ORP調(diào)控對馬克斯克魯維酵母發(fā)酵纖維素水解液的影響

馮華良，高教琪，侯勝博，李益民，袁文杰

（大連理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024）

ORP調(diào)控對馬克斯克魯維酵母發(fā)酵纖維素水解液的影響

馮華良，高教琪，侯勝博，李益民，袁文杰

（大連理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024）

采用通氣的方式進(jìn)行氧化還原電位（oxidation-reduction potential，ORP）調(diào)控，研究在添加抑制物條件下Kluyveromyces marxianus1727-5利用葡萄糖、木糖以及兩者混合體系的發(fā)酵性能，在此基礎(chǔ)上考察了ORP調(diào)控策略對玉米秸稈水解液發(fā)酵的影響。研究結(jié)果表明：在調(diào)控ORP策略下，多種混合抑制物對酵母生長代謝造成的損害得以有效改善，細(xì)胞活性高，木糖、葡萄糖代謝速率加快。葡萄糖與木糖共發(fā)酵時，ORP調(diào)控至-150 mV時，葡萄糖發(fā)酵時間縮短近30%，木糖醇濃度由3 g·L-1增加到10 g·L-1。ORP調(diào)控策略也同樣能有效緩解玉米秸稈水解液中較高濃度的多種抑制物對酵母細(xì)胞的脅迫，ORP為-100 mV時，相比于對照組，在保持終點(diǎn)乙醇不變的情況下，葡萄糖的發(fā)酵時間縮短了22%；木糖消耗由4.88 g·L-1增至10.27 g·L-1，木糖醇得率也由0.20 g·g-1提高至0.48 g·g-1。

通氣；氧化還原電位；木質(zhì)纖維素；抑制物；發(fā)酵

引 言

木質(zhì)纖維素原料是微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的良好底物，具有價格低廉，含糖量多，不與人爭糧的優(yōu)點(diǎn)。纖維素乙醇的使用可以減少溫室氣體的排放，對環(huán)境污染小[1-3]，在世界范圍內(nèi)受到廣泛關(guān)注。但木質(zhì)纖維素具有復(fù)雜的木質(zhì)素-纖維素-半纖維素結(jié)構(gòu)，在降解成可被微生物利用的糖之前，需要進(jìn)行包括酸處理、堿處理在內(nèi)的預(yù)處理，使纖維素酶等水解酶類更易進(jìn)入，從而將纖維素、半纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖類[4-5]。而木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中產(chǎn)生的一系列毒性副產(chǎn)物，主要有弱酸（乙酸、甲酸以及乙酰丙酸）、呋喃衍生物[糠醛、五羥甲基糠醛（5-HMF）]和酚類化合物等[6]。這些有毒化合物對發(fā)酵微生物的抑制作用是阻礙纖維素乙醇工業(yè)化發(fā)展的重要技術(shù)瓶頸之一[7-8]。

目前，降低或去除木質(zhì)纖維素水解液中抑制物影響的策略主要可分為兩大類[9]。一類是去除水解液中的抑制物、減少抑制物產(chǎn)生以及緩解微生物抑制，包括優(yōu)化預(yù)處理、水解液脫毒技術(shù)、過程工程控制等。另一類是提高發(fā)酵微生物的抑制物耐受性，主要有微生物的篩選、進(jìn)化工程、基因工程方法等。

細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行著各種各樣以氧化還原反應(yīng)為主的代謝過程，保持胞內(nèi)氧化還原平衡是維系正常生命活動的必要條件[10]。氧化還原電位（ORP）反映了溶液中物質(zhì)表現(xiàn)出來的宏觀氧化-還原性，因而ORP成為表征生化反應(yīng)的重要參數(shù)之一。而且細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡間接受到胞外環(huán)境的 ORP水平影響[11]。

