人乳鐵蛋白的沙漠小球藻表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定

牟云+汪文倫+許萬云+胡夢薇+王丹+嚴(yán)國+王會敏+高劍峰

摘要：為獲得人乳鐵蛋白的沙漠小球藻（Chlorella sp. GTD8A1）的表達(dá)系統(tǒng)和穩(wěn)定的小球藻GTD8A1-hLF工程藻種，將人乳鐵蛋白基因?qū)胄∏蛟寮?xì)胞中進(jìn)行表達(dá)鑒定。以人血cDNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增得到人乳鐵蛋白基因（GenBank登錄號NM-002343.4），經(jīng)KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切后，連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-OCS中，獲得重組質(zhì)粒載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS，將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入GTD8A1中，通過菌落PCR鑒定后擴(kuò)大培養(yǎng)，在DNA和RNA水平分析人乳鐵蛋白基因的整合和轉(zhuǎn)錄，SDS-PAGE和Western Blot分析獲得70 ku的目的蛋白；將轉(zhuǎn)基因藻種（GTD8A1-hLF）在BBM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)周期優(yōu)化。結(jié)果表明，重組人乳鐵蛋白在沙漠小球藻細(xì)胞中表達(dá)成功；通過Elisa測其人乳鐵蛋白表達(dá)量在20 d時達(dá)到最大，濃度為13.28 mg/L。

關(guān)鍵詞：小球藻；人乳鐵蛋白；表達(dá)系統(tǒng)；SDS-PAGE；Western Blot；構(gòu)建；鑒定

中圖分類號： S188 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）19-0138-05

收稿日期：2016-05-06

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31460276）。

作者簡介：牟 云（1992—），女，四川華鎣人，碩士研究生，從事可再生能源的開發(fā)與利用相關(guān)研究。E-mail：1171534413@qq.com。

通信作者：高劍峰，教授。E-mail：jianfengg@shzu.edu.cn。 新疆古爾班通古特沙漠位于準(zhǔn)噶爾盆地的中央，是我國第二大沙漠和面積最大的固定、半固定沙漠。年降水量70～150 mm，冬季有積雪，春季和初夏降水略多，冬季最低地表溫度可達(dá)-25 ℃，夏季最高地表溫度可達(dá)30 ℃[1]。生長在此的小球藻及其他藻類與高等植物經(jīng)過百萬年的進(jìn)化，已經(jīng)完全適應(yīng)了沙漠的極端環(huán)境。從20世紀(jì)80年代末開始，對沙漠微藻的研究與開發(fā)受到國內(nèi)外研究者的重視[2]。研究表明，在新疆沙漠中生長著百余種藻類，小球藻是其中重要的組成部分[3]。小球藻為球形或橢圓形綠色單細(xì)胞藻類植物，也是真核微生物的一種。其細(xì)胞直徑3～8 μm，是地球上最早的生命之一，出現(xiàn)在20多億年前，遺傳相對保守，其廣泛分布于土壤、湖泊、海洋、南北極生態(tài)系統(tǒng)和荒漠，是生物量豐富、生產(chǎn)力較高的單細(xì)胞生物[4]。作為廣泛分布的單細(xì)胞藻類植物，小球藻是在單細(xì)胞水平上研究和建立轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)及其相關(guān)條件優(yōu)化和其他具有藥用價值的副產(chǎn)品開發(fā)和研究的絕佳材料。目前，由于四代生物燃料崛起，國內(nèi)外關(guān)于小球藻基因組學(xué)、基因工程[5]的研究與開發(fā)日趨活躍。近幾年，隨著小球藻基因組測序[6]的完成，以及對其外源蛋白基因排斥與免疫[7-8]的深入研究，使得小球藻這種單細(xì)胞微生物成為最佳生物反應(yīng)器的研究焦點(diǎn)，也是研究外源基因表達(dá)的最佳材料。

