雷公藤多甙片對(duì)狼瘡性腎炎外周血單個(gè)核細(xì)胞多藥耐藥蛋白表達(dá)的影響

張文娟+肖厚勤+蘇玉玲

[摘要] 目的 研究雷公藤多甙片（TG）對(duì)狼瘡性腎炎外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）多藥耐藥蛋白表達(dá)的影響。方法 選擇2015年11月～2017年5月我院收治的58例LN患者為研究對(duì)象，分為接受TG治療的TG組（29例）和接受常規(guī)激素治療的對(duì)照組（29例），分別提取兩組治療前后PBMCs，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)TG對(duì)PBMCs多藥耐藥相關(guān)蛋白蛋白（MRP）和多藥耐藥相關(guān)基因（MDR1）和P-糖蛋白170（P-gp 170）表達(dá)的影響。結(jié)果 治療3個(gè)月后，兩組PBMCs MRP、MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯提高（P<0.05），且TG組PBMCs MRP、MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；兩組PBMCs P-gp 170陽(yáng)性表達(dá)率均明顯提高（P<0.05），且TG組PBMCs P-gp 170陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。 結(jié)論 TG可有效提高LN患者PBMCs MRP、MDR1及P-gp 170表達(dá)，提高患者免疫力，改善預(yù)后，LN患者治療中應(yīng)檢測(cè)多藥耐藥蛋白表達(dá)水平以確定其耐藥性。

[關(guān)鍵詞] 狼瘡性腎炎；雷公藤多甙片；單個(gè)核細(xì)胞；多藥耐藥蛋白

[中圖分類號(hào)] R593.342 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2017）20-45-03

The effect of tripterygium glycosides on the expression of multidrug resistance proteins in peripheral blood mononuclear cells in patients with lupus nephritis

ZHANG Wenjuan XIAO Houqin SU Yuling

Department of Nephrology，Rheumatology and Immunology， the Fifth People's Hospital of Dongguan，Dongguan 523000，China

[Abstract] Objective To study the effect of tripterygium glycosides （TG） on the expression of multidrug resistance proteins in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） of patients with lupus nephritis （LN）. Methods A total of 58 patients with LN treated in our hospital from November 2015 to May 2017 were selected as study subjects and divided into TG group （treated with TG，29 cases） and the control group （given routine hormonotherapy，29 cases）.PBMCs of the two groups were extracted before and after treatment， and reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to detect the effects of TG on the expression of multidrug resistance associated protein （MRP），multidrug resistance associated genes （MDR1） and P-glycoprotein 170 （P-gp 170） in PBMCs. Results After 3 months of treatment，the relative expression levels of PBMCs，MRP and MDR1 mRNA in two groups were significantly increased （P<0.05），and TG group，MDR1 mRNA expression was significantly higher than the control group （P<0.05） the relative expression of PBMCs MRP and MDR1 mRNA in of TG group was significantly higher than that in the control group （P<0.05）.The positive expression rates of PBMCs P-gp 170 in two groups were significantly increased （P<0.05），and the positive rate of PBMCs P-gp 170 expression in the TG group was significantly higher than that in the control group （P<0.05）. Conclusion TG can effectively improve the expression of PBMCs，MRP，MDR1 and P-gp 170 in patients with LN，improve the immunity of patients and improve the prognosis.The expression level of multidrug resistance protein should be detected in patients with LN in order to determine their drug resistance.endprint

[Key words] Lupus nephritis；Tripterygium glycosides；Mononuclear cells；Multidrug resistance proteins

狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是繼發(fā)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）最常見(jiàn)的嚴(yán)重疾病，其發(fā)病率高達(dá)60%，且存在腎臟病變，嚴(yán)重影響患者的生存率[1]。為阻止LN的進(jìn)展和復(fù)發(fā)，保護(hù)患者腎功能，臨床主要的治療方法為免疫抑制治療的糖皮質(zhì)激素（GC）治療，但復(fù)發(fā)率高、費(fèi)用高，且存在副作用[2]。雷公藤多甙片（tripterygium glycosides，TG）是具有較強(qiáng)抗炎和免疫抑制作用的雷公藤提取物制成的片劑，對(duì)LN的療效較好[3]。本研究選取2015年11月 ～ 2017年5月我院收治的58例LN患者為研究對(duì)象，探討TG對(duì)LN患者外周血單個(gè)核細(xì)胞多藥耐藥蛋白表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年11月～2017年5月期間我院收治的58例本地區(qū)LN患者為研究對(duì)象，患者均符合美國(guó)風(fēng)濕協(xié)會(huì)提出的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，經(jīng)B超引導(dǎo)下腎穿刺活檢術(shù)，常規(guī)病理和免疫病理均符合LN病變，均為第一次治療；經(jīng)本院倫理委員會(huì)同意；患者均簽署自愿入組同意書(shū)；排除月經(jīng)不正常的女性、其他腎臟疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或嚴(yán)重精神異常者。將58例患者隨機(jī)分為TG組（29例）和對(duì)照組（29例），TG組男/女為1/28，平均年齡（37.59±4.20）歲，平均病程2.4年；對(duì)照組男/女為1/28，平均年齡（38.06±4.29）歲，平均病程2.2年，兩組LN患者一般資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 治療方法