Liu等[12]研究了 ORP（-150 mV）調(diào)控下S.cerevisiae高濃度乙醇發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)控制水平下的細(xì)胞活性顯著提高，乙醇產(chǎn)率增加。他們對發(fā)酵過程中酵母細(xì)胞全基因表達(dá)水平進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示不僅部分糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)與 ORP變化出現(xiàn)了關(guān)聯(lián)的趨勢，此外，還發(fā)現(xiàn)了與耐受滲透壓脅迫、乙醇抑制等相關(guān)的甘油、海藻糖合成代謝基因，熱休克蛋白基因的表達(dá)變化以適應(yīng)環(huán)境脅迫。Gao等[13]在研究工作中已經(jīng)對Kluyveromyces marxianusY179（在未通氣條件分別以120、230 g·L-1菊粉為底物以及利用通入無菌空氣的方式將發(fā)酵中 ORP調(diào)控至-130 mv水平下230 g·L-1菊粉為底物）的3種發(fā)酵條件下轉(zhuǎn)錄分析。發(fā)現(xiàn)合適的通氣量引起了轉(zhuǎn)錄響應(yīng)的變化，與氧化脅迫（如TPX1）和自噬（如ATG）相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平明顯的上調(diào)或下調(diào)以保持較高的細(xì)胞活性，從而實(shí)現(xiàn)較優(yōu)的發(fā)酵性能。郝學(xué)密等[14]在S. cerevisiae乙醇發(fā)酵過程中，利用氧化劑赤血鹽和還原劑二硫蘇糖醇調(diào)節(jié)初始 ORP（305、157、-150 mV），研究了不同ORP水平下細(xì)胞對抑制物的耐受性影響。發(fā)現(xiàn)氧化狀態(tài)（305、157 mV）增強(qiáng)了細(xì)胞通過自身代謝脫毒。

這些研究表明對發(fā)酵過程中 ORP進(jìn)行調(diào)控不僅能改變細(xì)胞代謝流，使其流向利于目標(biāo)產(chǎn)物生成的方向，也能改善細(xì)胞的脅迫耐受性，這也是本研究引入ORP調(diào)控策略的切入點(diǎn)之一。

本文以比例-積分-微分（proportion integration differentiation，PID）控制為理論基礎(chǔ)，采用通入無菌空氣的方式進(jìn)行ORP調(diào)控，研究在多種水解液抑制物（乙酸、甲酸、糠醛及5-HMF）存在的條件下，不同ORP條件對Kluyveromyces marxianus1727-5葡萄糖、木糖以及兩者組成的混合糖發(fā)酵的影響。最后，結(jié)合相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用優(yōu)化出的ORP調(diào)控策略，對K. marxianus1727-5發(fā)酵玉米秸稈水解液進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 菌株和發(fā)酵

菌種：馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus），購自中國工業(yè)微生物保藏中心，編號1727。K. marxianus1727-5，由本實(shí)驗(yàn)室以K.marxianus1727為出發(fā)菌株馴化獲得。以上菌株均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

活化（YPD）培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖 20，蛋白胨10，酵母粉10，121℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉10（葡萄糖發(fā)酵）；木糖20，蛋白胨10，酵母粉10（木糖發(fā)酵和葡萄糖與木糖共發(fā)酵），121℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L-1）：①葡萄糖 100，蛋白胨10，酵母粉10，乙酸1.5，甲酸0.8，糠醛0.8，五羥甲基糠醛 0.6（葡萄糖發(fā)酵）；②木糖30，蛋白胨10，酵母粉10，乙酸1.2，甲酸0.6，糠醛0.6，五羥甲基糠醛0.5（木糖發(fā)酵）；③葡萄糖100和木糖35，蛋白胨10，酵母粉10，各抑制物濃度與②發(fā)酵一致（葡萄糖與木糖共發(fā)酵），121℃滅菌15 min；抑制物在滅菌后，接種前添加至培養(yǎng)基中。本次研究中，抑制物的種類及濃度依據(jù)目前普遍使用的酸處理，參考相關(guān)文獻(xiàn)添加[15-19]。

