室內(nèi)藥效試驗方法的比較

王桂清　馬迪

摘要：為比較室內(nèi)藥效的不同測定方法，在實驗室內(nèi)活體和離體條件下，采用菌片接種法測定不同化學藥劑（500 g/L 異菌脲懸浮劑、50%福美雙可濕性粉劑、50%啶酰菌胺水分散粒劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑）對黃瓜灰霉病的保護作用和治療作用，在含藥培養(yǎng)基上，采用菌絲生長速率法測定不同化學藥劑對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制作用。結(jié)果表明，化學藥劑的活體效果優(yōu)于離體效果，但離體條件下的藥效趨勢與活體條件下的藥效趨勢一致，說明可用離體試驗代替活體試驗；化學藥劑在培養(yǎng)基上的效果優(yōu)于在寄主組織上的藥效，但利用寄主組織進行藥效試驗與田間藥效試驗更近了一步，準確度更高，說服力更強。

關(guān)鍵詞：室內(nèi)藥效；試驗方法；活體；離體；生長速率法；黃瓜灰霉病

中圖分類號： S481+.9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）19-0175-04

收稿日期：2016-05-17

基金項目：山東省自然科學基金（編號：Y2008D57）；山東省自然科學基金聯(lián)合專項（編號：ZR2012CL17）。

作者簡介：王桂清（1968—），女，河北滄州人，博士，教授，主要從事植物保護的教學與科研工作。E-mail：wangguiqing@lcu.edu.cn。 農(nóng)藥的藥效指藥劑施用后對控制目標（有害生物）的作用效果，是衡量效力大小的指標之一。殺菌劑的藥效多用病情指數(shù)的降低及受害率降低的百分率來表示。藥效的測定，一般先經(jīng)室內(nèi)毒力試驗證明有效后，再進行田間小區(qū)試驗。農(nóng)藥室內(nèi)毒力測定是指在室內(nèi)進行的農(nóng)藥測定，優(yōu)點是可以通過大量培養(yǎng)與飼育獲得較為均勻一致的供試生物，便于同時進行大量試驗，在較短時間內(nèi)可以得出結(jié)果。但由于室內(nèi)室外環(huán)境條件差異較大，因此其結(jié)果僅能為田間藥效試驗提供依據(jù)。為探討室內(nèi)藥效的測定方法，本試驗以4種化學藥劑為材料，以黃瓜灰霉病菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）為靶標，采用活體植物及離體葉片接種法和生長速率法，測定不同藥劑對黃瓜灰霉病的保護作用和治療作用、對病菌菌絲生長的抑制作用，并對室內(nèi)藥效的測定方法進行了比較。

1 材料與方法

1.1 供試病菌及培養(yǎng)

引起黃瓜灰霉病的灰葡萄孢菌，由聊城大學植物病理學研究室提供，采用PDA培養(yǎng)基，于（22±1） ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，備用。

1.2 供試藥劑及配制

500 g/L異菌脲懸浮劑（拜耳作物科學有限公司），50%福美雙可濕性粉劑（青島好利特生物農(nóng)藥有限公司），50%啶酰菌胺水分散粒劑（德國巴斯夫公司），70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（新沂豐樂化工有限公司），配制成800 mg/L母液，備用。保護與治療作用試驗的終濃度為25、50、100、200、400 mg/L，菌絲生長速率試驗的終濃度為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L。

1.3 保護與治療作用

1.3.1 試驗時間和地點 試驗于2015年7月至12月在聊城大學農(nóng)學院生態(tài)溫室和植物病理學研究室進行。

1.3.2 黃瓜幼苗的種植與管理 供試黃瓜種子為津研4號（山東濟南大江種子有限公司）。將種子用溫水浸種24 h后，種在質(zhì)地均勻的營養(yǎng)土中，1缽1株，放于溫室中（30 ℃、40%濕度）培養(yǎng)至4張真葉期。保證黃瓜幼苗健壯，及時澆水，正常管理，病株和弱株及時清除。

1.3.3 接種與調(diào)查 接種：采用菌餅法接種，待黃瓜長至4張真葉期時進行接種。用直徑為0.5 cm的打孔器將培養(yǎng)5 d的灰葡萄孢菌平板打制成菌餅，以備接種用。

活體防效：直接在黃瓜苗上進行，保證葉片大小和葉位一致，1株1葉。保護作用：先向內(nèi)加少量吐溫-20藥劑均勻噴于葉片表面，1 mL/葉，待藥液陰干，8 h后接種于葉正面，1葉2點，5次重復，無菌水對照；治療作用：接種8 h后噴藥。接種后的黃瓜苗放入溫度為（22±1） ℃、濕度大于90%的恒溫培養(yǎng)箱中生長，接種后3 d內(nèi)注意保濕，以后正常管理。

