(gè)處理差異明顯,其中,茶多酚微乳劑抑菌效果>茶多酚丙酮溶液>茶多酚水溶液。endprint

    觀察并記錄7 d來各組處理的稻瘟病菌菌落直徑,結(jié)果見表7。不同劑型的茶多酚對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用。其中,茶多酚微乳劑的抑制效果最好,其菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)81%;茶多酚丙酮溶劑對(duì)稻瘟病病菌抑制作用其次,茶多酚水溶劑對(duì)稻瘟病病菌抑制效果最差,可能是因?yàn)椴瓒喾尤苡谒箅y以長(zhǎng)期維持本身化學(xué)性質(zhì),而微乳劑的形式卻可以增強(qiáng)茶多酚的抑菌效果。

    3 結(jié)論與討論

    對(duì)助溶劑、乳化劑等復(fù)配并結(jié)合擬三元相圖的研究篩選出茶多酚微乳劑的研制配方,其中,丙酮—PEG800—水體系最好。對(duì)茶多酚微乳劑體系進(jìn)行穩(wěn)定性(水質(zhì)、酸堿度、溫度)的研究,結(jié)果顯示該體系穩(wěn)定性良好。蒸餾水、去離子水、硬水、自來水對(duì)其影響較小,從節(jié)約成本來看,自來水即可滿足要求。(54±2)℃條件下,微乳劑會(huì)隨著時(shí)間的推移出現(xiàn)黏稠現(xiàn)象,在(-5~53) ℃條件下,微乳劑均可穩(wěn)定存在,具有較寬的溫度范圍。偏堿性時(shí),微乳劑的顏色開始變深,在低pH值條件下,茶多酚微乳劑均穩(wěn)定。將茶多酚微乳劑對(duì)稻瘟病菌進(jìn)行防治試驗(yàn),結(jié)果顯示茶多酚微乳劑的抑菌率達(dá)81%,遠(yuǎn)高于茶多酚丙酮溶液的68%及茶多酚水溶液的60%,說明茶多酚微乳劑具有良好的防治效果。

    目前,微乳劑或茶多酚的研究已經(jīng)逐漸成熟,但茶多酚做成微乳劑目前還在試驗(yàn)中(即還處于空白階段)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甲醇、乙醇、正丁醇和丙酮作為助溶劑,茶多酚均能完全溶解。魯靜等研究者在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),乙醇、丙酮均能將牛心樸子與苦豆子全部溶解,由此可見,乙醇與丙酮助溶效果極佳[15]。微乳劑的制備工藝有乳化油法、乳化水法、轉(zhuǎn)相法等,在試驗(yàn)過程中,乳化油法、乳化水法在最初的過程中,不利于茶多酚的溶解,因而選擇轉(zhuǎn)相法。儲(chǔ)西平等研究者在制作微乳劑的過程中均采用轉(zhuǎn)相法[16-17]。在微乳劑穩(wěn)定性的研究試驗(yàn)中,水質(zhì)、酸堿度、溫度對(duì)其影響均不大,且適應(yīng)范圍較

    廣。這與魯靜等研究者的研究結(jié)果[15]一致,說明丙酮-PEG800-水這個(gè)體系制成的茶多酚微乳劑具有良好的穩(wěn)定性。

    本試驗(yàn)運(yùn)用的乳化劑種類相對(duì)較少,或許在未用的乳化劑中,存在更利于茶多酚溶解的乳化劑,這還需要進(jìn)一步的研究;且茶多酚微乳劑運(yùn)用到田間試驗(yàn)中,能否達(dá)到預(yù)期的效果,也需作進(jìn)一步的探究。

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