搖瓶種子培養(yǎng)：由-80℃冰箱中取出菌種保藏管，接種至8 ml活化培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，在30℃、150 r·min-1條件下培養(yǎng)20 h。再將活化后的菌株轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，30℃、150 r·min-1條件下12 h。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：將種子培養(yǎng)液離心，5000 r·min-1、8min，并用去離子水重懸，接種至盛有1 L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐（Biotec-3BG-4，China）中，將初始菌種密度調(diào)至 OD620=2，通過 1 mol·L-1NaOH控制pH至5.0±0.05，溫度、攪拌速率分別設(shè)定為 30℃、150 r·min-1。

1.2 玉米秸稈預(yù)處理及酶解

實(shí)驗(yàn)中所用玉米秸稈原料購自江蘇連云港，其纖維素含量約為31%，半纖維素含量約為19%，木質(zhì)素含量約為16%。纖維素酶購自諾維信生物技術(shù)有限公司，酶活力150 FPU·ml-1。

玉米秸稈預(yù)處理：玉米秸稈磨碎過0.5 mm篩。稱取150 g，加至盛有1.5 L 2%稀硫酸的7 L發(fā)酵罐中，充分浸潤，高壓蒸汽處理（135℃、30 min）。

酶解：經(jīng)預(yù)處理后，利用15 mol·L-1NaOH將pH調(diào)至5。以30 FPU·g-1的比例加入纖維素酶，酶解過程中，通過 1 mol·L-1NaOH 控制 pH 至4.70±0.05，溫度、攪拌速率分別設(shè)定為50℃、200 r·min-1，酶解時長 72 h。酶解完成后 5000 r·min-1離心10 min，上清液即為玉米秸稈水解液，存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ORP調(diào)控策略

利用通入無菌空氣控制發(fā)酵過程 ORP穩(wěn)定在預(yù)設(shè)值（±2 mV）。木糖發(fā)酵分別控制ORP -150、-120 mV；葡萄糖發(fā)酵設(shè)定值為-200、-150 mV；葡萄糖與木糖共發(fā)酵設(shè)定值為-200、-170、-150及-110 mV；玉米秸稈水解液發(fā)酵設(shè)定值為-100 mV。ORP電極（Pt4805-DPAS-SC-K8S/225，Mettler Toledo，Switzerland）監(jiān)測發(fā)酵過程中氧化還原電位變化，并連接至ORP控制儀（(pH/ORP Transmitter PC-3100，Suntex，China），當(dāng)發(fā)酵過程中氧化還原電位值低于預(yù)設(shè)值時，控制儀開啟氣泵通入無菌空氣，直至達(dá)到預(yù)設(shè)值（+2 mV），然后關(guān)閉氣泵。

1.4 分析方法

生物量測定：利用酶標(biāo)儀（Thermo labsystems Multiskan Ascent 354）測620 nm波長處菌體的吸光度，以O(shè)D620值表示。

發(fā)酵液成分測定：使用 Waters高效液相色譜（Waters 410，MA，USA）分析發(fā)酵液樣品中葡萄糖、木糖、木糖醇、乙醇、甘油、乙酸等代謝物以及甲酸、糠醛、5-HMF等抑制物的含量。色譜柱為有機(jī)酸分析柱AminexHPX-87H（300 mm×7.8 mm，Bio-Rad，Hercules），進(jìn)樣量：20 μl，流動相：0.01 mmol·L-1H2SO4，流速：0.5 ml·min-1，示差檢測器溫度：50℃，柱溫：50℃。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 ORP調(diào)控對多種抑制物存在下木糖發(fā)酵的影響

圖1 ORP調(diào)控下的木糖發(fā)酵Fig.1 Effect of ORP regulation on fermentation using xylose as sole carbon source

表1 不同ORP條件下K. marxianus 1727-5發(fā)酵結(jié)果Table 1 Comparison of fermentation results using K. marxianus 1727-5 under different ORP conditions

