• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    HSF1對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用及其相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選*

    2017-11-22 03:15:58王桂良陳廣文王小莉張華莉王慷慨劉梅冬肖獻(xiàn)忠
    中國病理生理雜志 2017年11期
    關(guān)鍵詞:中總基因芯片誘導(dǎo)

    肖 歸, 王桂良, 陳廣文, 王小莉, 張華莉, 王慷慨, 劉梅冬, 劉 可, 肖獻(xiàn)忠△

    (1中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系, 湖南 長沙 410008; 2海南醫(yī)學(xué)院國際護(hù)理學(xué)院, 海南 海口 571199; 3贛南醫(yī)學(xué)院附屬萍鄉(xiāng)醫(yī)院消化內(nèi)科, 江西 萍鄉(xiāng) 337000)

    ·短篇論著·

    HSF1對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用及其相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選*

    肖 歸1,2, 王桂良3△, 陳廣文1, 王小莉1, 張華莉1, 王慷慨1, 劉梅冬1, 劉 可1, 肖獻(xiàn)忠1△

    (1中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系, 湖南 長沙 410008;2海南醫(yī)學(xué)院國際護(hù)理學(xué)院, 海南 ???571199;3贛南醫(yī)學(xué)院附屬萍鄉(xiāng)醫(yī)院消化內(nèi)科, 江西 萍鄉(xiāng) 337000)

    目的探討熱休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)減輕脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的作用及其分子機(jī)制。方法采用氣管滴注LPS的方法制備小鼠急性肺損傷模型,觀察HSF1野生型小鼠(HSF1+/+)和HSF1敲除小鼠(HSF1-/-)肺大體改變和肺組織病理改變,檢測支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中總蛋白、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6的蛋白表達(dá)。 采用基因芯片技術(shù)篩選經(jīng)LPS處理后的HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺組織中的差異表達(dá)基因,并進(jìn)一步采用real-time PCR對(duì)CXC趨化因子受體2(CXC chemokine receptor 2,CXCR2)的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果與經(jīng)LPS刺激后的HSF1+/+小鼠相比,經(jīng)LPS刺激的HSF1-/-小鼠肺大體和病理損傷加重,BALF中總蛋白、VEGF、TNF-α、IL-1β和IL-6的含量升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 基因芯片分析發(fā)現(xiàn),與經(jīng)LPS處理的HSF1+/+小鼠相比,HSF1-/-小鼠共篩選出918個(gè)差異基因,有65個(gè)基因表達(dá)差異明顯,其中Atg7、ccr1、cxcr2、Tbl1xr1、Mmp9、Pparg、Plcb2、Arrb2、Cntn1、Col4a6等共 28個(gè)基因在HSF1-/-小鼠的肺組織中表達(dá)明顯上調(diào);Fgfr1、Fgfr2、Map4k4、Ddx58、Tfg、Stat3、Smad4、Lamc1、Sdc3等共37個(gè)基因表達(dá)明顯下調(diào)。 Real-time PCR結(jié)果顯示,CXCR2的mRNA水平在LPS刺激的HSF1-/-小鼠肺組織較HSF1+/+小鼠表達(dá)明顯上調(diào),表達(dá)趨勢與基因芯片結(jié)果一致。結(jié)論HSF1能減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷,CXCR2可能參與了對(duì)肺組織的保護(hù)作用。

    急性肺損傷; 熱休克因子1; 基因芯片; 差異基因表達(dá)

    急性肺損傷(acute lung injury,ALI)指由各種非心源性因素造成肺部炎癥和通透性增加的綜合征,主要表現(xiàn)為肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及肺泡上皮細(xì)胞損傷和急性進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭[1],主要病因?yàn)楦腥?、膠原血管疾病、藥物攝入、吸入有害物質(zhì)、休克、急性嗜酸性肺炎、免疫介導(dǎo)的肺出血和血管炎及放射性肺炎等。ALI發(fā)病率和病死率極高且各種治療方法效果不理想,因此在臨床治療和基礎(chǔ)研究中都引起了高度的重視[2-3]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的主要成分,采用氣管滴注LPS的方式可用來制備ALI模型[4]。

    當(dāng)生物體遭受感染、毒物、高溫、自由基等應(yīng)激原作用時(shí),機(jī)體會(huì)出現(xiàn)熱休克反應(yīng)(heat shock response,HSR)[5]。HSR受轉(zhuǎn)錄因子家族精細(xì)調(diào)控,熱休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)是其中最重要的轉(zhuǎn)錄因子。本科室在前期研究中也發(fā)現(xiàn),HSF1-/-小鼠對(duì)LPS的敏感性顯著增強(qiáng),HSF1對(duì)LPS所致的內(nèi)毒素血癥具有明顯的抑制作用[6],但是HSF1對(duì)ALI是否具有抑制作用以及具體機(jī)制目前尚不明確。

    基因芯片可通過探針分子與樣品分子雜交,檢測雜交信號(hào)的強(qiáng)弱從而獲得樣品分子的數(shù)量和序列信息,具有高效率和便捷的優(yōu)點(diǎn)[7]。本研究以HSF1+/+小鼠和HSF1-/-小鼠為研究動(dòng)物,經(jīng)氣管滴注LPS制備ALI模型,分析HSF1對(duì)ALI的保護(hù)作用,并采用基因芯片技術(shù)篩選HSF1+/+小鼠和HSF1-/-小鼠ALI模型中肺組織基因表達(dá)譜的差異,探索HSF1在LPS誘導(dǎo)的ALI中起保護(hù)作用的潛在分子機(jī)制。

