無患子、木荷、廣玉蘭提取物組方復(fù)配及其抗稻瘟病體內(nèi)、體外活性研究

楊小輝　彭玉萌　霍光華　李芳　龍昊知

摘要：為了開發(fā)植物源抗稻瘟病制劑，借鑒Wadley法評(píng)價(jià)植物源農(nóng)藥復(fù)配聯(lián)合作用的思路，將參與組方的單劑引起25%抑菌率的劑量定為中間水平，應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)3種植物醇提物抗稻瘟病病菌活性組方的優(yōu)化配比。對(duì)水稻秧苗進(jìn)行抗稻瘟病體內(nèi)、體外活性試驗(yàn)，確定了具有增效作用的3種組方，即組方Ⅰ為無患子與廣玉蘭醇提物濃度的比值為1 ∶5，組方Ⅱ?yàn)闊o患子與木荷醇提物濃度的比值為1.0 ∶2.8，組方Ⅲ為無患子、廣玉蘭、木荷醇提物濃度的比值為4.3 ∶19.0 ∶1.0，體外測得各組方的EC50分別為193.1、132.5、256.1 mg/L，體內(nèi)盆栽測得各組方的EC50分別為25 637、7 267、7 560 mg/L。無論是易感稻種還是抗性稻種，當(dāng)組方Ⅱ和組方Ⅲ的濃度達(dá)到4%時(shí)，對(duì)稻瘟病的預(yù)防和治療作用均接近完全控制，效果均優(yōu)于生產(chǎn)上使用的三環(huán)唑。表明無患子、木荷、廣玉蘭等植物有潛在開發(fā)抗稻瘟病制劑的價(jià)值。

關(guān)鍵詞：無患子；木荷；廣玉蘭；提取物；均勻設(shè)計(jì)；抗稻瘟病組方

中圖分類號(hào)： S482.2+92 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）19-0179-04

收稿日期：2016-10-08

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：21266010）；江西省自然科學(xué)基金（編號(hào)：20142BAB214023、20132BAB204028）。

作者簡介：楊小輝（1990—），男，江西南昌人，碩士研究生，主要從事植物與菌物活性產(chǎn)物研究。E-mail：835017787@qq.com。

通信作者：霍光華，博士，教授，主要從事植物與菌物活性產(chǎn)物研究。E-mail：hgh3828079@sohu.com。 水稻是世界主要的糧食作物之一，稻瘟病是由稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）引起的水稻災(zāi)難性的病害，該病潛伏期長，發(fā)病部位多，危害嚴(yán)重。為了防治稻瘟病，人類把主要精力集中在選育水稻抗性品種和開發(fā)殺瘟劑上，但抗性品種并不能獲得對(duì)高度變異的稻瘟病菌的持續(xù)抗性，同時(shí)攜帶抗稻瘟病基因的水稻還存在所產(chǎn)稻米品質(zhì)低下等問題，因此，化學(xué)防治成為水稻生產(chǎn)上防治稻瘟病的一種不可缺少的手段。目前，大面積用于防治稻瘟病的化學(xué)殺菌劑三環(huán)唑等存在環(huán)境殘留問題，已發(fā)現(xiàn)對(duì)富士一號(hào)具有抗藥性的稻瘟病菌變異株，人們期望獲得結(jié)構(gòu)新穎、作用方式獨(dú)特的天然活性產(chǎn)物，從而開發(fā)出可以扼制稻瘟病菌高度變異的殺稻瘟劑[1-2]。