2.1.1 細(xì)胞生長及ORP變化 纖維素預(yù)處理過程中產(chǎn)生的多種抑制物如有機(jī)酸、糠醛及其衍生物等對后續(xù)發(fā)酵最顯著的影響是造成細(xì)胞活性下降，抑制細(xì)胞生長[20-22]。如圖1(a)所示，以30 g·L-1木糖為底物，未調(diào)控的對照組，菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基后，其ORP在約4 h即降至最低點(diǎn)-163 mV±2 mV并維持了僅12 h，此后ORP一直在緩慢上升至發(fā)酵終點(diǎn)。這與其細(xì)胞生長呈現(xiàn)出一致的趨勢，在整個發(fā)酵過程中其生物量OD620基本穩(wěn)定在2左右，可見多種抑制物存在的無氧條件下，細(xì)胞生長受到嚴(yán)重影響，細(xì)胞活性較低，代謝緩慢。

由圖1及表1也可知，在ORP設(shè)定為-150 mV時，發(fā)酵進(jìn)行約2 h后達(dá)到預(yù)設(shè)值，開始通入無菌空氣進(jìn)行ORP調(diào)控，但僅僅維持了3 h，此后盡管通氣速率已調(diào)至0.2 vvm，發(fā)酵系統(tǒng)中ORP仍迅速下降，發(fā)酵至24 h，ORP開始穩(wěn)定在-170 mV±2 mV直到發(fā)酵終止。在ORP設(shè)定為-120 mV 時，發(fā)酵開始后不久ORP即達(dá)到預(yù)設(shè)值-120 mV，開始通氣調(diào)控，但也僅維持了約12 h，并在發(fā)酵60 h之后，ORP下降至最低點(diǎn)-155 mV，之后逐漸上升，至96 h，ORP重新維持在-120 mV。發(fā)酵過程中出現(xiàn)了較為明顯的“失控”現(xiàn)象，可能是由于一些關(guān)鍵代謝物的生成影響了發(fā)酵體系的氧化還原電位[23]。整個發(fā)酵過程，ORP預(yù)設(shè)-150、-120 mV條件下，通氣總量分別達(dá)到1622.4和5818 L。ORP與通氣量相互聯(lián)系，并反映出細(xì)胞生長狀況。ORP控制在-150 mV水平下，其生物量濃度（OD620）由未進(jìn)行調(diào)控的對照組2.2增加到2.7，而-120 mV水平下，更增至5.5?？梢娸^高的ORP值意味著通氣量的增加。通氣量高的環(huán)境，細(xì)胞活性高代謝旺盛，從而顯著改善在多種抑制物存在下的細(xì)胞生長狀況。

2.1.2 木糖消耗及產(chǎn)物生成 ORP調(diào)控對菌株木糖發(fā)酵性能也有相當(dāng)明顯的影響。如圖1(c)所示，發(fā)酵至132 h，-150 mV水平下的殘余木糖濃度從對照組的 19.83 g·L-1降至 2.18 g·L-1。而更顯著的是，在-120 mV條件下，發(fā)酵108 h，木糖就被完全消耗。木糖醇濃度由不通氣的 8.92 g·L-1增加至20.36 g·L-1，但得率略有降低，這可能是由于在較高的通氣條件下ORP，更多的木糖用于細(xì)胞生長[24]。

綜上所述，ORP調(diào)控策略改善了在多種抑制物存在下K. marxianus1727-5的生長及木糖發(fā)酵，但ORP“失控”問題突出，有待深入研究。

2.2 ORP調(diào)控對多種水解液抑制物存在下葡萄發(fā)酵的影響

2.2.1 細(xì)胞生長及 ORP變化 在多種抑制物存在條件下，含100 g·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基中發(fā)酵結(jié)果如圖2、表1所示。在對照組不通氣發(fā)酵過程中，ORP逐漸降低。細(xì)胞生長也受到了抑制物脅迫等影響。其生物量OD620相比初始接種量，增加了約2倍。

