濃香型高溫酒曲中蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選與鑒定

黃家駟+劉盾+陳玄陽(yáng)+王珊珊+陳燕+程爽

摘 要：該研究利用酪蛋白選擇性培養(yǎng)基從濃香型高溫酒曲中分離得到1株有明顯水解圈的蛋白酶產(chǎn)生菌LS-1，經(jīng)16SrDNA鑒定其為地衣芽孢桿菌；LS-1通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)提取出粗酶液，其酶活為180U/mL。

關(guān)鍵詞：酒曲；蛋白酶；篩選；鑒定

中圖分類號(hào) Q93-31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）21-0029-03

Isolation and Identification of Protease-producing Srains from Luzhou-flavor Liquor Starter

Huang Jiasi1 et al.

（1School of Biological and Chemical Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，China）

Abstract：A protease-producing strain was isolated from Luzhou-flavor Liquor Starter with casein-selective medium，named LS-1. The 16SrDNA was amplified by PCR and the amplification products was subjected to sequencing and homology analysis. As a result，strain LS-1 was identified as Bacillus licheniformis. The protease activity in fermentation broth was 180U/mL.

Key words：Liquor Starter；Protease；Isolation；Identification

白酒是我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，有著悠久的歷史，從古至今一直受到人們的喜歡。中國(guó)傳統(tǒng)白酒是以富含淀粉質(zhì)的糧谷類為原料，以中國(guó)酒曲為糖化發(fā)酵劑，采用固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵，經(jīng)蒸餾、貯存和勾調(diào)而成的含酒精的飲料[1]，被列為世界著名六大蒸餾酒之一。因釀造原料、酒曲種類和生產(chǎn)工藝以及自然環(huán)境等因素的不同，形成了特色、風(fēng)格不同的各種香型的白酒。釀造原料、酒曲種類和生產(chǎn)工藝以及自然環(huán)境等影響著白酒香型的形成。根據(jù)我國(guó)白酒的生產(chǎn)工藝可以看出，白酒釀造過(guò)程實(shí)質(zhì)上是相關(guān)微生物的代謝過(guò)程，其微生物主要來(lái)源于酒曲、窖泥和酒醅，參與酒精及香味物質(zhì)的形成，是影響典型香型形成的重要因素，釀酒微生物的種類、數(shù)量、分布及其消長(zhǎng)變化等對(duì)白酒發(fā)酵途徑及最終產(chǎn)物的生成均有著重大的影響[2]。白酒生產(chǎn)中釀酒微生物的研究水平直接影響白酒生產(chǎn)技術(shù)水平，進(jìn)而影響白酒的質(zhì)量、微生物群落結(jié)構(gòu)，尤其是風(fēng)味微生物菌群結(jié)構(gòu)，對(duì)于白酒的產(chǎn)量與質(zhì)量起著決定性的作用[3-4]。