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是乳汁中一種重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，是一種糖基化蛋白，分子量為70～80 ku、約700個氨基酸，基因的大小在2 112～2 530 bp之間；廣泛分布在初乳、牛奶及其相應(yīng)的分泌物如眼淚、唾液中，是一種多功能性糖蛋白，在各種動物之間的同源性較高[9]。它能螯合生物體液中的鐵（Fe2+或Fe3+）或者破壞微生物的細(xì)胞膜，使其減少微生物（細(xì)菌、病毒和寄生蟲）的增殖、黏附或者將其殺死，從而表現(xiàn)出抗菌的作用[10]。人乳鐵蛋白（human lactoferrin，hLF）是一條多肽鏈折疊形成2個對稱的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（N and C lobes），包含部分α-螺旋鏈接域[11]。人乳鐵蛋白對免疫、細(xì)菌、病毒、微生物、抗寄生蟲和真菌都有相應(yīng)的保護(hù)和抗性的作用，從而被開發(fā)成食品添加劑和保健品等。同時，科學(xué)界也將乳鐵蛋白列為新型抗生素的候選者[12]。目前，人乳鐵蛋白也被加工成嬰幼兒奶粉的食品添加劑，受到廣大消費(fèi)者的青睞。但是，人乳鐵蛋白主要由初乳和血液來提取獲得，這就使得人乳鐵蛋白的產(chǎn)量少之又少，價格昂貴。因此，有科學(xué)家提出采用分子的手段去開發(fā)不同種類的乳鐵蛋白的重組體，以增加乳鐵蛋白開發(fā)和利用價值。

本試驗(yàn)結(jié)合小球藻的優(yōu)勢和人乳鐵蛋白的優(yōu)點(diǎn)，首次以真核為宿主，在沙漠小球藻GTD8A1基因組上整合外源人乳鐵蛋白基因（hLF），利用小球藻細(xì)胞作為生物反應(yīng)器及其生長周期短、傳代快速、代謝可控的優(yōu)點(diǎn)，獲得穩(wěn)定表達(dá)人乳鐵蛋白小球藻菌株，進(jìn)而為小球藻生產(chǎn)人乳鐵蛋白下游工業(yè)提供優(yōu)良的藻種。這將為人乳鐵蛋白的下游工業(yè)、商業(yè)化和推廣使用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 小球藻GTD8A1由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離、純化和鑒定得到。小球藻GTD8A1所用BBM培養(yǎng)基[13]：NaNO3 250.00 mg/L，KH2PO4 175.00 mg/L，K2HPO4 75.00 mg/L，MgSO4·7H2O 75.00 mg/L，CaCl2·2H2O 25.00 mg/L，NaCl 25.00 mg/L，EDTA 50.00 mg/L，KOH 31.00 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 4.98 mg/L，H3PO4 11.42 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.82 mg/L，MnCl2 1.44 mg/L，MoO3 0.71 mg/L，CaSO4·5H2O 1.57 mg/L，Co（NO3）2·6H2O 0.49 mg/L，98% H2SO4 2 μl/L。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α菌株為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-OCS，由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黃先忠老師饋贈。endprint

1.1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 從NCBI上獲取人乳鐵蛋白的基因序列（NM-002343.4），通過Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。

1.2 方法

1.2.1 藻種培養(yǎng)及其條件 取對數(shù)生長末期的小球藻培養(yǎng)液，按10%的接種量接入裝有100 mL BBM培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光照度100 μmol/（m2·s），光-暗周期12 h-12 h，培養(yǎng)溫度（23.0±05 ℃）。

1.2.2 人全血RNA的提取和人乳鐵蛋白基因的克隆 采用Trizol試劑提取人血總RNA，試驗(yàn)步驟按說明書進(jìn)行?？俁NA產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，30 min）檢測。以提取的RNA為對象，采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific，EU）說明書合成cDNA第一鏈。再以此cDNA為模板，以hLF-F2/hLF-R2為特異性引物，對人乳鐵蛋白基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性60 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸 2.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，得到人乳鐵蛋白基因，將目的基因連接到T4（TaKaRa，China）載體中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素（30 mg/L）平板培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。最后將鑒定的陽性克隆送深圳華大基因科技有限公司測序，對測序結(jié)果進(jìn)行blast比對。