由圖2(a)、(b)也可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ORP預(yù)設(shè)值為-200 mV時，通過通氣控制，發(fā)酵開始2.5 h之后達(dá)到預(yù)設(shè)值，可保持穩(wěn)定至發(fā)酵結(jié)束。而 ORP預(yù)設(shè)值為-150 mV時，發(fā)酵至1.5 h達(dá)到預(yù)設(shè)值，但僅維持不到3 h，之后便逐漸降至最低值-189 mV（葡萄糖耗完，發(fā)酵結(jié)束），后又逐漸上升。此外，如表1所示，兩種調(diào)控狀態(tài)下的總通氣量分別是 53.3和272.5 L。這是由于ORP降低與細(xì)胞活性緊密聯(lián)系[24]。通氣量較少的狀態(tài)下，細(xì)胞活性較差，ORP下降緩慢，即使通入少量的空氣也可明顯提高發(fā)酵液中的ORP。而通氣量多的環(huán)境中，細(xì)胞活性高、代謝旺盛，生長快，ORP下降迅速，需要向發(fā)酵液中通入大量的空氣才能提升ORP值。而且生物量增至較高水平時，即使大量通入空氣，其中氧氣的溶解速率也遠(yuǎn)不及細(xì)胞代謝耗氧速率，致使ORP呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢。這可由ORP預(yù)設(shè)-200、-150 mV條件下，其生物量OD620最高分別增至初始的2.5、3.5倍來相互驗(yàn)證。

圖2 ORP調(diào)控下的葡萄糖發(fā)酵Fig.2 Effect of ORP regulation on fermentation using glucose as sole carbon source

2.2.2 葡萄糖消耗及產(chǎn)物生成 由圖2(c)、表1可知，對照、-200 mV、-150 mV 3種條件下的葡萄糖發(fā)酵結(jié)束時間依次縮短，分別為14、11、9 h，呈現(xiàn)出與木糖發(fā)酵相似的趨勢，即預(yù)設(shè)ORP高，總通氣量大，細(xì)胞耗糖速率快。而且并未出現(xiàn)之前研究中所報道的通氣量大，乙醇產(chǎn)率降低的現(xiàn)象[25]，其乙醇產(chǎn)率分別為0.40、0.39、0.40 g·g-1?？赡苁钦麄€發(fā)酵過程時間相對短，氣體夾帶乙醇極少，也未造成其被進(jìn)一步氧化代謝。此外，ORP調(diào)控下的甘油產(chǎn)量明顯低于未通氣對照組，甘油作為胞內(nèi)主要的保護(hù)物質(zhì)[26]，其產(chǎn)量的減少在一定程度上揭示了通氣降低了抑制物對細(xì)胞造成的不利影響。

2.3 ORP調(diào)控對多種抑制物存在下葡萄糖與木糖共發(fā)酵的影響

2.3.1 細(xì)胞生長及 ORP變化 根據(jù)實(shí)際木質(zhì)纖維素物料水解液主要可發(fā)酵糖類的含量[27]，確定了含多種抑制物的共發(fā)酵培養(yǎng)基中的混合糖濃度，分別是 100 g·L-1葡萄糖和 35 g·L-1木糖。

如圖3(a)所示，未調(diào)控的對照組ORP曲線基本呈現(xiàn)“U”形。其原因是發(fā)酵前期（0～24 h），K.marxianus1727-5優(yōu)先利用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵，此階段的 ORP變化基本與葡萄糖發(fā)酵相似，代謝較旺盛，細(xì)胞快速生長，產(chǎn)生較多 NADH等還原力，ORP逐漸下降，隨生物量增加，其生成的還原力可基本用于維持細(xì)胞代謝生長，ORP維持短暫穩(wěn)定[28]。當(dāng)葡萄糖被消耗之后，木糖成為唯一底物，但其在無氧條件下較難被酵母利用。加之葡萄糖發(fā)酵階段的代謝產(chǎn)物如乙醇、乙酸等加劇了細(xì)胞承受的脅迫壓力。因此細(xì)胞代謝緩慢、酶活性下降，ORP逐漸回升。

