基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展及其在苜蓿等豆科飼草作物中的應(yīng)用

劉歡，孟穎穎，牛麗芳，林浩

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基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展及其在苜蓿等豆科飼草作物中的應(yīng)用

劉歡，孟穎穎，牛麗芳，林浩

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081

基因編輯是對(duì)生物基因組進(jìn)行靶向修飾的一項(xiàng)新型生物技術(shù)，可以在不同物種中實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的定點(diǎn)敲除、基因片段置換以及基因定點(diǎn)插入等基因定向編輯，目前基因編輯技術(shù)已在植物基因功能解析和作物遺傳改良研究中得到廣泛應(yīng)用。本文簡(jiǎn)要回顧基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程，重點(diǎn)介紹新近發(fā)展的CRISPR/Cas9技術(shù)在植物中的研究進(jìn)展，并對(duì)CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)在苜蓿等飼草作物中的應(yīng)用進(jìn)行探討和展望。

基因編輯，CRISPR/Cas9，豆科飼草作物，苜蓿

近年來(lái)，基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展為生物學(xué)研究開(kāi)辟了新的研究領(lǐng)域。基因編輯技術(shù)是基于序列特異核酸酶在基因組水平上對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行定向、準(zhǔn)確修飾的一種新興的基因工程方法[1-3]。序列特異性核酸酶通過(guò)識(shí)別和錨定基因組上的靶標(biāo)位點(diǎn)序列，對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行切割產(chǎn)生雙鏈斷裂(Double strand breaks，DSBs)，引起生物體內(nèi)發(fā)生同源重組(Homologous recombination，HR) 或非同源末端連接(Non homologous end joining，NHEJ) 進(jìn)行修復(fù)，造成基因組特定位點(diǎn)出現(xiàn)堿基缺失或插入進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的定向修飾[4-5]。目前，已成功發(fā)展的基因編輯技術(shù)主要包括鋅指核酸酶 (Zinc finger nucleases，ZFNs) 技術(shù)[6-7]、類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases，TALENs) 技術(shù)[8-9]、巨核酶(Meganucleases，MGNs) 技術(shù)[10]以及新近發(fā)展的CRISPR/Cas系統(tǒng)(The clustered regularly interspersed short palindromic repeats/CRISPR-associated)[11-14]。其中CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)由于具有操作簡(jiǎn)單、編輯高效、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于擬南芥、煙草、西紅柿、馬鈴薯、水稻、小麥、玉米等植物和主要農(nóng)作物的基因功能研究和重要農(nóng)藝性狀遺傳改良[15-23]。

優(yōu)化調(diào)整種植業(yè)結(jié)構(gòu)，支持飼料作物種植，促進(jìn)糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物、飼料作物三元種植結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)發(fā)展是我國(guó)新形勢(shì)下應(yīng)對(duì)居民膳食結(jié)構(gòu)改變、緩解糧食供求矛盾的重要舉措。享有“牧草之王”美譽(yù)的紫花苜蓿是世界上應(yīng)用最廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高和栽培面積最大的一種優(yōu)質(zhì)豆科飼料作物。苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)改良是我國(guó)當(dāng)前飼料業(yè)、畜牧業(yè)和奶業(yè)發(fā)展的重大迫切需求。與水稻、小麥、玉米、大豆等主要糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物相比，目前苜蓿等飼草作物功能基因組學(xué)研究尚處于起步階段，相應(yīng)的基因功能研究和分子遺傳改良的研究工具和技術(shù)手段有限，極大地限制了飼草作物分子育種技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展。本文簡(jiǎn)要回顧ZFN、TALEN、MGN以及CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程，重點(diǎn)介紹新近發(fā)展的CRISPR/Cas9技術(shù)在植物中的研究進(jìn)展，并對(duì)該基因編輯技術(shù)在苜蓿等飼草作物中的應(yīng)用進(jìn)行探討和展望，希望為苜蓿等豆科飼草作物的功能基因組學(xué)研究及遺傳改良提供新的研究思路。

1 基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程

1.1 ZFN基因編輯技術(shù)

ZFN是一種人工改造的核酸酶，由負(fù)責(zé)特異性識(shí)別靶標(biāo)序列的鋅指蛋白DNA結(jié)合域(Zinc finger DNA-binding domain) 和TypeⅡS類限制酶Ⅰ[24]C端的非特異性DNA切割結(jié)構(gòu)域兩部分組合而成[25]。通過(guò)定向改造ZFN鋅指DNA結(jié)合域的序列識(shí)別特異性，可以實(shí)現(xiàn)ZFN特異性地結(jié)合生物基因組中的靶標(biāo)基因序列，并利用Ⅰ的DNA切割結(jié)構(gòu)域進(jìn)行剪切，達(dá)到基因編輯的目的[6,26]。1996年，Kim等首先報(bào)道了將鋅指蛋白連接到Ⅰ的DNA切割結(jié)構(gòu)域可以產(chǎn)生1個(gè)新型的有活性的位點(diǎn)識(shí)別特異性核酸酶，并且該人工改造的新型鋅指核酸酶可以特異性地切割DNA序列[25]，標(biāo)志著ZFN基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)。