無患子（Sapindus mukorossi Gaertn.）主要分布于我國南部、印度、日本和朝鮮半島，該植物具有廣泛的藥用價(jià)值，其果實(shí)可治療過度流涎、丘疹、癲癇、萎黃病、偏頭痛、濕疹、牛皮癬等病，其種子粉可治療齲齒、關(guān)節(jié)炎、普通感冒、便秘、作嘔等病，其種子可以去除皮膚黃褐色和雀斑、清洗皮膚油性分泌物、制洗發(fā)劑等，葉片用于浴池可減緩關(guān)節(jié)痛、根治痛風(fēng)、風(fēng)濕病等[3]。主要活性成分是其所含的皂苷物質(zhì)，已發(fā)現(xiàn)無患子總皂苷提取物具有抑制光滑念珠菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌[4]、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌和幽門螺旋桿菌等細(xì)菌的活性，且幽門螺旋桿菌等菌不會(huì)對(duì)該提取物產(chǎn)生抗性[5]，該提取物還可以抑制黑曲霉菌[6]、苜蓿炭腐病病菌[Rhizoctonia bataticola （Taub.）Butl.]和黃連白絹病病菌（Sclerotium rolfsii）[7]等的活性。

木荷（Schima superba Gardn. et Champ.）是我國中部到南部常綠闊葉林、常綠闊葉-落葉混交林的優(yōu)勢樹種或群落上層的共建樹種。它具有優(yōu)良的防火特性，有時(shí)也用作藥物。福建省山區(qū)農(nóng)民使用木荷樹皮粉驅(qū)散野豬和鳥類等以防其糟踏農(nóng)作物[8]；臺(tái)灣排灣族人曾用木荷樹皮毒殺魚，其毒性比魚藤更劇烈，也有人將木荷莖皮作為箭毒使用[9]。近年來發(fā)現(xiàn)，木荷莖皮甲醇提取物可浸殺福壽螺幼螺，并能抑制其上爬[10]；木荷樹皮甲醇提取物能引起小菜蛾和菜青蟲拒食[11]；用木荷與油茶等60余種植物材料提取物可組成殺蟲劑[12]。

本試驗(yàn)從百余種植物中篩選出對(duì)稻瘟病病菌具有較強(qiáng)抑制活性的植物材料無患子和木荷等，經(jīng)組方配比和體內(nèi)、體外活性試驗(yàn)，篩選出具有防治稻瘟病和增效的活性組方。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物醇提物 試驗(yàn)材料為前期研究中篩選出的植物材料無患子果皮、廣玉蘭（Magnolia grandiflora Linn. ）葉、木荷葉，用乙醇溶液提取制得各醇提液，然后將各醇提液真空濃縮至浸膏狀備用[13-14]。

1.1.2 供試菌株和稻種 供試菌株為稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）菌株Z72-1，水稻品種為C101PKT（1種易感印度品種）和兩優(yōu)287（抗性品種），均由江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.1.3 供試農(nóng)藥 75%三環(huán)唑可濕性粉劑，購自江蘇禾笑化工有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、15～20 g瓊脂、1 000 mL自來水，pH值自然；稻稈玉米培養(yǎng)基：40 g稻稈、20 g玉米、20 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 稻瘟病菌孢子懸浮液制備 取培養(yǎng)10 d后的產(chǎn)孢平板（稻稈玉米培養(yǎng)基），用無菌水洗下孢子，4層紗布過濾，調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度至1×105個(gè)/mL，備用。

1.2.2 各醇提物抑菌活性的測定 采用菌絲生長速率法測定各醇提物的抑菌活性[15]。

抑菌率=對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑對(duì)照菌落直徑×100%。

按照生物統(tǒng)計(jì)學(xué)概率值換算表將抑菌率換算成概率值（y），以概率值作為因變量，以濃度的對(duì)數(shù)值（x）作為自變量建立毒力回歸方程（y=ax+b），利用毒力回歸方程求得概率值為5時(shí)的濃度值即為半最大效應(yīng)濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）。同樣的方法計(jì)算出概率值為4.325 5時(shí)的濃度值即為1/4最大效應(yīng)濃度（concentration for 25% of maximal effect，EC25）。endprint