酒曲是微生物的培養(yǎng)物，是白酒生產(chǎn)中的糖化劑、發(fā)酵劑、產(chǎn)香劑，有“酒之骨”之稱。釀酒的糖化過(guò)程，是酒曲中蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶和果膠酶的協(xié)同作用的結(jié)果[5]。其中酒曲中的蛋白酶在釀酒過(guò)程中更是起到至關(guān)重要的作用。蛋白酶是分解蛋白質(zhì)肽鍵一類水解酶的總稱。它能有效水解原料中的蛋白質(zhì)，破壞原料顆粒間質(zhì)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使原料中可利用的碳源增加；同時(shí)由于蛋白質(zhì)的水解作用，提高了發(fā)酵料中氨基態(tài)氮的含量，促進(jìn)酵母生長(zhǎng)繁殖，加快發(fā)酵速率[6]。在白酒生產(chǎn)過(guò)程中不能忽視蛋白酶，從酒曲中選育出高產(chǎn)蛋白酶應(yīng)用于釀酒工業(yè)，將極大改善酒曲性能，提高酒的質(zhì)量和產(chǎn)率，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本。目前對(duì)于濃香型白酒釀酒微生物研究較多，主要集中在酒曲微生物產(chǎn)淀粉酶的菌株的研究，而對(duì)產(chǎn)蛋白酶菌株研究相對(duì)較少。為此，本文擬以河南本地濃香型白酒高溫酒曲為研究對(duì)象，對(duì)其中的可培養(yǎng)產(chǎn)蛋白酶微生物進(jìn)行分離鑒定和產(chǎn)酶特性研究，從微生物的角度進(jìn)一步理解白酒的發(fā)酵本質(zhì)，以期從中獲得具有一定工業(yè)應(yīng)用潛力的產(chǎn)酶菌株，為白酒生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酒曲 取自河南新境界酒業(yè)有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 （1）試劑：酪蛋白、牛肉膏、瓊脂粉等均為生物純，北京奧博星；葡萄糖、Na2HPO4·7H2O、 KH2PO4等均為分析純，天津科密歐；L-酪氨酸，分析純，sigma進(jìn)口分裝；Folin-酚試劑：北京索萊寶；細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒，北京天根；PCR及電泳所用試劑均購(gòu)自Takara。（2）儀器：上海精宏DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱；國(guó)華SHA-C水浴振蕩器；上海安亭飛鴿TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)；上海申安LDZX-50KBS高壓滅菌鍋；奧林巴斯CX23雙目光學(xué)顯微鏡；BioDrop超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；Biometra T-Profssional Standard PCR儀；北京六一DYY-7C電泳儀；北京六一DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳槽；北京君意東方JY04S-3E凝膠成像分析儀；上海精科752N分光光度計(jì)。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）酪蛋白培養(yǎng)基[7]：Na2HPO4·7H2O 1.07g，KH2PO4 0.36g，酪蛋白4g，ZnCl2 0.014g，NaCl 1.2g，CaCl2 0.002g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4 0.02g，瓊脂20g，pH7.0，蒸餾水1000mL，121℃高壓滅菌。（2）種子培養(yǎng)基[8]：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，pH7.0，蒸餾水1000mL，121℃高壓滅菌。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基[8]：葡萄糖40g，蛋白胨20g，Na2HPO4 1.4g，CaCl2 0.6g，MgSO4 0.4g，pH7.0，蒸餾水1000mL，121℃高壓滅菌。（4）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，NaCl 5g，瓊脂20g，pH7.0，蒸餾水1000mL，121℃高壓滅菌。endprint

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 （1）樣品稀釋液的制備：準(zhǔn)確稱取酒曲5g，研磨成粉，放入100mL的無(wú)菌生理鹽水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，震蕩至酒曲分散均勻后，即成10-1稀釋液，將其進(jìn)行梯度稀釋，得到10-1～10-4稀釋度的稀釋液。（2）涂布平板法接種：用移液器依次吸取10-1～10-4樣品稀釋液200μL菌液至酪蛋白平板上，用涂布器將菌液在平板上涂布均勻。將涂抹好的平板平放于桌上20～30min后轉(zhuǎn)入37℃恒溫培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)。

1.2.2 篩選及鑒定 37℃培養(yǎng)48h后，對(duì)各個(gè)稀釋度涂布平板進(jìn)行觀察，選擇有較大透明圈的菌落利用劃線分離法進(jìn)行二次純化；二次純化后挑取有透明圈的單菌落接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上保存；挑取單菌落進(jìn)行顯微鏡觀察，初步形態(tài)觀察后提取其基因組DNA進(jìn)行16SrDNA的擴(kuò)增，引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。將PCR產(chǎn)物送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序完成后將序列利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）Blast數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行16SrDNA相似性比較分析。

1.2.3 酶活測(cè)定 （1）粗酶液液制備：挑取將保存至斜面上的純培養(yǎng)物接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)48h后離心取上清進(jìn)行酶活測(cè)定。（2）酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液：按表1配制，L-酪氨酸稀釋液應(yīng)在稀釋后立即進(jìn)行測(cè)定。