    材 料 和 方 法

    1動(dòng)物

    SPF級(jí)HSF1-/-和HSF1+/+小鼠,由美國德克薩斯大學(xué)西南研究中心Ivor J. Benjamin惠贈(zèng),喂養(yǎng)在中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,由專人負(fù)責(zé)小鼠基因型檢測,獲取雄性HSF1-/-和HSF1+/+小鼠,2~3月齡,25 g左右。將小鼠分為HSF1+/++生理鹽水(NS)組、HSF1+/++LPS組、HSF1-/-+NS組以及HSF1-/-+LPS組,其中,HSF1+/++LPS組和HSF1-/-+LPS組按照5 mg/kg的劑量從氣管滴注LPS(濃度0.8 g/L),而HSF1+/++NS組和HSF1-/-+NS組從氣管滴注同等體積的NS。

    2主要試劑

    LPS購于Sigma;BCA蛋白定量試劑盒和4%多聚甲醛購于北京鼎國生物公司;血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6的ELISA試劑盒購買自欣博盛生物科技公司;Trizol試劑購于Invitrogen;PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及Taq聚合酶均購自TaKaRa;GeneChip? Mouse Transcriptome Assay 1.0為Affymetrix產(chǎn)品(含23 000個(gè)基因)。

    3主要方法

    3.1小鼠急性肺損傷模型的建立 用1.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉小鼠,暴露小鼠氣管后,用1 mL注射器緩慢滴加LPS(5 mg/kg, 濃度為0.8 g/L)入氣管內(nèi),豎立起小鼠,旋轉(zhuǎn),使LPS分布均勻,對(duì)照組給予NS氣管內(nèi)滴注。

    3.2觀察小鼠肺大體變化情況 造模6 h后處死小鼠,取出肺組織,用濾紙吸去表面血漬,肉眼觀察不同組小鼠肺組織的大小、顏色、形狀等指標(biāo)。

    3.3小鼠肺組織病理變化的觀察 小鼠肺組織取材后,使用4%多聚甲醛固定24 h,經(jīng)石蠟包埋后做成10 μm切片,切片使用二甲苯脫蠟后,經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗環(huán)節(jié),HE染色5~15 min,常規(guī)清洗、脫水、封片,置于光學(xué)顯微鏡觀察肺部組織學(xué)改變,顯微鏡下隨機(jī)選擇3~5個(gè)視野,于200倍和400倍拍照,不同染色相同視野采用Adobe Photoshop CS6軟件疊加合成。

    3.4ELISA法測定小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中細(xì)胞因子的含量 暴露小鼠氣管,用1 mL注射器抽1 mL PBS緩慢注入支氣管,用手指輕輕振蕩小鼠胸廓1 min,然后回抽液體,保存在EP管中,1 500 r/min離心5 min,上清用于BCA蛋白定量和VEGF、TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白含量檢測。

    3.5肺組織 RNA 的提取 用Trizol試劑抽提小鼠肺組織的總RNA,用DNA酶消化除去總RNA中的DNA, 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA,紫外分光光度計(jì)測量A260/A280比值。

    3.6基因芯片檢測 在PCR管配制總RNA變性反應(yīng)體系,變性反應(yīng)結(jié)束后配制cDNA第一鏈合成反應(yīng)體系,體系內(nèi)含Cy3/Cy5熒光標(biāo)記。取出經(jīng)定量的Cy3和Cy5標(biāo)記的探針,混合于PCR管內(nèi),加入雜交緩沖液和甲酰胺。將雜交芯片水平放入加有PBS的雜交盒,置42 ℃雜交箱中避光雜交,結(jié)束后,將芯片盒用Affymetrix 掃描儀掃描獲取圖像并導(dǎo)入圖像分析軟件,采用 GeneChip Scanner 3000 對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行掃描,用 Command Console Softeware 4.0 讀取原始數(shù)據(jù),采用 Expression Console對(duì)合格數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。使用GeneSpring和Cluster分析軟件進(jìn)行聚類分析,用Pathway進(jìn)行基因信號(hào)通路分析。

    3.7Real-time PCR的驗(yàn)證 采用Real-time PCR的方法對(duì)在HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺組織中表達(dá)有差異的關(guān)鍵基因CXCR2進(jìn)一步驗(yàn)證。檢測基因引物序列由金斯瑞公司設(shè)計(jì)合成,CXCR2上游引物為5’-TCTGCCACAAAAGCGTCTA-3’,下游引物為5’-GAGTGGCATGGGTTAGTTGG-3’;以β-actin 作為內(nèi)參照,上游引物為5’-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3’,下游引物為5’-CAGGAGGAGCAATGATCTT-3’。配制20 μL的反應(yīng)體系:上游引物 0.5 μL,下游引物 0.5 μL,SYBR Enzyme 10 μL,cDNA 1 μL,無酶水8 μL。反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性10 min, 95 ℃變性30 s, 60 ℃延伸1 min,40 個(gè)循環(huán)。

    4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩組樣本之間比較選用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1HSF1減輕LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺大體損傷

    未經(jīng)LPS刺激的HSF1+/+和HSF1-/-小鼠中,肺大體標(biāo)本無明顯損害,經(jīng)LPS刺激后,HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺體積變大,水腫明顯,且顏色明顯變黑,HSF1-/-組的肺組織病變損傷程度明顯重于HSF1+/+組,見圖1。

    2HSF1減輕LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織病理學(xué)損傷

    Figure 1. Macroscopic changes of the lung tissue ofHSF1-/-andHSF1+/+mice with ALI induced by LPS. A:HSF1+/++NS group; B:HSF1+/++LPS group; C:HSF1-/-+NS group; D:HSF1-/-+LPS group.