而在ORP調(diào)控策略下，如前，生物量增長與維持ORP預(yù)設(shè)值的通氣總量呈比例，隨通氣量增加，生物量最高濃度也隨之上升。相比于對照組在發(fā)酵20 h后生物量達(dá)到最高濃度OD620為3.6，-200、-170、-150及-110 mV條件下分別在18、14、14、12 h后達(dá)到最高濃度（OD620）為 3.9、5.2、4.6、5.8。此外，也可看出-170、-110 mV條件下發(fā)酵前期出現(xiàn)了明顯的“失控”現(xiàn)象，盡管通氣量已分別占總通氣量的近 2/3、1/5，ORP仍然逐漸降至最低值-180、-160 mV，約在30 h后才重新恢復(fù)至預(yù)設(shè)值水平，這可能是由于前期以葡萄糖為主的發(fā)酵階段高細(xì)胞活性和生物量水平需要大量的氧氣，而ORP調(diào)控的幅度越大，需要通入的空氣（或氧氣）量越大。進(jìn)入木糖發(fā)酵階段后，各條件下的生物量濃度相比發(fā)酵過程中的最大值都有不同程度降低，后趨于平穩(wěn)。這主要是由于細(xì)胞活性的下降所致[23]。但通氣總量高的條件，其降幅也較小，這也從側(cè)面揭示了通氣有利于促進(jìn)酵母抵御不良的脅迫環(huán)境，提高細(xì)胞活性及木糖代謝。如圖4所示，分別取發(fā)酵結(jié)束時，ORP調(diào)控至-150 mV（K. marxianus1727-5-ORP-150）、-170 mV（K. marxianus1727-5-ORP-170）條件下的菌體，以及出發(fā)菌K.marxianus1727-5，進(jìn)行梯度稀釋后，在含有多種較高濃度水解液抑制物存在下的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，可發(fā)現(xiàn)-150 mV條件的細(xì)胞生長狀況優(yōu)于其他菌株，說明其多種抑制物耐受能力比其他菌株強(qiáng)，這也進(jìn)一步證實(shí)了在合適通氣條件下，通氣總量與細(xì)胞抑制物耐受性之間的正向關(guān)系。

圖3 ORP調(diào)控下的葡萄糖和木糖共發(fā)酵Fig.3 Effect of ORP regulation on fermentation using glucose and xylose as carbon source

圖4 多種木質(zhì)纖維素水解抑制物存在條件下K. marxianus 1727-5、1727-5-ORP-150和1727-5-ORP-170的細(xì)胞生長狀況Fig.4 Growth testing of K. marxianus 1727-5,1727-5-ORP-150 and 1727-5-ORP-170 in presence of multiple lignocellulose-derived inhibitors

2.3.2 葡萄糖、木糖消耗及產(chǎn)物生成 ORP調(diào)控策略下對K. marxianus1727-5的葡萄糖與木糖共發(fā)酵性能的改善也是顯而易見的。-200、-170、-150、-110 mV條件下葡萄糖耗完時間從對照組的22 h分別縮短至20、16、16、14 h。但乙醇產(chǎn)量基本隨ORP值的升高，通氣量的增加有所減少。由表1可見，ORP調(diào)控至-110 mV水平下，其產(chǎn)量已有明顯下降，乙醇得率僅0.36 g·g-1。主要原因可能是需大量通氣進(jìn)行ORP調(diào)控，因此通氣速率過大，氣體夾帶損失。