分別取上述溶液各1mL，各加碳酸鈉溶液5mL、Folin-酚試劑溶液1mL，振蕩均勻，于40℃水浴中顯色20min，取出，用分光光度計(jì)于680nm，10mm比色皿，不含酪氨酸的0管為空白，分別測(cè)其吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用回歸方程，計(jì)算當(dāng)吸光度為1時(shí)的酪氨酸量（μg），即為吸光常數(shù)K值，K值應(yīng)在95～100。

（3）酶活測(cè)定：采用Folin-酚法[9]對(duì)粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定。酶活力單位定義：40℃下，每分鐘水解酪蛋白底物產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為為一個(gè)蛋白酶活力單位。將2%酪蛋白溶液放入40℃恒溫水浴中，預(yù)熱5min；取1mL粗酶液加入2mL預(yù)熱好的酪蛋白溶液中混勻后放入40℃水浴中保溫10min后加入1mL10%三氯乙酸終止反應(yīng)，取1mL上清液加入0.55mol/LNa2CO35mL，加入1mLFolin-酚試劑至40℃水浴顯色20min后于680nm下測(cè)定吸光值，以加水的反應(yīng)體系為空白。計(jì)算酶活：從標(biāo)準(zhǔn)去線上讀出最終稀釋液的酶活力，單位U/mL，原液的酶活力按照下式計(jì)算：蛋白酶的活力（U/mL）=A×K×4÷10×n。

式中：A：發(fā)酵原液的平行實(shí)驗(yàn)的OD值；K：吸光常數(shù)；n：蛋白酶的液的稀釋倍數(shù)；4：反應(yīng)試劑的總體積；10：反應(yīng)時(shí)間10min；所得結(jié)果表示至整數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

2.1.1 菌落平板形態(tài) 在37℃培養(yǎng)48h后，在分離培養(yǎng)基上可以觀察到有部分菌株周圍產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)水解圈，其中水解圈較大的菌落呈白色，扁平，干燥，周圍呈雪花狀，見(jiàn)圖1。將該菌株命名為L(zhǎng)S-1，對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢呈紫色，短桿狀。

2.1.2 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳分析 將菌株LS-1的16SrDNA產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析，條帶單一，約1.5kb（圖2）。

（泳道1為Maker：DL2000；泳道2為樣品）

2.1.3 16SrRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析 LS-1 16SrRNA基因序列測(cè)序所獲得序列長(zhǎng)度為1438bp，將其與Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)LS-1與芽孢桿菌屬的16SrRNA基因序列自然聚類，LS-1的16SrRNA基因序列與9條相似性較高的序列利用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3，從圖3中可看出，LS-1與Bacillus licheniformis strain AS-08E（GenBank：JN118574.1）聚為一群，相似性也最高，表明LS-1與Bacillus licheniformis strain AS-08E的親緣關(guān)系最近。

2.2 LS-1酶活測(cè)定 根據(jù)圖4可知，LS-1菌株粗酶液的酶活為180U/mL。與文獻(xiàn)中其它酒曲源的蛋白酶產(chǎn)生菌相比，LS-1的蛋白酶活力一般，可能是未對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化研究。王麗等[10]從汾酒曲醅中篩選到一株高溫蛋白酶芽孢桿菌W20，其在55℃時(shí)最高酶活為708.33U/mL。王俊英等[11]從宋河酒曲中分離到一株產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌M4，其最適酶活力溫度為40℃，在此條件下酶活為366U/mL。

3 討論

酒曲中微生物種類豐富，本文僅從樣品中分離到一株產(chǎn)蛋白酶菌株LS-1，推測(cè)該菌株為酒曲中的優(yōu)勢(shì)菌，也可能是樣品處理過(guò)程中未進(jìn)行富集培養(yǎng)。目前已報(bào)道的高溫產(chǎn)蛋白酶菌種來(lái)源多為枯草芽孢桿菌、嗜熱芽孢桿菌和脂肪芽孢桿菌，分離生境比較豐富，多為溫泉、酒醅等環(huán)境。本文中篩選到的菌株LS-1為酒曲中篩選獲得，在今后工作中將對(duì)其發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行深入研究，以期為該蛋白酶在食品、釀酒工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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（責(zé)編：張宏民）endprint