1.2.3 構(gòu)建重組植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS 將目的基因hLF的回收產(chǎn)物和載體pCAMBIA2300-35S-OCS用KpnⅠ和XbaⅠ分別雙酶切4 h，其過程和反應(yīng)體系按TaKaRa的說明書進(jìn)行。將hLF酶切產(chǎn)物與載體酶切產(chǎn)物在連接酶的作用下16 ℃連接過夜，其過程和反應(yīng)體系也按TaKaRa的說明書進(jìn)行。通過熱激法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。然后將感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有卡那霉素（30.0 mg/L）平板培養(yǎng)基上，挑取白斑菌落作為模板，以hLF-F1/ hLF-R1為引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，采用質(zhì)粒小提試劑盒所述步驟提取重組載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS，并用KpnⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

1.2.4 表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS轉(zhuǎn)化小球藻情況的檢測 利用電轉(zhuǎn)化方法[14]將構(gòu)建好的表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS導(dǎo)入小球藻GTD8A1中，將電擊后的小球藻細(xì)胞涂于含30 mg/L卡那霉素的BBM培養(yǎng)基上，挑取平板上長出的單藻落，放在10 μL的ddH2O中，95 ℃ 變性后作為模板，以hLF-F1/hLF-R1為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。陽性轉(zhuǎn)基因藻種GTD8A1-hLF轉(zhuǎn)入到含有 50 mg/L 卡那霉素的BBM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.5 SDS-PAGE和Western Blot分析 小球藻蛋白的提取采用植物蛋白提取試劑盒（TIANGEN，China），具體操作步驟見說明書。Western Blot 過程參照Lin等的試驗(yàn)方法[15]。

1.2.6 培養(yǎng)周期的優(yōu)化 在含有50 mg/L卡那霉素的BBM培養(yǎng)基中，分別于處理后0、4、8、12、16、20、24、28 d測定其總蛋白含量（g/L）和人乳鐵蛋白含量（mg/L）。其中，總蛋白含量（g/L）按考馬斯亮藍(lán)說明書進(jìn)行，人乳鐵蛋白含量（mg/L）按Elisa試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 人全血RNA提取和人乳鐵蛋白基因的克隆

通過Trizol法提取人全血的RNA后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR克隆得到2 133 bp的人乳鐵蛋白基因，經(jīng)測序分析證實(shí)，人乳鐵蛋白基因序列與GenBank（登錄號NM-002343.4）公開的人乳鐵蛋白基因全長序列99%相同，說明目的基因克隆成功，其中電泳檢出了200 bp的條帶可能是由于引物添加過多而引起的引物二聚體造成的試驗(yàn)現(xiàn)象，這對目的基因回收不產(chǎn)生影響，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，其結(jié)果見圖1。

2.2 植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS構(gòu)建和驗(yàn)證

本試驗(yàn)采用雙酶切和DNA酶連接的試驗(yàn)方法構(gòu)建表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS，表達(dá)載體構(gòu)建過程見圖2。構(gòu)建好的載體通過熱激的方法導(dǎo)入到大腸桿菌DH5α細(xì)胞中，然后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖3可知，挑選白斑菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS，將提取好重組質(zhì)粒載體pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS送深圳華大基因科技有限公司測序分析證實(shí)，人乳鐵蛋白基因也整合到重組質(zhì)粒當(dāng)中。同時對重組質(zhì)粒載體PCR和雙酶切檢測，得到2 133 bp的目的條帶。

2.3 DNA和RNA分析

將菌落PCR檢測為陽性小球藻菌落，經(jīng)過含有抗性BMM液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后。采用植物DNA提取試劑盒和Trizol分別提取DNA和RNA，以hLF-F1/hLF-R1為引物進(jìn)行分子水平上分析，通過PRC和RT-PCR分析得到5、6、8、10號小球藻含有2 133 bp的目的條帶，通過結(jié)果表明，人乳鐵蛋白基因也能整合到小球藻細(xì)胞中，并且得到轉(zhuǎn)錄，結(jié)果與預(yù)期一致（圖4）。

2.4 SDS-PAGE和Western Blot分析

將DNA和RNA分子水平上鑒定的5、6、8、10藻種再一次在含有抗性的BBM液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后，采用植物總蛋白提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因藻的總蛋白，通過SDS-PAGE和Western Blot檢測得到70 ku的目的蛋白條帶。其中，圖 5-A 中條帶 5 為 5 號藻蛋白SDS-PAGE試驗(yàn)結(jié)果；條帶6endprint