由表1也可知，同ORP的預(yù)設(shè)值相偶聯(lián)的通氣量與木糖消耗基本呈正相關(guān)，發(fā)酵至132 h，其殘余木糖濃度分別由未調(diào)控對照27.06 g·L-1降至21.51、23.18、14.21、8.83 g·L-1。木糖醇得率與之也有類似關(guān)系，在-200、-170、-150 mV條件下，其得率依次遞增，在-150 mV達(dá)到最高0.40 g·g-1，但-110 mV條件下木糖醇得率降至0.34 g·g-1，這是由于碳通量由產(chǎn)物流向了細(xì)胞生長所致。而-200 mV的木糖醇得率明顯低于其他條件，主要是因?yàn)槠渫庹{(diào)控主要集中在葡萄糖發(fā)酵階段，發(fā)酵后期通氣量不到總通氣量的10%。由圖3也可知其與對照組一樣糖利用基本停滯，調(diào)控主要是促進(jìn)前期葡萄糖和木糖的利用，而此階段的木糖的碳代謝主要流向細(xì)胞生長，較少流向產(chǎn)物木糖醇。此外，也可發(fā)現(xiàn)ORP調(diào)控至-170 mV條件下，以葡萄糖發(fā)酵為主的前期階段與-150 mV條件下的細(xì)胞生長和葡萄糖消耗狀況相似，而后期發(fā)酵階段木糖消耗與-200 mV條件類似。這也是因?yàn)槠渫庹{(diào)控主要集中在葡萄糖發(fā)酵階段，且通氣總量較大，因此葡萄糖發(fā)酵性能改善明顯，而后期基本未進(jìn)行調(diào)控，通氣量相對少，細(xì)胞活性低，木糖代謝不足以維持細(xì)胞生長，其生物量濃度的大幅下降驗(yàn)證了這一點(diǎn)。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，ORP調(diào)控至-150 mV對于K. marxianus1727-5在多種抑制物存在條件下的葡萄糖與木糖共發(fā)酵可能是一個較合適的水平。不僅葡萄糖發(fā)酵時間明顯縮短，木糖殘余濃度顯著降低，并且其乙醇和木糖醇得率都相對較高。而其通氣量僅為-110 mV控制條件下的一半，這不僅大大降低了染菌風(fēng)險，也大大減少了生產(chǎn)成本。

2.4 ORP調(diào)控對馬克斯克魯維酵母在玉米秸稈水解液中發(fā)酵的影響

未經(jīng)脫毒的玉米秸稈水解液，經(jīng)HPLC檢測甲酸、乙酸、糠醛、5-HMF濃度分別為 0.9±0.18、1.95±0.25、0.5±0.12、0.26±0.05 g·L-1；葡萄糖為23.5±0.3 g·L-1，木糖為 14.9±0.6 g·L-1。以此水解液為底物，研究了K. marxianus1727-5的發(fā)酵情況。由于在不通氣的情況下，ORP處于-100～-130 mV，因此根據(jù)前面的研究結(jié)果，將 ORP控制在-100 mV。由圖5可知，相比于未通氣對照組9 h耗完葡萄糖，ORP調(diào)控至-100 mV條件下，7 h即結(jié)束，其乙醇得率分別為0.45和0.44 g·g-1。木糖利用方面，未通氣條件下同樣出現(xiàn)了葡萄糖耗完后木糖消耗停滯的現(xiàn)象。但在-100 mV ORP調(diào)控下，未出現(xiàn)此種狀況，其消耗木糖由對照組的 4.88 g·L-1增至10.27 g·L-1、而木糖醇得率由 0.20 g·g-1提高至 0.48 g·g-1，且其通氣總量僅為31.5 L。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本與模擬物料發(fā)酵結(jié)果一致，即在一定范圍內(nèi)，通氣量越大，細(xì)胞活性越高，木糖、葡萄糖代謝速率越快。表明ORP調(diào)控策略也同樣有效緩解玉米秸稈水解液中較高濃度的多種抑制物混合物對細(xì)胞的脅迫，改善了其發(fā)酵性能，且能耗投入少，具有一定的工業(yè)應(yīng)用前景。

此外，發(fā)現(xiàn)利用玉米秸稈水解液發(fā)酵與合成培養(yǎng)基相比，其發(fā)酵效率明顯降低，推測是由于除糠醛、5-HMF等抑制物外，玉米秸稈水解液中還含有大量其他化合物，如不溶性的酚類化合物等造成[29-30]。

圖5 ORP調(diào)控至-100 mV條件下未脫毒的玉米秸稈水解液發(fā)酵Fig.5 Effect of controlled ORP at -100 mV on fermentation by K. marxianus 1727-5 from non-detoxifed cornstraw hydrolysate