1.2.3 植物醇提物組方設(shè)計(jì)和體外藥效評(píng)價(jià) 根據(jù)“1.2.2”節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，擬合各醇提物的抗稻瘟病病菌毒力方程，計(jì)算出各醇提物的EC25值，并以此為試驗(yàn)中間水平安排均勻設(shè)計(jì)。應(yīng)用DPS軟件逐步回歸，求得試驗(yàn)指標(biāo)抑菌率Y和因素濃度對(duì)數(shù)X（無患子、廣玉蘭、木荷分別為A、B、C）之間的關(guān)系，確定獲得最高試驗(yàn)指標(biāo)時(shí)各醇提物的濃度配比，并進(jìn)行驗(yàn)證[16-19]。

使用Wadley法，根據(jù)增效系數(shù)（SR）來評(píng)價(jià)藥劑混用的增效作用，即SR≥1.5表示具有增效作用；SR≤0.5表示具有拮抗作用；0.5

X1=（PA+PB+PC）/（PA/IA+PB/IB+PC/IC）×100。（1）

式中：X1為混劑的EC50理論值，mg/L；PA、PB、PC分別為混劑中A、B、C的百分含量，%；IA、IB、IC分別為混劑中A、B、C的EC50值，mg/L。

SR=X1X2。（2）

式中：SR為混劑的增效系數(shù)；X1為混劑的EC50理論值，mg/L；X2為混劑的EC50實(shí)測值，mg/L。

1.2.4 盆栽試驗(yàn)[20]和體內(nèi)藥效評(píng)價(jià) 盆栽試驗(yàn)于2012年在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所溫室內(nèi)進(jìn)行，在供試水稻3～4葉期時(shí)，噴霧接種稻瘟病菌孢子懸浮液（孢子濃度為1×105個(gè)/mL），噴藥量以水稻葉片表面有1層薄霧為度，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.4.1 預(yù)防作用試驗(yàn) 首先在水稻秧苗上噴藥，24 h后人工接種稻瘟病病菌，置于26 ℃恒溫保濕箱中，遮光保濕24 h后取出，用噴霧器噴水保濕，每天3～5次，從接種后的第2天開始觀察，第10天調(diào)查各處理的發(fā)病情況，以在秧苗上噴清水作為對(duì)照（CK），根據(jù)病情指數(shù)計(jì)算防治效果。

1.2.4.2 治療作用試驗(yàn) 首先在水稻秧苗上人工接種稻瘟病菌，26 ℃恒溫保濕24 h后噴藥，繼續(xù)保濕，從施藥后的第2天開始觀察，第10天調(diào)查發(fā)病情況，以在秧苗上噴清水作為CK，根據(jù)病情指數(shù)計(jì)算防治效果。

1.2.4.3 秧苗葉瘟病情具體的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[21-22] 0級(jí)：無病；1級(jí)：針頭狀大小褐點(diǎn)；2級(jí)：稍大褐點(diǎn)；3級(jí)：小圓形至稍長的灰色病斑，邊緣褐色，病斑直徑1～2 mm；4級(jí)：典型紡錘形病斑，病斑長1～2 cm，通常局限在2條葉脈之間，受害面積不超過葉片總面積的2%；5級(jí)：典型病斑，受害面積占葉片總面積的3%～10%；6級(jí)：典型病斑，受害面積占葉片總面積的11%～25%；7級(jí)：典型病斑，受害葉面積占葉片總面積的26%～50%；8級(jí)：典型病斑，受害葉面積占葉片總面積的51%～75%，多數(shù)葉片枯死；9級(jí)：全葉枯死。

體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)方法按照公式（3）、公式（4）進(jìn)行。

病情指數(shù)=100×∑（各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值）；（3）

防治效果=CK1-PT1CK1×100%。（4）

式中：CK1為清水對(duì)照的病情指數(shù)；PT1為藥劑處理的病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種植物醇提物抑制水稻稻瘟病病菌菌絲生長的EC25和EC50