    圖1LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷HSF1-/-小鼠和HSF1+/+小鼠肺大體標(biāo)本觀察

    未經(jīng)LPS刺激的HSF1+/+和HSF1-/-小鼠中,肺組織切片均未見明顯異常,經(jīng)LPS刺激后,HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺泡壁毛細(xì)血管充血明顯,細(xì)支氣管腔內(nèi)存在大量脫落炎性細(xì)胞及滲出物,肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)可見大量紅細(xì)胞和多形核白細(xì)胞浸潤,并伴有血栓形成,HSF1-/-組小鼠較HSF1+/+小鼠肺組織的損傷明顯加重,見圖2。

    Figure 2. Pathological changes of the lung tissue ofHSF1-/-andHSF1+/+mice with ALI induced by LPS (HE staining, ×40). A:HSF1+/++NS group; B:HSF1+/++LPS group; C:HSF1-/-+NS group; D:HSF1-/-+LPS group.

    圖2LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷HSF1-/-小鼠和HSF1+/+小鼠肺組織病理觀察

    3HSF1降低LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠BALF中蛋白總量和VEGF濃度

    未經(jīng)LPS刺激的HSF1+/+和HSF1-/-小鼠中,肺組織中總蛋白和VEGF表達(dá)均較低,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;經(jīng)LPS刺激后,HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺組織中總蛋白和VEGF表達(dá)均顯著升高,HSF1-/-組比與HSF1+/+組更高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

    Figure 3. The changes of the concentrations of total protein and VEGF in BALF ofHSF1-/-andHSF1+/+mice with ALI induced by LPS. Mean±SD.n=6.##P<0.01vsHSF1+/++NS group;△△P<0.01vsHSF1-/-+ NS group.*P<0.05,**P<0.01vsHSF1+/++LPS group.

    圖3LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷HSF1-/-小鼠和HSF1+/+小鼠BALF中總蛋白和VEGF濃度的變化

    4HSF1降低LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6濃度

    ELISA結(jié)果顯示,未經(jīng)LPS刺激的HSF1+/+和HSF1-/-小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表達(dá)均較低,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;經(jīng)LPS刺激后,HSF1+/+和HSF1-/-小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子的蛋白表達(dá)均顯著升高,HSF1-/-組比與HSF1+/+組更高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

    Figure 4. The concentrations of inflammatory factors in the BALF ofHSF1-/-andHSF1+/+mice with LPS-induced ALI. Mean±SD.n=6.#P<0.05,##P<0.01vsHSF1+/++NS group;△P<0.05,△△P<0.01vsHSF1-/-+NS group;*P<0.05,**P<0.01vsHSF1+/++LPS group.

    圖4LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷HSF1-/-小鼠和HSF1+/+小鼠BALF中炎癥因子濃度的變化

    5芯片結(jié)果的聚類分析

    基因進(jìn)行聚類分析顯示發(fā)現(xiàn):與HSF1+/+小鼠相比,HSF1-/-小鼠一共篩選到918個(gè)差異基因,其中有188個(gè)基因表達(dá)下調(diào),730個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。

    6芯片結(jié)果的信號(hào)通路分析

    與HSF1+/+小鼠相比,HSF1-/-小鼠肺組織中65個(gè)信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)具有顯著差異,有28個(gè)基因表達(dá)水平上調(diào),有37個(gè)基因表達(dá)水平下調(diào)。GO 信息分析顯示上述差異基因主要與代謝調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥因子分泌調(diào)控、趨化因子調(diào)控、蛋白修飾、自身免疫性疾病等密切相關(guān)。

    7Real-timePCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    研究證明,CXCR2與ALI密切相關(guān),因此我們選定CXCR2來進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,未經(jīng)LPS刺激的HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺組織中CXCR2的mRNA表達(dá)均較低,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;經(jīng)LPS刺激后,HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺組織CXCR2的mRNA表達(dá)均顯著升高,HSF1-/-組比與HSF1+/+組更高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),變化趨勢與基因芯片結(jié)果一致,見圖5。

    Figure 5. The mRNA level of CXCR2 in the lung tissue ofHSF1-/-andHSF1+/+mice with LPS-induced ALI. Mean±SD.n=6.##P<0.01vsHSF1+/++NS group;△△P<0.01vsHSF1-/-+NS group;*P<0.05vsHSF1+/++LPS group.