3 結(jié) 論

采用通氣控制 ORP的方式，研究了K.marxianus1727-5在多種抑制物存在條件下的葡萄糖、木糖發(fā)酵性能以及未脫毒玉米秸稈水解液中的發(fā)酵情況，結(jié)論如下。

（1）木糖發(fā)酵過程中 ORP與細(xì)胞生長、木糖消耗關(guān)系密切，且ORP調(diào)控下多種抑制物對酵母生長代謝造成的嚴(yán)重影響得以有效改善?；沮厔菔穷A(yù)設(shè)ORP值越高，通氣量越大，細(xì)胞活性也高，細(xì)胞生長快，木糖代謝速率及木糖醇得率高。

（2）葡萄糖發(fā)酵與木糖發(fā)酵呈現(xiàn)相似的趨勢，隨預(yù)設(shè)ORP值升高，生物量濃度增加，發(fā)酵時間顯著縮短，但3種條件下（未調(diào)控對照組、-150、-120 mV）的乙醇得率幾乎無差異，未出現(xiàn)隨ORP增加，乙醇得率下降的現(xiàn)象。此外，隨ORP增加甘油產(chǎn)量呈現(xiàn)減少趨勢，這也表明利用ORP控制通氣，可有效改善抑制物對細(xì)胞生長代謝的不利影響。

（3）ORP調(diào)控策略下，葡萄糖與木糖共發(fā)酵性能得到改善。葡萄糖發(fā)酵時間縮短，木糖利用率增加，緩解脅迫壓力，提高細(xì)胞活性。葡萄糖與木糖共發(fā)酵而言，ORP調(diào)控至-150 mV是一個較合適的水平。

（4）ORP調(diào)控至-100 mV有效緩解了玉米秸稈水解液中較高濃度的多種抑制物對細(xì)胞的脅迫，改善了其發(fā)酵性能。

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date:2017-05-08.

YUAN Wenjie, ywj@dlut.edu.cn

supported by the International Cooperation and Exchanges NSFC (51561145014).

Effect of ORP regulation on fermentation byKluyveromyces marxianusfrom lignocellulosic hydrolysates

FENG Hualiang, GAO Jiaoqi, HOU Shengbo, LI Yimin, YUAN Wenjie
(School of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian116024,Liaoning,China)

The effect of ORP regulation on batch fermentation byKluyveromyces marxianus1727-5 was investigated using glucose, xylose and glucose/xylose mixture under stress conditions caused by mixture of acetic acid, formic acid, furfural and 5-HMF. Moreover, batch fermentation from corn stalk hydrolysate was further conducted with the optimized ORP control strategy. The experimental results showed that the stress tolerance of cells to multiple inhibitors above was significantly improved together with enhanced cellular metabolic activities involved in both glucose and xylose utilization. For the fermentation from glucose/xylose mixture, the significant improvements were also achieved with respects to xylose utilization under ORP control conditions. Especially,with ORP controlled at -150 mV, the glucose fermentation time was shortened about 30% with the same ethanol.The yields of xylitol was increased from 3 g·L-1to 10 g·L-1compared to the control without ORP regulation.More important, when the ORP controlled at -100 mV, fermentation from corn stalk hydrolysate was greatly facilitated in terms of inhibitors tolerance, and the glucose fermentation time was shortened about 22% with the same ethanol. More important, xylose utilization and xylitol yield were increased to 10.27 g·L-1and 0.48 g·g-1,respectively, compared to those of 4.88 g·L-1and 0.20 g·g-1in the control without ORP regulation.

aeration; ORP; lignocellulose; inhibitor; fermentation

Q 815

A

0438—1157（2017）11—4279—09

10.11949/j.issn.0438-1157.20170571

2017-05-08收到初稿，2017-07-25收到修改稿。

聯(lián)系人：袁文杰。

馮華良（1991—），男，碩士研究生。

中泰農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及加工廢棄物生產(chǎn)燃料乙醇基礎(chǔ)研究和關(guān)鍵技術(shù)（51561145014）。