2.2 組方復(fù)配結(jié)果

2.2.1 二元組方 以上述任意2種植物醇提物的EC25值為中間水平，安排均勻設(shè)計(jì)水平表，按照均勻試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，測定各組方的抑菌活性，并進(jìn)行分析和驗(yàn)證，獲得2個(gè)具有增效作用的二元組方，分別為組方Ⅰ和組方Ⅱ。

對(duì)表2各試驗(yàn)的濃度對(duì)數(shù)值與抑菌率進(jìn)行線性回歸，獲得回歸方程為Y=76.281 4+0.376 5XA-0.218 0XB-0.002 1XA2+0.000 1XB2+0.000 5XAXB，經(jīng)方差分析，該方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004 6<0.05），因素間的最佳組合為XA=238.2 mg/L、XB=1 187.7 mg/L，即無患子與廣玉蘭醇提物濃度的比值為 1 ∶5。驗(yàn)證試驗(yàn)獲得組方Ⅰ的毒力回歸方程為Y=3.548 4 X+7.534 6，相關(guān)系數(shù)為0.995 2，EC50的理論值X1和實(shí)測值X2分別為611.2、193.1 mg/L，故SR=3.2，為增效作用。

2.2.2 三元組方 對(duì)表4各試驗(yàn)的濃度對(duì)數(shù)值與抑菌率進(jìn)行回歸，獲得回歸方程為Y=-31.120 1+0.206 9XA+0.144 0XB+0.365 5XC-0.000 4XB2-0.000 3 XC2-0.000 3XBXC，經(jīng)方差分析，該方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0030 3<005），因素間的最佳組合為XA=266.4 mg/L、XB=1 187.3 mg/L、XC=62.6 mg/L，即無患子、廣玉蘭、木荷醇提物濃度的比值為4.3 ∶19.0 ∶1.0。驗(yàn)證試驗(yàn)獲得組方Ⅲ的毒力回歸方程為Y=4.036 0 X+7.387 4，相關(guān)系數(shù)為0995 9，EC50的理論值X1和實(shí)測值X2分別為584.8、256.1 mg/L，故SR=2.3，為增效作用。

2.3 各組方防治稻瘟病的效果

2.3.1 對(duì)易感水稻品種C101PKT盆栽感染稻瘟病的預(yù)防和治療作用 由表5數(shù)據(jù)可計(jì)算出各材料單獨(dú)或組方對(duì)易感水稻品種C101PKT盆栽感染稻瘟病預(yù)防作用的毒力方程和EC50，無患子、木荷、組方Ⅰ、組方Ⅱ、組方Ⅲ的毒力方程和EC50分別為Y=0.003 7X+21.206、Y=0.001 9X+15.065、Y=0.001 1X+21.799、Y=0.001 5X+39.099、Y=0.001 5X+38.660，7 782、18 386、25 637、7 267、7 560 mg/L。無患子、木荷、組方Ⅰ、組方Ⅱ、組方Ⅲ對(duì)該水稻品種的治療作用毒力方程和EC50分別為Y=0.003 7X+11.959、Y=0.001 2X+31227、Y=0.001 1X+21.299、Y=0.001 5X+38.021、Y=0001 5X+37.582，10 281、15 644、26 092、7 986、8 279 mg/L。由此可知，對(duì)易感水稻品種C101PKT盆栽感染稻瘟病的防治效果表現(xiàn)為組方Ⅱ>組方Ⅲ>無患子>木荷>組方Ⅰ。除了木荷材料外，治療作用所需要的濃度高于預(yù)防作用所需要的濃度，即同濃度的單劑或組方預(yù)防效果優(yōu)于治療效果。