    圖5LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷HSF1-/-小鼠和HSF1+/+小鼠肺組織中CXCR2的mRNA表達(dá)

    討 論

    ALI的臨床表現(xiàn)主要為進(jìn)行性呼吸窘迫綜合征和低氧血癥,它發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,炎癥反應(yīng)是其重要的機(jī)制之一[8-9]。眾多研究證明,ALI的嚴(yán)重程度與中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化的程度以及遷移到肺泡的數(shù)目密切相關(guān),活化的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞能夠產(chǎn)生許多細(xì)胞毒性物質(zhì),包括顆粒酶、活性氧、活性脂、各種促炎細(xì)胞因子和中性粒細(xì)胞胞外陷阱,它們通過網(wǎng)織形成陷阱捕獲細(xì)胞外的病原體,這對(duì)于ALI發(fā)展至關(guān)重要[10-12]。

    眾多研究證明,HSF1是必不可少的熱休克基因,HSF1-/-動(dòng)物的細(xì)胞在遭受高溫等刺激時(shí),相比于野生型動(dòng)物更容易凋亡,這證明了HSF1能夠提高細(xì)胞的存活率[13]。HSF1能夠提高存活率這一現(xiàn)象在很多動(dòng)物中也有證實(shí)。本科室在前期研究中也發(fā)現(xiàn),HSF1-/-小鼠對(duì)LPS的敏感性顯著增強(qiáng),并且其生存率顯著降低,且HSF1能夠有效減少內(nèi)毒素血癥中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達(dá)水平,這些結(jié)果表明,HSF1對(duì)LPS所導(dǎo)致的內(nèi)毒素血癥具有明顯的抑制作用[14-15]。但是HSF1對(duì)ALI小鼠是否具有保護(hù)作用以及具體機(jī)制目前尚不明確。本研究結(jié)果顯示, 未經(jīng)LPS刺激的HSF1+/+和HSF1-/-小鼠中, 肺組織的大體標(biāo)本和病理無明顯異常,肺組織中總蛋白、VEGF、TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表達(dá)均較低且無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;經(jīng)LPS刺激后,HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺組織的大體標(biāo)本和病理標(biāo)本出現(xiàn)損傷、肺組織中總蛋白、VEGF、TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子的蛋白表達(dá)均顯著升高;HSF1-/-+LPS組與HSF1+/++LPS組小鼠相比,肺組織的損傷更重,肺組織中總蛋白、VEGF、TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子的蛋白進(jìn)一步升高,以上結(jié)果表明LPS能誘導(dǎo)小鼠ALI,在非刺激的狀態(tài)下,HSF1對(duì)HSF1肺組織中總蛋白、VEGF、TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子的表達(dá)不起調(diào)節(jié)作用,經(jīng)LPS刺激后,HSF1能減輕LPS所致的ALI小鼠血管通透程度,抑制肺組織中總蛋白、VEGF、TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子的表達(dá)從而減輕肺部的損傷情況。

    為了進(jìn)一步了解HSF1對(duì)ALI的炎癥相關(guān)基因的調(diào)控,本研究采用基因芯片技術(shù),篩選出了LPS刺激的HSF1-/-小鼠中918個(gè)差異基因,其中Atg7、ccr1、cxcr2、Tbl1xr1、Mmp9、Pparg、Plcb2、Arrb2、Cntn1、Col4a6等共 28個(gè)基因明顯上調(diào),F(xiàn)gfr1、Fgfr2、Map4k4、Ddx58、Tfg、Stat3、Smad4、Lamc1、Sdc3等共37個(gè)基因明顯下調(diào),這些表達(dá)差異明顯的基因主要與代謝調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞因子分泌、炎癥應(yīng)答、趨化蛋白調(diào)控、自身免疫反應(yīng)等分子生物學(xué)過程相關(guān)。通過查閱文獻(xiàn)[16-17],我們最終選定CXCR2來鑒定。CXCR2是趨化中性粒細(xì)胞的主要趨化因子受體之一,主要通過和IL-8(CXCL8)等趨化因子結(jié)合后產(chǎn)生效應(yīng),其主要功能是能夠趨化中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞到損傷部位,參與機(jī)體的防御反應(yīng)或者中性粒細(xì)胞的大量增加從而產(chǎn)生更為廣泛的組織損傷。CXCR2是一個(gè)與ALI密切相關(guān)的基因,但目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道HSF1與 CXCR2 在調(diào)控 LPS誘導(dǎo)的ALI中的作用。本研究通過基因芯片技術(shù)和 real-time PCR結(jié)果顯示未經(jīng)LPS刺激的HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺組織中CXCR2 mRNA表達(dá)均較低且無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;經(jīng)LPS刺激后,HSF1+/+和HSF1-/-小鼠肺組織CXCR2 mRNA表達(dá)均顯著升高,HSF1-/-組比與HSF1+/+組更高,說明HSF1對(duì) LPS 誘導(dǎo)的ALI炎癥保護(hù)機(jī)制可能是通過下調(diào)CXCR2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,但HSF1是否通過與CXCR2的啟動(dòng)子區(qū)直接結(jié)合而調(diào)控其表達(dá),是否和其它轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控其表達(dá)等問題,尚需進(jìn)一步研究。

    總之,本研究證明了HSF1對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠具有保護(hù)作用, CXCR2可能參與了對(duì)肺組織的保護(hù)作用,這對(duì)進(jìn)一步揭示 ALI/ARDS 的潛在防治靶點(diǎn)有著重要意義。

    [1] Restrepo MI, Chalmers JD, Song Y, et al. Year in review 2016: Respiratory infections, acute respiratory distress syndrome, pleural diseases, lung cancer and interventional pulmonology[J]. Respirology, 2017, 22(3):602-611.