所有患者均給予常規(guī)激素治療，TG組加用TG（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，Z44023753，10mg），口服20mg/次，3次/d，兩組均持續(xù)治療1個(gè)月。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 RT-PCR法檢測(cè)治療前后PBMCs MRP、MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 分別于治療前和治療后采集空腹10h外周靜脈血2ml，采用梯度離心法分離提取PBMCs，提取RNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA直接進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；MRP：94℃變性50sec，退火54℃50sec，72℃延伸1min，共38個(gè)循環(huán)，72℃10min，42℃ 5min；MDR1：退火溫度為56℃，其他與MRP一樣；以β-actin為內(nèi)參物，引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物均在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，使用凝膠成像分析儀進(jìn)行光密度掃描，結(jié)果采用2-△△CT的方法計(jì)算MRP和MDR1的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)P-gp 170水平 采集治療前和治療后空腹血樣標(biāo)本50μL→加入6μL PE標(biāo)記的P-gp 170→混勻后，室溫避光孵育15min→加入500μL溶血素，溶血10min→加入9g/L鹽水1mL混勻→離心5min，棄上清液→加入250μLPBS，混勻→使用Beckman CytoFLEX流式細(xì)胞儀測(cè)定淋巴細(xì)胞和P-gp 170陽(yáng)性表達(dá)率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，PBMCs MRP、MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量等計(jì)量數(shù)據(jù)用（）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前后PBMCs MRP、MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

治療前，兩組PBMCs MRP、MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.22，0.89，P>0.05）；治療3個(gè)月后，兩組PBMCs MRP、MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯提高（t=8.39，8.77，3.27，4.09，P<0.05），且TG組PBMCs MRP、MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（t=5.49，3.72，P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 兩組治療前后PBMCs P-gp 170水平比較

治療前，兩組PBMCs P-gp 170陽(yáng)性表達(dá)率比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.22，P>0.05）；治療3個(gè)月后，兩組PBMCs P-gp 170陽(yáng)性表達(dá)率均明顯提高（t=12.28，3.76，P<0.05），且TG組PBMCs P-gp 170陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組（t=7.96，P<0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

大多中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為L(zhǎng)N的病機(jī)為素體氣陰虧虛，肝腎不足，熱毒或濕毒乘虛而入，其治療應(yīng)以中藥為佳，不僅療效優(yōu)于單純西藥治療，還能減輕西藥的不良反應(yīng)和減少病情反復(fù)[5]。雷公藤多甙片是近年來(lái)被臨床證實(shí)是治療LN的佳藥，其藥物成分為雷公藤根部提取物，而雷公藤是由二萜、生物堿、三萜、甙、糖、醇等多種成份共同發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等藥理作用[6-7]。LN患者治療失敗或病情反復(fù)的主要原因?yàn)槠渲委熤械墨@得性多藥耐藥，發(fā)生的機(jī)制較復(fù)雜，按照細(xì)胞內(nèi)藥物作用靶點(diǎn)的不同，可分為MDR1的過(guò)度表達(dá)和MRP介導(dǎo)的耐藥性等[8]。MDR1基因可編碼膜糖蛋白P-gp，P-gp170是其產(chǎn)物之一，它可識(shí)別多種化學(xué)結(jié)構(gòu)或性質(zhì)不同的藥物，可通過(guò)消耗能量將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物跨膜泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，通過(guò)降低細(xì)胞毒作用而存活，從而產(chǎn)生多藥耐藥作用[9]。MRP基因是一種人體非P-gp的多藥耐藥基因[10]。近年研究表明，MDR1、P-gp170及MRP在正常人體中表達(dá)具有廣泛性、低水平、不均勻等特性，遍布人體各大器官組織，且各器官的表達(dá)水平差異較大[11]。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，LN患者PCMCs均有MDR1、P-gp170及MRP的表達(dá)，且治療后表達(dá)量明顯高于治療前，提示MDR1、P-gp170及MRP的表達(dá)與激素耐藥具有相關(guān)性，機(jī)體在激素刺激下，MDR1和MRP基因活化，導(dǎo)致PCMCs多藥耐藥蛋白表達(dá)也升高，降低機(jī)體對(duì)激素的敏感性，繼而產(chǎn)生激素耐藥[12]。而TG組治療后MDR1、P-gp170及MRP的表達(dá)水平明顯高于于治療前和對(duì)照組，因?yàn)門G與激素聯(lián)用具有協(xié)同作用，TG能通過(guò)cAMP穩(wěn)定激素受體mRNA，上調(diào)其數(shù)量，從而增強(qiáng)激素作用[13]。同時(shí)TG具有抑制和雙向調(diào)節(jié)LN患者免疫功能的作用，它能通過(guò)抑制淋巴細(xì)胞活化、T淋巴細(xì)胞的表達(dá)和誘導(dǎo)活化的T淋巴細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其免疫抑制作用，減輕LN患者腎臟病理改變，還可通過(guò)其雙向免疫調(diào)節(jié)作用降低機(jī)體對(duì)藥物刺激的非特異性免疫抵抗[14]。過(guò)往研究表明，抗腫瘤藥物的MDR1、P-gp170及MRP的表達(dá)率明顯高于正常人，因?yàn)榭鼓[瘤藥物能誘導(dǎo)PCMCs 凋亡，隨著藥物使用時(shí)間的延長(zhǎng)，PCMCs MDR1、P-gp170及MRP的表達(dá)逐漸上升，P-gp170可與TG結(jié)合，將TG從胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，從而發(fā)揮緩解細(xì)胞毒作用，同時(shí)也降低胞內(nèi)藥物濃度，進(jìn)一步產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象[15]。endprint

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