離體防效：采摘大小、葉位一致的黃瓜葉片，葉柄用棉球保濕，葉正面向上放于鋪有濕濾紙的直徑為14 cm的培養(yǎng)皿中。保護作用、治療作用的接種方法和管理方法同上，5次重復，無菌水對照。

調(diào)查：活體接種5 d、離體接種3 d后調(diào)查發(fā)病情況，測量其病斑直徑（十字交叉法），計算抑制率。

病斑直徑（cm）=2次測量平均值（cm）-菌餅直徑（cm）。

抑制率=對照病斑直徑（cm）-處理病斑直徑（cm）對照病斑直徑（cm）×100%。

1.4 菌絲生長的抑制作用

以生長速率法（瓊膠平板法）[1]測定化學藥劑對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制作用，所用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，藥劑終濃度分別為200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 mg/L，以無菌水為對照。菌餅直徑為0.5 cm，每皿1塊，3次重復，（21±1） ℃ 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待對照菌落直徑在3 cm以上時，用十字交叉法測量菌落直徑。根據(jù)菌落直徑求抑制生長的百分率，公式如下：

菌落直徑（cm）=2次測量平均值（cm）-菌餅直徑（cm）。

菌絲生長抑制率=對照菌落直徑（cm）-處理菌落直徑（cm）對照菌落直徑（cm）×100%。

1.5 毒力回歸曲線的建立

取不同的化學藥劑，按試驗要求配制系列濃度。試驗重復3次，建立毒力回歸方程。將抑菌的百分率轉(zhuǎn)換成概率值，濃度轉(zhuǎn)換成對數(shù)，進行概率值分析，求出不同藥劑對病原菌的抑制中濃度（EC50）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)整理，經(jīng)DPSv 7.01統(tǒng)計軟件進行方差分析，線性回歸等由SPSS 13.0完成。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 4種藥劑對黃瓜灰霉病的活體藥效

2.1.1 4種藥劑對黃瓜灰霉病的活體保護作用 室內(nèi)利用黃瓜幼苗測定4種化學農(nóng)藥對灰葡萄孢菌引起的黃瓜灰霉病的保護作用，接種5 d后，各藥劑的抑菌率見圖1，抑菌中濃度（EC50）見表1。

由圖1、表1可以看出，在活體條件下各種藥劑對黃瓜灰霉病均表現(xiàn)出較好的保護作用，且隨著藥劑濃度的升高藥效逐漸增強。圖1表明，異菌脲的保護作用最強，供試濃度下藥效均為最好，其次為福美雙；當藥劑濃度為200 mg/L時，僅有異菌脲的藥效超過50.00%，為53.21%；當濃度為 400 mg/L 時，4種供試化學農(nóng)藥的藥效均超過50.00%，異菌脲的藥效已達到64.98%，福美雙的接近60.00%，為59.34%。從表1可以看出，異菌脲、福美雙、啶酰菌胺和甲基硫菌靈4種化學農(nóng)藥的EC50分別為150.74、220.20、345.05、378.39 mg/L，即4種農(nóng)藥的藥效依次降低。

2.1.2 4種藥劑對黃瓜灰霉病的活體治療作用 接種5 d后治療作用的抑菌率見圖2，EC50見表2。活體條件下各種藥劑對黃瓜灰霉病均有治療作用，且隨著藥劑濃度的增加藥效提高。圖2表明，供試濃度下4種供試藥劑異菌脲、福美雙、啶酰菌胺、甲基硫菌靈的藥效依次降低。由表2可見，異菌脲、福美雙、啶酰菌胺、甲基硫菌靈的EC50依次為144.02、26319、361.20、458.64 mg/L，說明異菌脲的治療作用最好。

2.2 4種藥劑對黃瓜灰霉病的離體藥效

2.2.1 4種藥劑對黃瓜灰霉病的離體保護作用 在實驗室內(nèi)離體條件下利用黃瓜葉片測定4種化學藥劑對黃瓜灰霉病的保護作用，接種3 d后的效果見圖3、表3。

由圖3可以看出，離體條件下不同藥劑對黃瓜灰霉病的保護效果存在差異，當藥劑濃度為200 mg/L時，僅有異菌脲的藥效超過了50.00%，為52.18%，其余三者低于4700%；當藥劑濃度為400 mg/L時，異菌脲和福美雙的藥效達到或超過了60.00%，分別為67.74%、60.00%， 而甲基硫菌靈和啶酰菌胺的藥效低于50.00%，分別為46.05%、49.76%。