    [2] ARDS Definition Task Force, Ranieri VM, Rubenfeld GD, et al. Acute respiratory distress syndrome: the Berlin Definition[J]. JAMA, 2012, 307(23):26-33.

    [3] Zochios V, Parhar K, Tunnicliffe W, et al. The right ventricle in ARDS[J]. Chest, 2017, 152(1):181-193.

    [4] Driscoll KE, Costa DL, Hatch G, et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations[J]. Toxicol Sci, 2000, 55(1):24-35.

    [5] Dokladny K, Myers OB, Moseley PL. Heat shock response and autophagy-cooperation and control[J]. Autophagy, 2015, 11(2):200-213.

    [6] 陳淑華. HSF1對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠多器官損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制[D]. 長沙: 中南大學(xué), 2012.

    [7] Marshall A, Hodgson J. DNA chips: an array of possibilities[J]. Nat Biotechnol, 1998, 16(1):27-31.

    [8] 姜遠(yuǎn)旭, 徐世元, 張雪萍, 等. 右美托咪定聯(lián)合烏司他丁減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(1):96-101.

    [9] Shen H, Wu N, Wang Y, et al. Chloroquine attenuates paraquat-induced lung injury in mice by altering inflammation, oxidative stress and fibrosis[J]. Int Immunopharmacol, 2017, 46:16-22.

    [10] Slater TW, Finkielsztein A, Mascarenhas LA, et al. Neutrophil microparticles deliver active myeloperoxidase to injured mucosa to inhibit epithelial wound healing[J]. J Immunol, 2017, 198(7):2886-2897.

    [11] Gerin F, Sener U, Erman H, et al. The effects of quercetin on acute lung injury and biomarkers of inflammation and oxidative stress in the rat model of sepsis[J]. Inflammation, 2016, 39(2):700-705.

    [12] 高 陽, 劉 斌, 哈尼再爾·熱合曼, 等. 黑木耳多糖對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織的保護(hù)作用[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(9): 1704-1708, 1714.

    [13] Verghese J, Abrams J, Wang Y, et al. Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomycescerevisiae) as a model system[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2012, 76(2):115-158.

    [14] Chen S, Zuo X, Yang M, et al. Severe multiple organ injury in HSF1 knockout mice induced by lipopolysaccharide is associated with an increase in neutrophil infiltration and surface expression of adhesion molecules[J]. J Leukoc Biol, 2012, 92(4):851-857.

    [15] Xiao X, Zuo X, Davis AA, et al. HSF1 is required for extra-embryonic development, postnatal growth and protection during inflammatory responses in mice[J]. EMBO J, 1999, 18(21):5943-5952.

    [16] Bajrami B, Zhu H, Kwak HJ, et al. G-CSF maintains controlled neutrophil mobilization during acute inflammation by negatively regulating CXCR2 signaling[J]. J Exp Med, 2016, 213(10):1999-2018.

    [17] Hoegl S, Ehrentraut H, Brodsky KS, et al. NK cells regulate CXCR2+neutrophil recruitment during acute lung injury[J]. J Leukoc Biol, 2017, 101(2):471-480.

    (責(zé)任編輯: 盧 萍, 羅 森)

    Protective effect of HSF1 on mice with LPS-induced acute lung injury and screening of relevant differentially-expressed genes

    XIAO Gui1, 2, WANG Gui-liang3, CHEN Guang-wen1, WANG Xiao-li1, ZHANG Hua-li1, WANG Kang-kai1, LIU Mei-dong1, LIU Ke1, XIAO Xian-zhong1

    (1DepartmentofPathophysiology,XiangyaSchoolofMedicine,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China;2DepartmentofInternationalSchoolofNursing,HainanMedicalUniversity,Haikou571199,China;3DigestionDepartmentofGannanMedicalUniversityPingxiangHospital,Pingxiang337000,China.E-mail:xiaoxianzhongcsu@163.com;gui-liangwang@126.com)

    AIM: To study the protective effect of heat shock factor1 (HSF1) on the mice with lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI), and to screen the relevant differentially-expressed genes.METHODSALI mouse model was established by LPS intracheal instillation. The macroscopic and pathological changes of the lung tissue were observed, and the concentrations of total protein, TNF-α, IL-β, IL-6 and VEGF in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were analyzed. Differentially-expressed genes in the lung tissues ofHSF1+/+mice andHSF1-/-mice with ALI induced by LPS were screened by gene chips. The key gene was verified by real-time qPCR.RESULTSThe macroscopic and pathological changes of the lung injury inHSF1-/-+LPS mice were more serious than those inHSF1+/++LPS mice. The concentrations of total protein, VEGF, TNF-α, IL-1β and IL-6 in the BALF ofHSF1-/-+LPS mice were significantly higher than those ofHSF1+/++LPS mice (P<0.05). Compared with theHSF1+/+mice, a total of 918 differentially-expressed genes were indentified in theHSF1-/-mice, among which the expression levels of 65 genes had obvious diffe-rence, with 28 genes up-regulated, includingAtg7,ccr1,cxcr2,Tbl1xr1,Mmp9,Pparg,Plcb2,Arrb2,Cntn1,Col4a6, etc, and 37 genes down-regulated, includingFgfr1,Fgfr2,Map4k4,Ddx58,Tfg,Stat3,Smad4,Lamc1,Sdc3, etc. The results of real-time qPCR showed that the mRNA level of CXCR2 inHSF1-/-+ LPS mice was significantly higher than that inHSF1+/++ LPS mice, which was consistent with the results of gene chips.CONCLUSIONHSF1 has protective effect on the mice with LPS-induced ALI. CXCR2 may be involved in the protective effect of HSF1 on this process.

