具有降膽固醇功能乳酸菌對高血脂癥大鼠血脂的影響

陳大衛(wèi)+李露露+黃玉軍+戴穎+徐永杰

摘 要：研究體外具有降膽固醇功能的乳酸菌在體內(nèi)的輔助降血脂作用。該文利用高脂飼料建立高血脂癥大鼠模型，通過灌胃發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）f5 發(fā)酵液，研究其對高血脂大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C，肝臟TC、TG及糞便TC、TG、TBA的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，飼喂14d高脂飼料顯著提高了大鼠血清TC、TG、LDL-C的水平（P<0.05），HDL-C的水平顯著低于空白對照組（P<0.05），高脂飼料還顯著增加了大鼠的肝指數(shù)及血清、肝臟的TC、TG含量（P<0.05）；28d發(fā)酵乳桿菌f5發(fā)酵液的干預(yù)顯著提高了高血脂大鼠對飼料的利用率（P<0.05），對大鼠肝指數(shù)有顯著的改善作用（P<0.05），同時f5發(fā)酵液組大鼠血清的TC、TG及LDL-C水平顯著低于模型組（P<0.05），肝臟的TC、TG含量顯著降低（P<0.05），糞便中TC、TG及TBA的含量顯著高于模型組（P<0.05）。發(fā)酵乳桿菌f5具有良好的輔助降血脂功能，可作為良好的候選益生菌菌株。

關(guān)鍵詞：降膽固醇；發(fā)酵乳桿菌；降血脂

中圖分類號 TS252.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）21-0016-04

Effect of Lactic Acid Bacteria with Cholesterol Lowering Function on Blood Lipid in Hyperlipidemia Rats

Chen Dawei et al.

（Key Laboratory of Dairy Biological Technology and Safety Control；College of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

Abstract：The effect of lactic acid bacteria with the function of cholesterol lowering in vitro on reducing blood lipid was studied in vivo. The model of hyperlipidemia rats were established by high fat diet，and the regulation of fermentation liquid of Lactobacillus fermentum f5 on the hyperlipidemia rats serum TC，TG，HDL-C，LDL-C，TC，TG of liverand TC，TG，TBA in the fecesby intragastric administration. The results showed that the serum levels of TC，TG，LDL-C were significantly increased by 2 weeks feeding of high fat diet（P<0.05），the level of HDL-C was significantly lower than that of control group（P<0.05）；and liver index，TC，TGcontent of serum and liver were also significantly increased（P<0.05）. The efficiency of feed utilization of model ratswas significantly increased after 4 weeks of feeding fermentation liquid of L. fermentum f5（P<0.05），and the liver index was also significant improvement（P<0.05），and the TC，TG andLDL-C levels in serum of f5 group rats were significantly lower than the model group（P<0.05）. The content of TC，TG in the liver was significantly decreased（P<0.05），the content of TC，TG and TBA in feces was significantly higher than that of model group（P<0.05）. L.fermentum f5 can be used as a good candidate probiotic with the function of hypolipidemic.

Key words：Cholesterol lowering；Lactobacillus fermentum；Hyperlipidemia

高脂血癥是引發(fā)動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的主要因素[1]，藥物治療是目前治療高脂血癥的主要手段，但由于其具成本較高且有較大的副作用，并不是治療高脂血癥的最佳方法。然而，隨著現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)的不斷發(fā)展，功能性食品應(yīng)運(yùn)而生，它除了具備有自身的營養(yǎng)價值之外，更重要的是其還能夠促進(jìn)人體的健康，并且不會產(chǎn)生副作用，因此，將功能性食品對于膳食補(bǔ)充、干預(yù)作為代謝性疾病的基礎(chǔ)治療具有重要的意義。臨床研究發(fā)現(xiàn)[2]，降低血清中的血脂水平能夠顯著降低心血管病的死亡率，而乳酸菌作為人體腸道中重要的益生菌已被廣泛的用于功能食品，對血清中的血脂水平具有較好的改善作用[3，4]，并使腸道微生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生長期而有益的變化。endprint