為6號藻蛋白SDS-PAGE試驗(yàn)結(jié)果；條帶8為8號藻蛋白SDS-PAGE試驗(yàn)結(jié)果；條帶10為10號藻蛋白SDS-PAGE試驗(yàn)結(jié)果；11號為空白對照SDS-PAGE試驗(yàn)結(jié)果。圖5-B中序號與圖5-A一致，只是圖5-B是Western Blot的試驗(yàn)結(jié)果。

2.5 培養(yǎng)周期的優(yōu)化

將藻種（GTD8A1-hLF）在不同的培養(yǎng)時間下，測定人乳鐵蛋白的人乳鐵蛋白含量和總蛋白含量，進(jìn)行3次測量試驗(yàn)結(jié)果的平均值。由圖6可知，最佳的培養(yǎng)周期為20 d，其人乳鐵蛋白含量和總蛋白含量分別為 13.28 mg/L、12.73 g/L。其中，通過RT-PCR預(yù)測人乳鐵蛋白的表達(dá)結(jié)果與用Elisa測定的試驗(yàn)結(jié)果一致，獲得的最適培養(yǎng)周期將作為以下試驗(yàn)的培養(yǎng)周期。

3 討論

試驗(yàn)在宿主小球藻GTD8A1的基因組上插入外源hLF基因?qū)ζ溥M(jìn)行基因改造并成功表達(dá)，建立了人乳鐵蛋白的沙漠小球藻的表達(dá)系統(tǒng)，并通過相關(guān)的手段進(jìn)行鑒定。從人血中獲取RNA克隆出cDNA到人乳鐵蛋白的表達(dá)，其相關(guān)的試驗(yàn)結(jié)果都得到驗(yàn)證（圖1～圖6）。圖1-B中出現(xiàn)200 bp左右的條帶，這與所需要的目的條帶2 133 bp條帶不在同一位置上，造成這樣的原因可能是引物二聚體的出現(xiàn)，但這不會對后續(xù)試驗(yàn)造成影響；圖5-A中獲得了70 ku目標(biāo)條帶和雜帶，同時在11號空載樣的位置上沒有看見目標(biāo)條帶的出現(xiàn)，但是通過Western Blot試驗(yàn)后在圖5-B中11號空載樣的位置也沒有出現(xiàn)目標(biāo)條帶，結(jié)果表明，人乳鐵蛋白的沙漠小球藻的表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功。

人乳鐵蛋白的最初生產(chǎn)主要來自于初乳的分離和純化，其產(chǎn)量小不利于規(guī)模化生產(chǎn)，這就須要探索一種技術(shù)來解決其所存在的問題。藻類早期研究主要利用其自身細(xì)胞合成產(chǎn)物，如β-胡蘿卜素、二十二碳六烯酸（DHA）和蝦青素等[16-17]，來開發(fā)具有商業(yè)和藥用價值的生物產(chǎn)品，隨后也有研究者利用藻類（如螺旋藻、小球藻和柵藻）生物反應(yīng)器來生產(chǎn)一些蛋白保健食品[18]。例如，Koo等成功構(gòu)建牛乳鐵蛋白的小球藻表達(dá)系統(tǒng)并且表達(dá)成功，使得藻類為轉(zhuǎn)基因宿主以及構(gòu)建人乳鐵蛋白的表達(dá)系統(tǒng)提供可能，利用帶CaMv35s啟動子的表達(dá)載體pCAMBIA1304成功構(gòu)建牛乳鐵蛋白的小球藻表達(dá)系統(tǒng)并且表達(dá)成功，獲得目標(biāo)基因序列部分長為 1.1 kb，通過SDS-PAGE和Western Blot技術(shù)檢測到35 ku的蛋白條帶[14]，盡管筆者沒有獲得牛乳鐵蛋白的全長，但是其研究使得藻類成為轉(zhuǎn)基因宿主以及在其細(xì)胞中構(gòu)建人乳鐵蛋白的表達(dá)系統(tǒng)可能。然而，本研究通過帶CaMv35s啟動子的表達(dá)載體pCAMBIA2300的植物表達(dá)載體，成功構(gòu)建了人乳鐵蛋白基因全長的沙漠小球藻表達(dá)系統(tǒng)，獲得轉(zhuǎn)基因藻種GTD8A1-hLF，并通過PCR手段檢測到人乳鐵蛋白基因全長為2 133 bp，以及通過SDS-PAGE和Western Blot技術(shù)檢測到70 ku的蛋白條帶，這將為小球藻生產(chǎn)人乳鐵蛋白全長提供了可能。