    Acute lung injury; Heat shock factor 1; Gene chips; Differential gene expression

    1000- 4718(2017)11- 2073- 06

    2017- 04- 17

    2017- 06- 20

    國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81360080;No. 81671895)

    △通訊作者 肖獻(xiàn)忠 Tel: 13873102115; E-mail: xiaoxianzhongcsu@163.com; 王桂良 Tel: 15879456496; E-mail: guiliangwang@126.com

    R363; R563

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.024

    猜你喜歡
    中總基因芯片誘導(dǎo)
    齊次核誘導(dǎo)的p進(jìn)制積分算子及其應(yīng)用
    出生時(shí)即可預(yù)判發(fā)育潛力 基因芯片精準(zhǔn)篩選肉牛良種
    同角三角函數(shù)關(guān)系及誘導(dǎo)公式
    續(xù)斷水提液誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的凋亡
    中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:52
    天冬中總氨基酸及多糖的提取工藝研究
    大型誘導(dǎo)標(biāo)在隧道夜間照明中的應(yīng)用
    雙管單色熒光PCR法與基因芯片法檢測CYP2C19基因多態(tài)性的比較研究
    應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測四種結(jié)核藥物敏感試驗(yàn)的研究
    基于提升小波的基因芯片數(shù)據(jù)的分類預(yù)測
    正交試驗(yàn)法優(yōu)化苦豆子總生物堿的超聲提取工藝
    在线观看免费视频日本深夜| 中文亚洲av片在线观看爽 | 国产又爽黄色视频| 久久香蕉国产精品| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 中文字幕色久视频| 精品国产国语对白av| 国产精品综合久久久久久久免费 | 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 高清欧美精品videossex| 亚洲精品在线美女| 在线免费观看的www视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美成狂野欧美在线观看| 欧美精品av麻豆av| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 老熟女久久久| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 精品国内亚洲2022精品成人 | 最近最新中文字幕大全免费视频| 少妇的丰满在线观看| 久久热在线av| 身体一侧抽搐| 国产欧美亚洲国产| 国产极品粉嫩免费观看在线| 成人精品一区二区免费| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 色94色欧美一区二区| 在线观看免费午夜福利视频| 制服人妻中文乱码| 午夜激情av网站| 99re在线观看精品视频| 男女下面插进去视频免费观看| 国产区一区二久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 99国产极品粉嫩在线观看| 在线天堂中文资源库| 制服诱惑二区| 黄色a级毛片大全视频| 一级a爱视频在线免费观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 丝袜美腿诱惑在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 国产亚洲精品久久久久5区| 一进一出抽搐动态| 精品高清国产在线一区| av中文乱码字幕在线| 美女高潮到喷水免费观看| 欧美日韩视频精品一区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 妹子高潮喷水视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 超色免费av| www.熟女人妻精品国产| 亚洲专区国产一区二区| 午夜免费观看网址| 黄片大片在线免费观看| 久久久久久久久免费视频了| 动漫黄色视频在线观看| 人妻一区二区av| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 久久ye,这里只有精品| 97人妻天天添夜夜摸| 一区福利在线观看| 午夜福利在线观看吧| 国产激情久久老熟女| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 丝袜在线中文字幕| 无限看片的www在线观看| 精品国产一区二区久久| 国产精品九九99| videosex国产| 亚洲片人在线观看| 飞空精品影院首页| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 最新美女视频免费是黄的| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲精品自拍成人| 亚洲av熟女| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 成年人免费黄色播放视频| 国产精品.久久久| 午夜福利免费观看在线| 岛国毛片在线播放| 99精品欧美一区二区三区四区| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲,欧美精品.| 精品国产美女av久久久久小说| www.999成人在线观看| 极品教师在线免费播放| 夜夜夜夜夜久久久久| 日韩免费高清中文字幕av| 涩涩av久久男人的天堂| 日韩欧美免费精品| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 麻豆乱淫一区二区| 女性生殖器流出的白浆| 美女 人体艺术 gogo| 午夜日韩欧美国产| 一级a爱片免费观看的视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 中文字幕色久视频| 成年版毛片免费区| 亚洲第一青青草原| 99精品久久久久人妻精品| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲男人天堂网一区| 欧美色视频一区免费| 搡老乐熟女国产| 成人三级做爰电影| 男男h啪啪无遮挡| 飞空精品影院首页| 香蕉丝袜av| 狂野欧美激情性xxxx| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 精品人妻在线不人妻| 1024视频免费在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产成人欧美| 一夜夜www| 亚洲avbb在线观看| 国产99白浆流出| 成人免费观看视频高清| 在线av久久热| 黄网站色视频无遮挡免费观看| www.999成人在线观看| 视频区图区小说| 黄色怎么调成土黄色| 久久久久久人人人人人| 天堂中文最新版在线下载| 夫妻午夜视频| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产亚洲欧美98| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 亚洲国产精品sss在线观看 | 首页视频小说图片口味搜索| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 亚洲视频免费观看视频| 99热国产这里只有精品6| 91九色精品人成在线观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 成人18禁在线播放| 午夜视频精品福利| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲情色 制服丝袜| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 黄频高清免费视频| 国产片内射在线| 黄色 视频免费看| 国产免费现黄频在线看| 一级片'在线观看视频| 少妇 在线观看| 亚洲第一青青草原| 在线av久久热| 久久久久久免费高清国产稀缺| 岛国毛片在线播放| 久久久国产一区二区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 99热网站在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| av有码第一页| 国产精品 欧美亚洲| 丰满饥渴人妻一区二区三| 成年人免费黄色播放视频| 国产成人免费观看mmmm| 9热在线视频观看99| 日韩欧美三级三区| 99久久精品国产亚洲精品| 曰老女人黄片| 美女高潮到喷水免费观看| 国产成人免费观看mmmm| 