由于乳酸菌體外降膽固醇的研究僅僅是在培養(yǎng)基中進(jìn)行，與機(jī)體內(nèi)的實(shí)際環(huán)境在各方面都有著巨大的差異，也受到諸多因素的制約與干擾，在體外具有降膽固醇功能的乳酸菌在機(jī)體內(nèi)是否起作用，還需要通過體內(nèi)動物試驗(yàn)的驗(yàn)證。因此，本文通過建立高血脂癥大鼠模型，并灌胃乳酸菌發(fā)酵液來研究乳酸菌在體內(nèi)的輔助降血脂效果。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級Wistar雄性大鼠揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；基礎(chǔ)飼料面粉20%、米粉10%、玉米20%、鼓皮26%、豆料20%、魚粉2%、骨粉2%）、高脂飼料（豬油10%、膽固醇1%、膽酸鈉0.2%、基礎(chǔ)飼料78.8%） 江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司；甘油三酯（TG）試劑盒、總膽固醇（TC）試劑盒、高密度脂蛋白（HDL-C）試劑盒、低密度脂蛋白（LDL-C）試劑盒、總膽汁酸（TBA）試劑盒四川邁克生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 JF-SX-500全自動滅菌鍋日本TOMY公司；SPX-150BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司；HITACHI 7020全自動生化分析儀日本Hitachi公司；Legend mach1.6R高速冷凍離心機(jī)美國塞默飛世爾科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌株的活化及樣品的制備 將發(fā)酵乳桿菌f5按3%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，發(fā)酵過程中采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，發(fā)酵至活菌數(shù)為109CFU/mL時，置于4℃貯藏備用。

2.2 動物分組與灌胃 45只SPF級雄性Wistar大鼠（140±4.5）g，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。試驗(yàn)期間保持飼養(yǎng)房通風(fēng)、透光和清潔衛(wèi)生，室溫為（23±1）℃，濕度為（50±5）%，并至少用7d時間來適應(yīng)有規(guī)律的12h白天，12h黑夜的循環(huán)，之后用于實(shí)驗(yàn)?；A(chǔ)飼料適應(yīng)性飼喂后，按各組間平均體重?zé)o顯著差異分為2組，空白對照組15只，模型組30只；通過飼喂14d高脂飼料來建立高脂模型，各組自由進(jìn)水及飼料，高脂模型建立后，每天上午按表1所述方式對大鼠進(jìn)行灌胃，發(fā)酵乳桿菌f5發(fā)酵液按2mL（109CFU/mL）/100g進(jìn)行，記錄每天的進(jìn)食量及每周的體重，以便調(diào)整灌胃量。

表1 動物試驗(yàn)分組

[組別＼&日常飼喂＼&灌胃＼&空白對照組＼&普通飼料+水＼&2mL/100g生理鹽水＼&模型組＼&高脂飼料+水＼&2mL/100g生理鹽水＼&發(fā)酵乳桿菌f5發(fā)酵液組＼&高脂飼料+水＼&2mL/100g f5菌株發(fā)酵液＼&]

2.3 大鼠臟器指數(shù)的測定 大鼠處死前測定空腹體重，記為W1，解剖后取完整的肝臟、腎臟、脾臟和心臟，預(yù)冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，用濾紙擦干，再稱重，記為W2，臟器指數(shù)=W2/W1×100。

2.4 大鼠血清血脂水平的測定 飼喂高脂飼料14d后，分別從對照組及模型組中隨機(jī)選取3只大鼠，禁食一夜，摘眼球采血，0℃靜置30min，2000×g、4℃離心15min分離血清，利用日立7020全自動生化分析儀測定大鼠血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量[5]。灌喂28d乳酸菌發(fā)酵液后，全部禁食一夜，稱量體重后眼球采血，采用上述方法測定大鼠血清中的TC、TG、HDL-C及LDL-C含量。