由表3可以看出，在離體條件下供試的4種化學農(nóng)藥中，異菌脲對黃瓜灰霉病的保護效果最好，EC50最小，為 170.95 mg/L，啶酰菌胺的保護效果最差，EC50最大，為 402.49 mg/L，后者是前者的2.35倍，即啶酰菌胺的保護效果僅為異菌脲的1/3至1/2；福美雙和甲基硫菌靈的保護效果介于兩者之間，EC50分別為219.83、367.68 mg/L。 表3 不同化學藥劑對黃瓜灰霉病的離體保護作用

藥劑毒力回歸方程相關(guān)系數(shù)EC50（mg/L）95%置信區(qū)間異菌脲 y=2.408 7+1.160 5x0.998 1170.95131.22～222.71福美雙 y=2.794 1+0.941 8x0.994 0219.83152.72～316.43 甲基硫菌靈y=2.396 4+1.014 9x0.950 5367.68231.16～584.82 啶酰菌胺 y=1.564 7+1.318 8x0.997 7402.49271.18～597.38

2.2.2 4種藥劑對黃瓜灰霉病的離體治療作用 接種3 d后離體條件下的治療作用效果見表4、圖4。在離體條件下異菌脲對黃瓜灰霉病的治療效果最好，供試濃度下的抑菌率最高，當濃度為200 mg/L時，藥效為60.97%，當濃度為400 mg/L時，藥效達到71.69%，其抑菌的EC50最小，為106.88 mg/L；啶酰菌胺的治療效果最差，當其濃度為400 mg/L時，藥效不足50.00%，為47.58%，其抑菌的EC50最大，為456.62 mg/L。

2.3 4種藥劑對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制作用

實驗室內(nèi)采用生長速率法測定4種化學藥劑對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制作用，抑制率見圖5，抑菌中濃度（EC50）見表5。在含藥培養(yǎng)基上，4種化學藥劑對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制效果較好，當藥劑濃度為25.0 mg/L時，異菌脲對菌落生長的抑制率已達到59.25%；當藥劑濃度為 50.0 mg/L 時，異菌脲和福美雙對菌落生長的抑制率已超過80.00%，甲基硫菌靈對菌落生長的抑制率也達到69.27%；當藥劑濃度為 100.0 mg/L 時，4種化學藥劑對菌落生長的抑制率均超過75.00%，異菌脲、福美雙和甲基硫菌靈的已達95.00%；當藥劑濃度為200.00 mg/L時，4種化學藥劑對菌落生長的抑制率均超過94.00%，異菌脲、福美雙、甲基硫菌靈的抑制率已達100.00%。比較EC50，異菌脲、福美雙、甲基硫菌靈和啶酰菌胺4種化學藥劑對菌落生長的抑制中濃度分別為2057、26.23、31.12、45.93 mg/L，異菌脲的EC50僅為啶酰菌胺的 1/2，即異菌脲對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制效果是啶酰菌胺的2倍。

比較活體保護作用和菌絲生長抑制作用，異菌脲和啶酰菌胺活體保護作用的EC50分別為150.74、345.05 mg/L，兩者對菌絲生長抑制作用的EC50分別為20.57、45.93 mg/L，保護作用EC50是菌絲生長抑制作用EC50的7.33、7.51倍，即藥劑對菌絲生長的抑制效果是活體保護效果的7.33、7.51倍。

3 結(jié)論與討論

農(nóng)藥田間藥效試驗是在田間進行的農(nóng)藥對有害生物施藥效果的試驗，這是確定新的農(nóng)藥品種能否在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上大面積推廣應用的重要方法。一般農(nóng)藥經(jīng)室內(nèi)試驗證明有效后，方可進行田間藥效試驗，可見室內(nèi)藥效試驗的重要性。

本研究在實驗室內(nèi)分別在活體和離體條件下，采用菌片接種法測定不同化學藥劑對黃瓜灰霉病的保護作用和治療作用。結(jié)果表明，供試的4種化學藥劑對黃瓜灰霉病既有保護作用也有治療作用，且隨著藥劑濃度的升高藥效逐漸提高，與前人的研究結(jié)果[1-4]一致；化學藥劑的保護作用優(yōu)于治療作用，充分體現(xiàn)了“預防為主”的植保理念；化學藥劑的活體效果優(yōu)于離體效果，但離體條件下的藥效趨勢與活體條件下的藥效趨勢一致，說明可用離體試驗代替活體試驗。endprint