妹子高潮喷水视频| 一夜夜www| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品久久久久久精品古装| 精品久久久久久久毛片微露脸| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产亚洲av高清不卡| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 性少妇av在线| 亚洲熟女毛片儿| 免费高清在线观看日韩| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲av欧美aⅴ国产| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产又色又爽无遮挡免费看| 人人妻人人澡人人看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 久久精品国产清高在天天线| 两人在一起打扑克的视频| av免费在线观看网站| 一二三四社区在线视频社区8| av片东京热男人的天堂| 亚洲熟女毛片儿| 叶爱在线成人免费视频播放| 精品一区二区三区av网在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 中文欧美无线码| 咕卡用的链子| 国产一卡二卡三卡精品| av片东京热男人的天堂| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品av久久久久免费| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲成人免费av在线播放| 免费看十八禁软件| 99国产精品一区二区三区| 久久中文看片网| 精品无人区乱码1区二区| 9热在线视频观看99| 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美国产精品一级二级三级| 久久国产乱子伦精品免费另类| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 老汉色av国产亚洲站长工具| 午夜久久久在线观看| 老司机靠b影院| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 99在线人妻在线中文字幕 | 亚洲av美国av| 亚洲精品国产一区二区精华液| 少妇粗大呻吟视频| 1024视频免费在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 天堂√8在线中文| 中出人妻视频一区二区| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 热99久久久久精品小说推荐| 国产单亲对白刺激| 自线自在国产av| 最近最新免费中文字幕在线| 午夜91福利影院| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品久久久久久电影网| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 在线观看66精品国产| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| www.精华液| 日本五十路高清| 99re在线观看精品视频| 国产区一区二久久| 亚洲专区中文字幕在线| 制服诱惑二区| 国产视频一区二区在线看| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 免费看a级黄色片| 国产精品成人在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久中文字幕人妻熟女| 真人做人爱边吃奶动态| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日韩欧美在线二视频 | 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 69精品国产乱码久久久| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美日韩乱码在线| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲久久久国产精品| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产高清视频在线播放一区| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲一区中文字幕在线| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 热99久久久久精品小说推荐| 久久午夜亚洲精品久久| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 老司机靠b影院| 一级片免费观看大全| 美国免费a级毛片| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 多毛熟女@视频| 精品亚洲成国产av| 久久这里只有精品19| 激情视频va一区二区三区| 老鸭窝网址在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 黑丝袜美女国产一区| 精品少妇久久久久久888优播| 久久亚洲精品不卡| 久久久国产一区二区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲专区国产一区二区| 久久久久久久久久久久大奶| 欧美日韩av久久| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲精品久久午夜乱码| 老汉色av国产亚洲站长工具| 精品一区二区三区av网在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久ye,这里只有精品| 啦啦啦免费观看视频1| 国产区一区二久久| 午夜免费成人在线视频| av片东京热男人的天堂| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 99久久国产精品久久久| 亚洲专区中文字幕在线| 视频区图区小说| 国产精品久久久久久精品古装| 18在线观看网站| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产精品.久久久| 看免费av毛片| 欧美午夜高清在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久香蕉国产精品| 一级毛片女人18水好多| 天堂√8在线中文| 淫妇啪啪啪对白视频| 黄色女人牲交| 高清在线国产一区| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品免费大片| 久热这里只有精品99| 777米奇影视久久| 十八禁高潮呻吟视频| 一级作爱视频免费观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲精品国产区一区二| 久久精品亚洲av国产电影网| 老汉色∧v一级毛片| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 激情在线观看视频在线高清 | 建设人人有责人人尽责人人享有的| 母亲3免费完整高清在线观看| av不卡在线播放| 久久国产精品大桥未久av| 在线国产一区二区在线| 91成年电影在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲中文日韩欧美视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 香蕉久久夜色| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久久久久久午夜电影 | 精品人妻1区二区| bbb黄色大片| 日本黄色视频三级网站网址 | 亚洲精品在线观看二区| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲 国产 在线| 中文字幕人妻熟女乱码| 纯流量卡能插随身wifi吗| 中文字幕人妻熟女乱码| 日韩免费av在线播放| 视频区图区小说| 亚洲全国av大片| 在线观看日韩欧美| 日本五十路高清| 精品久久久久久电影网| 91成人精品电影| 亚洲成国产人片在线观看| 老熟女久久久| 老司机午夜福利在线观看视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 午夜精品在线福利| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 欧美色视频一区免费| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 99香蕉大伊视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美日韩一级在线毛片| 久久久久久久国产电影| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 好男人电影高清在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 午夜视频精品福利| e午夜精品久久久久久久| 新久久久久国产一级毛片| 操美女的视频在线观看| 国产在线观看jvid| www.