2.3.2 對(duì)抗性水稻品種兩優(yōu)287盆栽感染稻瘟病的預(yù)防和治療作用 由表6數(shù)據(jù)可計(jì)算出各材料單獨(dú)或組方對(duì)抗性水稻品種兩優(yōu)287盆栽感染稻瘟病的預(yù)防作用毒力方程和EC50，無患子、木荷、組方Ⅰ、組方Ⅱ、組方Ⅲ的預(yù)防作用毒力方程和EC50分別為Y=0.003 7X+20.73、Y=0.001 9X+14436、Y=0.001 1X+21.209、Y=0.001 5X+38.442、Y=0001 5X+37.542，7 980、18 718、26 174、7 705、8 305 mg/L。無患子、木荷、組方Ⅰ、組方Ⅱ、組方Ⅲ對(duì)該水稻品種的治療作用毒力方程和EC50分別為Y=0.003 6X+10.413、Y=0.001 2X+27.903、Y=0.001 1X+19.985、Y=0.001 4X+36.678、Y=0001 5X+36.129，10 996、18 414、27 286、9 516、9 247 mg/L。由此可知，對(duì)抗性水稻品種兩優(yōu)287盆栽感染稻瘟病的預(yù)防和治療效果分別表現(xiàn)為組方Ⅱ>無患子>組方Ⅲ>木荷>組方Ⅰ、組方Ⅲ>組方Ⅱ>無患子>木荷>組方Ⅰ。對(duì)各單劑和組方，治療作用所需要的濃度均高于預(yù)防作用所需要的濃度。

比較表5和表6的數(shù)據(jù)及各單劑和組方的EC50可知，無論是預(yù)防還是治療稻瘟病，對(duì)水稻抗性品種的防治比對(duì)水稻易感品種的防治需要更高的藥劑濃度。

3 結(jié)論與討論

無患子、廣玉蘭、木荷的醇提物單劑及其組方對(duì)水稻稻瘟病病菌菌絲的生長均有一定的抑制作用。3種植物醇提取物的EC50表現(xiàn)為廣玉蘭>木荷>無患子。獲得的3種具有增效作用的組方為無患子、廣玉蘭醇提物濃度的比值為1 ∶5，無患子、木荷醇提物濃度的比值為1.0 ∶2.8，無患子、廣玉蘭、木荷醇提物濃度的比值為4.3 ∶19.0 ∶1.0，體外測得各組方的EC50分別為193.1、132.5、256.1 mg/L，體內(nèi)盆栽測得各組方的EC50分別為25 637、7 267、7 560 mg/L。其中組方Ⅱ、Ⅲ的活性較強(qiáng)，無論對(duì)易感稻種還是抗性稻種，當(dāng)組方Ⅱ和組方Ⅲ濃度達(dá)到40 000 mg/L時(shí)，對(duì)稻瘟病的預(yù)防和治療作用均接近完全控制，效果均優(yōu)于生產(chǎn)上使用的三環(huán)唑（750 mg/L）。

無患子醇提物具有較強(qiáng)的抗稻瘟病活性，其在同樣提取物濃度下的抗稻瘟活性有時(shí)甚至超過組方，但考慮到其果皮來源十分有限，因此應(yīng)用組方更切實(shí)際。

在體內(nèi)盆栽抗稻瘟病的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，抗性品種感染的稻瘟病比易感品種感染的稻瘟病需要更高的藥劑濃度才能達(dá)到同樣的防治效果。在同種水稻品種上，治療稻瘟病比預(yù)防稻瘟病需要更高的藥劑濃度。

雖然使用組方防治稻瘟病需要的濃度比陽性對(duì)照三環(huán)唑的濃度（750 mg/L）更高，但組方具備天然植物源提取物、無殘留、不會(huì)產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，有利于克服化學(xué)藥劑環(huán)境殘留[23]和稻瘟病病原產(chǎn)生抗藥性[24]的問題，因此，所獲得的組方Ⅱ和組方Ⅲ具有一定的應(yīng)用價(jià)值，可用于綠色稻米生產(chǎn)。

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