室內(nèi)藥效試驗最常用的測定方法是菌絲生長速率法[5-6]。本研究在含藥培養(yǎng)基上，采用菌絲生長速率法測定不同化學藥劑對黃瓜灰霉病菌菌絲生長的抑制作用，與在寄主組織上的藥效比較，化學藥劑在培養(yǎng)基上的效果優(yōu)于在寄主組織上的藥效，如50%啶酰菌胺水分散粒劑在寄主組織上的EC50約為460 mg/L（活體上在345～362 mg/L之間，離體上在402～457 mg/L之間），在培養(yǎng)基上EC50約為 46 mg/L。出現(xiàn)這種差異的原因在于菌絲生長抑制作用試驗是在實驗室內(nèi)培養(yǎng)條件恒定密閉的培養(yǎng)皿中進行的，藥劑的活性成分無散發(fā)、培養(yǎng)基無抗性，藥劑的藥效全部發(fā)揮出來；而活體保護作用雖然也是在培養(yǎng)條件恒定的實驗室內(nèi)進行，但利用的是寄主苗，空間開放，藥劑的活性成分有散發(fā)、寄主有抗性，藥劑的藥效不能百分百發(fā)揮出來。

唐明等通過田間藥效試驗發(fā)現(xiàn)，50%啶酰菌胺水分散粒劑對黃瓜灰霉病的防效較好，在用藥量為5.625 kg/hm2時，防效在90%以上，用藥量為3.375 kg/hm2時，防治效果在75% 以上，用藥量在4.500 kg/hm2時，防治效果大于80%[7]。據(jù)此可推算出，啶酰菌胺田間藥效的EC50約為 15 000 mg/L。這與本研究的室內(nèi)結(jié)果差異明顯，原因在于田間藥效試驗是在環(huán)境條件多變、空間完全開放的活體寄主上進行的，藥劑的活性成分散失嚴重、寄主存在抗藥性，藥劑的藥效發(fā)揮較弱。供試藥劑在寄主組織上的藥效遠不如在培養(yǎng)基上對菌絲生長的抑制效果，但利用寄主組織進行藥效試驗與田間藥效試驗更近了一步，準確度更高，說服力更強。

農(nóng)藥本身，包括農(nóng)藥的化學成分、理化性質(zhì)、作用機制、使用劑量以及加工性狀等；防治對象，包括生物學特性和發(fā)育階段等；環(huán)境因素，如溫度、濕度、雨水、光照、風、土壤性質(zhì)等，直接影響著病蟲害的生理活動和農(nóng)藥性能的發(fā)揮，結(jié)果都會影響農(nóng)藥的藥效[8]。因此，在使用農(nóng)藥前，必須掌握它的性能特點、防治對象的生物學特性，在施用過程中，充分利用一切有利因素，控制不利因素，以求達到最佳防治效果[9]。

參考文獻：

[1]王桂清.遼細辛提取物對灰葡萄孢菌的抑制效果[J]. 植物保護，2008，34（2）：53-57.

[2]趙建江，王文橋，馬志強，等. 啶酰菌胺與吡唑醚菌酯混配對灰葡萄孢的增效作用[J]. 農(nóng)藥，2016，55（3）：211-213.

[3]孟昭赫.介紹一種新的殺菌劑——撲海因（RovraL）[J]. 國外醫(yī)學（衛(wèi)生學分冊），1986（2）：89-90.

[4]蔣治國，王博超，堵燕鈺.甲基托布津在青菜中的殘留動態(tài)規(guī)律[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學，2015，43（11）：93-94.

[5]魏 萍，劉幸紅，萬平平，等. 5 種殺菌劑對黃瓜灰霉病菌的室內(nèi)毒力測定[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學，2014，46（10）：105-106.

[6]劉鳴韜，田雪亮.嘧霉胺對黃瓜灰霉病的室內(nèi)毒力測定和田間防效研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2015，54（20）：5022-5024.

[7]唐 明，晉知文，謝學文，等. 啶酰菌胺對黃瓜灰霉病防治效果的綜合評價[J]. 中國蔬菜，2016（2）：51-55.

[8]鄭 偉，王 彬，馬 驍，等. 6種殺菌劑防治火龍果莖斑病的田間藥效[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（2）：140-141.

[9]梁皇英，何祖鈾.農(nóng)藥的藥效和藥害[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學，1990（2）：31-34. 楊小輝，彭玉萌，霍光華，等. 無患子、木荷、廣玉蘭提取物組方復配及其抗稻瘟病體內(nèi)、體外活性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45（19）：179-183.endprint