2.5 大鼠肝臟中TC、TG含量的測定 取0.4g于預(yù)冷生理鹽水中漂洗拭干的大鼠肝臟，剪碎后移入玻璃勻漿管中，加入3.6mL預(yù)冷生理鹽水，研磨充分使肝組織勻漿化，制備10%肝勻漿于3000×g離心15min，取上清，即10%肝勻漿上清液，取300μL于1.5mL離心管中。用試劑盒測定肝勻漿中TC、TG含量。

2.6 大鼠糞便中TC、TG、TBA含量的測定 稱取研磨成粉末狀的冷凍干燥糞便0.5g，加入氯仿：甲醇（2∶1）混合液共3mL，混勻（肝臟如不分層，加入生理鹽水0.6mL）后加入甲醇與氯仿（2∶1）至5mL，45℃水浴提取1h，l0000×g、4℃離心20min，棄掉上層液，收集氯仿層液體到新的EP管，加入0.6mL生理鹽水，10000×g、4℃離心10min，再重復(fù)一次上述步驟后置通風(fēng)櫥中吹干，加120μL異丙醇：Triton-100（9∶1，v/v）混合液復(fù)溶，漩渦震蕩2min，加180μL蒸餾水，再漩渦震蕩2min，使之充分溶解[6，7]，于全自動生化分析儀中測定糞便中TC、TG含量。取50.0mg凍干的糞便粉末，加入3.0mL的無水乙醇，70℃水浴15min，邊水浴邊振蕩，3000×g離心5min，將上清液移至另一管中。按上述方法將沉淀重提兩次，合并上清液，80℃水浴將上清液中的無水乙醇蒸干，并加入3.0mL石油醚充分振蕩祛除剩余物中的脂肪和中性固醇，3000×g離心5min，棄上清液；重復(fù)洗滌2次后，加入1.0mL含2%TritonX-100的乙醇于沉淀中，振蕩使沉淀充分溶解，80℃水浴蒸干乙醇，加入1.0mL蒸餾水溶解沉淀，即為糞便中的TBA溶液[8]，于全自動生化分析儀上測定糞便中TBA的含量。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 高脂大鼠模型的建立 飼喂高脂飼料14d后，測定大鼠血清中TC、TG、LDL-C及HDL-C的水平，結(jié)果如表2所示。由表2可知，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C的水平顯著高于空白對照組（P<0.05），而HDL-C顯著低于空白對照組（P<0.05），表明大鼠高脂模型建立成功。

3.2 大鼠的生理、生化指標(biāo)

3.2.1 大鼠飼料利用率 大鼠在試驗(yàn)期間毛色光潔，精神活躍，未出現(xiàn)異常體征和死亡現(xiàn)象。每周稱量體重，每天記錄攝食量，結(jié)果如表3所示。由表3可知，模型組大鼠體重的增加量顯著高于空白對照組（P>0.05），而L.fermentum f5發(fā)酵液組大鼠體重增長顯著低于模型組（P<0.05），表明高脂飼料造成大鼠體重的增加，而L.fermentum f5的干預(yù)對高血脂大鼠體重增加具有一定的抑制作用；模型組大鼠的攝食量顯著低于空白對照組（P<0.05），可能是由于長期攝入高脂飼料降低了大鼠的食欲，導(dǎo)致大鼠攝食量的減少；L.fermentum f5發(fā)酵液組大鼠的攝食量和飼料利用率顯著高于模型組（P<0.05），表明L.fermentum f5的干預(yù)加速了飼料在大鼠體內(nèi)的代謝，增加了大鼠的食欲。endprint

3.2.2 大鼠臟器指數(shù) 臟器指數(shù)在一定程度上可以反映實(shí)驗(yàn)動物的營養(yǎng)狀態(tài)和臟器的健康狀態(tài)。干預(yù)28d后大鼠的臟器指數(shù)見表4。由表4可以看出，模型組大鼠的肝指數(shù)顯著高于空白對照組（P<0.05），說明高脂飼料的過多攝入使得脂質(zhì)在大鼠的肝臟內(nèi)積存，造成了大鼠肝臟重量的增加；而f5發(fā)酵液組大鼠的肝臟指數(shù)顯著低于模型組（P<0.05），表明L.fermentum f5的干預(yù)有利于脂質(zhì)的降解；各組間的腎指數(shù)、脾指數(shù)及心指數(shù)無顯著性差異（P>0.05），表明高脂飼料及L.fermentum f5發(fā)酵液未使大鼠的其它臟器產(chǎn)生病變。