熟女人妻精品国产| 国产欧美日韩一区二区三| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 欧美黑人欧美精品刺激| 男男h啪啪无遮挡| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲av成人一区二区三| 午夜亚洲福利在线播放| 下体分泌物呈黄色| 国产精品成人在线| 久久久久久久国产电影| 日本vs欧美在线观看视频| 精品人妻1区二区| 国产亚洲欧美98| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产不卡av网站在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 99热只有精品国产| 亚洲精品久久午夜乱码| 午夜福利免费观看在线| 欧美国产精品va在线观看不卡| 大型av网站在线播放| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 人人妻人人澡人人看| 国产精品影院久久| 欧美丝袜亚洲另类 | 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 99re在线观看精品视频| 日韩欧美在线二视频 | 91在线观看av| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲国产欧美网| 欧美激情高清一区二区三区| 欧美大码av| 天天影视国产精品| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产不卡av网站在线观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲熟妇熟女久久| 美国免费a级毛片| 满18在线观看网站| 欧美成人午夜精品| 午夜精品久久久久久毛片777| 好男人电影高清在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 免费少妇av软件| 大片电影免费在线观看免费| 99热只有精品国产| 在线观看免费高清a一片| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲国产欧美一区二区综合| 身体一侧抽搐| aaaaa片日本免费| 国产不卡一卡二| 欧美国产精品一级二级三级| 老汉色av国产亚洲站长工具| 黑人操中国人逼视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品久久蜜臀av无| 亚洲,欧美精品.| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 久久中文字幕一级| 手机成人av网站| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产精品影院久久| 亚洲精品国产一区二区精华液| 1024香蕉在线观看| 亚洲国产欧美网| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 波多野结衣一区麻豆| 涩涩av久久男人的天堂| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲av美国av| 国产亚洲精品一区二区www | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 在线av久久热| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产精品亚洲一级av第二区| 99香蕉大伊视频| 搡老岳熟女国产| 国产精品一区二区在线不卡| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲国产精品合色在线| 后天国语完整版免费观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产成人啪精品午夜网站| 日韩欧美三级三区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 交换朋友夫妻互换小说| 国产成人欧美| 欧美成人免费av一区二区三区 | av网站在线播放免费| 午夜免费观看网址| 午夜91福利影院| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产高清视频在线播放一区| 老司机午夜福利在线观看视频| 在线免费观看的www视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 91成人精品电影| 色尼玛亚洲综合影院| 天堂√8在线中文| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 人人妻人人澡人人看| 欧美在线黄色| xxxhd国产人妻xxx| 天堂中文最新版在线下载| 精品国产亚洲在线| 国产成人免费观看mmmm| 国产精品免费一区二区三区在线 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲 国产 在线| 校园春色视频在线观看| 国产精品九九99| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 青草久久国产| 中文字幕制服av| 国产男女内射视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 岛国在线观看网站| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产不卡一卡二| 精品国产乱子伦一区二区三区| 男女之事视频高清在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 中文字幕制服av| 欧美中文综合在线视频| av有码第一页| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产色视频综合| 日本五十路高清| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 免费高清在线观看日韩| 一边摸一边做爽爽视频免费| 最新在线观看一区二区三区| 1024香蕉在线观看| 91九色精品人成在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 色在线成人网| 我的亚洲天堂| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 中文字幕制服av| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产亚洲欧美在线一区二区| 九色亚洲精品在线播放| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品国产av在线观看| 亚洲午夜理论影院| 啪啪无遮挡十八禁网站| 韩国精品一区二区三区| 国产精品永久免费网站| 久久中文字幕人妻熟女| 天堂俺去俺来也www色官网| 老司机午夜福利在线观看视频| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲一区中文字幕在线| 久久这里只有精品19| 欧美午夜高清在线| 国产免费男女视频| 91国产中文字幕| videos熟女内射| 在线播放国产精品三级| 欧美激情高清一区二区三区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 人妻久久中文字幕网| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产精品免费视频内射| 免费不卡黄色视频| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 美国免费a级毛片| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲国产看品久久| 啦啦啦在线免费观看视频4| 老鸭窝网址在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品久久久久久久久久免费视频 | 欧美日韩一级在线毛片| 一区二区日韩欧美中文字幕| 丝袜美足系列| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲国产看品久久| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 真人做人爱边吃奶动态| 丝袜人妻中文字幕| 欧美在线黄色| 热re99久久国产66热| 国产色视频综合| 国产淫语在线视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产精华一区二区三区| 国产真人三级小视频在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲五月婷婷丁香| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲午夜理论影院| 久9热在线精品视频| 黄色女人牲交|