然而，國內(nèi)對人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因的研究主要集中在酵母、水稻和動物（牛）等真菌和高等動物中，Jiang等在畢赤酵母細(xì)胞中成功表達(dá)了人乳鐵蛋白，其蛋白濃度高達(dá)1 200 mg/L，但是蛋白活性不高，促使人們進(jìn)一步的開發(fā)其他表達(dá)系統(tǒng)[19]；吳景歡在水稻種成功表達(dá)重組人乳鐵蛋白，其蛋白含量為05%[20]；文勝通過基因工程的手段獲得轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白的牛初乳，并且構(gòu)建了相應(yīng)的表達(dá)體系，其蛋白濃度在2.5～3.5 mg/L 之間[21]。國外對乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因研究主要集中在馬鈴薯和動物（小鼠）等高等植物和動物中，Chong等在馬鈴薯中成功的構(gòu)建和表達(dá)了人乳鐵蛋白，其蛋白表達(dá)濃度為可溶性蛋白總濃度的0.1%[22]；Choi等在馬鈴薯中成功建立了人乳鐵蛋白的表達(dá)載體，其蛋白表達(dá)濃度為可溶性蛋白總濃度的3%[23]；Hwang等在小鼠中構(gòu)建完成人乳鐵蛋白的表達(dá)體系[24]。通過對國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因人乳鐵蛋白研究發(fā)現(xiàn)，在沙漠小球藻進(jìn)行人乳鐵蛋白的表達(dá)還鮮有研究，本研究獲得的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的人乳鐵蛋白的含量在13.28 mg/L，與前人的研究有相似之處，但是該表達(dá)系統(tǒng)還有待進(jìn)一步進(jìn)行產(chǎn)物優(yōu)化研究。

本試驗(yàn)通過目的基因的克隆、載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、分子水平分析以及SDS-PAGE和Western Blot驗(yàn)證，最終獲得了能成功表達(dá)人乳鐵蛋白的植物表達(dá)載體，同時上游重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)也構(gòu)建完成，可以為下游提供必要的技術(shù)基礎(chǔ)和早期的藻種。雖然，人乳鐵蛋白能在小球藻中表達(dá)，但是想要將此技術(shù)運(yùn)用到下游工業(yè)中還有一定的困難，原因在于：第一，本試驗(yàn)只是獲得能表達(dá)人乳鐵蛋白的沙漠小球藻，所有的試驗(yàn)都是在實(shí)驗(yàn)室的條件下進(jìn)行的，若是想要運(yùn)用到下游工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中，還須要進(jìn)一步對其產(chǎn)物條件進(jìn)行優(yōu)化研究和摸索，影響規(guī)模發(fā)酵的諸多條件如重組小球藻在反應(yīng)器當(dāng)中的最適溫度、pH值、光照條件和培養(yǎng)基等。第二，想要重組人乳鐵蛋白的小球藻能夠生產(chǎn)安全、穩(wěn)定的人乳鐵蛋白，那么分離和提取工藝還須要進(jìn)一步地探索。如何在分離提取的過程中不產(chǎn)生對人體有毒害物質(zhì)，而且又不損失應(yīng)用價值和功能，是重組人乳鐵蛋白作為功能性食品和食品添加劑的重要條件之一。第三，后期處理的成本也是發(fā)展的關(guān)鍵問題。相信隨著對微藻研究和認(rèn)識的進(jìn)一步深入，以及下游工業(yè)的分離和提取技術(shù)的發(fā)展，這些問題都將在短時間內(nèi)得以解決，未來運(yùn)用微藻生產(chǎn)人乳鐵蛋的應(yīng)用前景將不可限量。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過RNA和DNA的提取，采用PCR、RT-PCR、測序以及SDS-PAGE和Western Blot等技術(shù)手段，成功地在沙漠小球藻中建立了人乳鐵蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，獲得了能夠表達(dá)人乳鐵蛋白的重組表達(dá)載體pCANBIA2300-35S-hLF-OCS，其人乳鐵蛋白的表達(dá)濃度為13.28 mg/L。

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