3.2.3 大鼠血清血脂 灌胃28d后，大鼠血清血脂水平見表5。由表5可知，高脂飼料顯著增加了大鼠血清的TC、TG及LDL-C水平（P<0.05），而L.fermentum f5發(fā)酵液組大鼠血清的TC、TG及LDL-C水平顯著低于模型組（P<0.05），表明f5發(fā)酵液在一定程度上降低了大鼠的血清血脂水平。

3.2.4 大鼠肝臟TC、TG 取大鼠肝臟后制備肝勻漿，測定其TC、TG含量，結(jié)果見表6。由表6可知，與空白對照組相比，模型組大鼠肝臟TC、TG含量均顯著增加（P<0.05），而L.fermentum f5發(fā)酵液組肝臟TC、TG的含量顯著低于模型組（P<0.05）。

3.2.5 大鼠糞便TC、TG及TBA 利用全自動生化分析儀測定大鼠糞便中TC、TG及TBA的含量，結(jié)果如表7所示。由表7可知，模型組大鼠糞便中TC、TG及TBA的含量顯著高于空白對照組（P<0.05），而L.fermentum f5發(fā)酵液組大鼠糞便中TC、TG及TBA的含量顯著高于模型組（P<0.05），表明高脂飼料在增加大鼠體內(nèi)血脂水平的同時，也增加了大鼠糞便中的血脂水平，而f5發(fā)酵液則可以通過增加TC、TG及TBA的排泄來降低大鼠的血脂水平。

4 結(jié)論

在飼喂42d高脂飼料后，大鼠肝臟中TC、TG的含量顯著高于模型組及L.fermentum f5發(fā)酵液組（P<0.05），從而使得其肝指數(shù)也顯著升高（P<0.05），表明高脂飼料增加了大鼠肝臟和體內(nèi)脂肪的重量，而脂肪在體內(nèi)的不斷累積是模型組大鼠體重增加顯著高于其它組大鼠的一個重要因素；在L.fermentum f5干預(yù)后，大鼠的肝指數(shù)、體脂指數(shù)和體重顯著低于模型組（P<0.05），表明L.fermentum f5能夠通過降低脂肪在肝臟和體內(nèi)的積累來降低大鼠的體重。

L.fermentum f5不僅顯著降低了高血脂大鼠血清血脂含量（P<0.05），同時還顯著降低了肝臟中TC及TG的含量（P<0.05），表明大鼠血清血脂水平的降低不（下轉(zhuǎn)61頁）（上接18頁）僅僅是血脂在血清和肝臟中的重新分布，而是同時降低了大鼠血清和肝臟中的血脂水平。乳酸菌在腸道內(nèi)能夠與中性固醇、膽汁酸等物質(zhì)直接接觸，這些物質(zhì)的排泄與體內(nèi)的血脂水平存在一定的關(guān)系[9]，而試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，L.fermentum f5發(fā)酵液組大鼠糞便中的膽汁酸含量顯著高于模型組（P<0.05），可能是乳酸菌促進(jìn)腸腔中的菌群將膽汁酸分解為游離膽汁酸，并沉淀在糞便中被排出體外的原因[10]；由于膽固醇是合成膽汁酸的原料，為補(bǔ)償由糞便排出的膽汁酸，更多的膽固醇需要轉(zhuǎn)化為膽汁酸，從而降低了體內(nèi)膽固醇的含量[11]。因此，L.fermentum f5發(fā)酵液通過促進(jìn)膽汁酸的排泄來降低大鼠體內(nèi)膽固醇含量是其降低體內(nèi)血脂的一個重要途徑；L.fermentum f5在體內(nèi)具有較強(qiáng)的輔助降血脂的功效。

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