目前最常用的ZF (Zinc finger) 結(jié)構(gòu)為Cys2-His2鋅指，大約由30個(gè)氨基酸包裹1個(gè)鋅原子構(gòu)成，每個(gè)鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合3個(gè)核酸堿基[27]。研究表明，通過(guò)增加鋅指蛋白的數(shù)量可以擴(kuò)大ZFN識(shí)別靶標(biāo)DNA序列的長(zhǎng)度，進(jìn)而提高其序列識(shí)別特異性[28]。Ⅰ是一種TypeⅡS限制核酸酶，由于Ⅰ僅在二聚體狀態(tài)下才具備核酸酶活性，因此通常針對(duì)1個(gè)靶位點(diǎn)需要設(shè)計(jì)一對(duì)ZFNs，并且二者結(jié)合序列的間隔區(qū)域保持在6?8 bp以確保Ⅰ二聚體的形成[29]。ZFN利用鋅指結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合目標(biāo)DNA序列，并通過(guò)Ⅰ的DNA切割結(jié)構(gòu)域?qū)Π形稽c(diǎn)進(jìn)行切割，導(dǎo)致目標(biāo)DNA雙鏈斷裂，進(jìn)而利用細(xì)胞內(nèi)的同源重組或非同源末端連接等修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的靶向敲除[6,30-31]。目前ZFN技術(shù)已成功應(yīng)用于擬南芥、煙草、玉米和大豆等植物基因編輯[2,32]。

1.2 TALEN基因編輯技術(shù)

TALEN技術(shù)是第二代人工改造核酸酶技術(shù)，TALEN的構(gòu)成與ZFN相似，由TAL效應(yīng)因子(Transcription activator-like effector) 的DNA結(jié)合域與核酸酶Ⅰ的DNA切割結(jié)構(gòu)域兩部分組成[33]。TAL效應(yīng)因子是黃單胞屬植物病原菌分泌的一種細(xì)菌侵染植物的效應(yīng)蛋白，第一個(gè)TAL效應(yīng)因子AvrBs3于1989年在野油菜辣椒斑點(diǎn)病菌中被發(fā)現(xiàn)[34]。TAL效應(yīng)因子含有串聯(lián)重復(fù)的核心結(jié)構(gòu)域、核定位信號(hào)(Nuclear localization signal，NLS) 和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(Acidic activation domain，AD)[35-37]，其中串聯(lián)重復(fù)的核心結(jié)構(gòu)域具有特異性識(shí)別和結(jié)合DNA的功能，每個(gè)串聯(lián)重復(fù)單元通常由34個(gè)氨基酸組成，且不同單元的氨基酸序列高度保守，僅在12位和13位氨基酸上存在差異，被稱為重復(fù)可變雙氨基酸殘基(Repeat variable di-residue，RVD)[38]。RVD決定了重復(fù)單元的DNA識(shí)別特異性：Asn/Ile (NI) 識(shí)別A，Asn/Gly (NG) 識(shí)別T，His/Asp (HD) 識(shí)別C，Asn/Asn (NN) 識(shí)別G和A，Asn/Lys (NK) 識(shí)別G[37-40]。TAL串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)域中的RVD與靶標(biāo)DNA序列之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，使得TAL效應(yīng)子的串聯(lián)重復(fù)單元可以替換ZFN的DNA識(shí)別元件，從而發(fā)展了新型的基因定點(diǎn)編輯工具TALEN[41-44]。

與ZFN技術(shù)相比，TALEN基因編輯技術(shù)具有更高的DNA識(shí)別特異性，同時(shí)TALEN的靶標(biāo)位點(diǎn)設(shè)計(jì)靈活方便，模塊組裝具有極大的便捷性。目前科研人員利用TALEN技術(shù)已成功實(shí)現(xiàn)對(duì)煙草、水稻等多種植物的基因編輯[2,32]，并創(chuàng)制出對(duì)白粉病具有廣譜抗性的小麥材料[45]。

1.3 MGN基因編輯技術(shù)

MGN基因編輯技術(shù)也是一種基因工程改造的核酸酶技術(shù)，MGN是一種能夠識(shí)別大于12個(gè)堿基長(zhǎng)度特異核酸序列的歸巢核酸內(nèi)切酶，包含保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和酶切活性結(jié)構(gòu)域，廣泛存在于生物體體內(nèi)[46]。通過(guò)對(duì)MGN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行改造，可以實(shí)現(xiàn)特異性目標(biāo)DNA序列的識(shí)別并進(jìn)行基因編輯[10]。

與ZFN或TALEN不同，歸巢核酸內(nèi)切酶識(shí)別的目標(biāo)DNA序列較長(zhǎng)且具有很強(qiáng)的特異性，因此MGN改造起來(lái)難度較大，任何DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的改變都有可能影響目標(biāo)DNA序列的識(shí)別和切割。由于MGN的基因工程改造成本較高，MGN技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用主要集中在生物公司。目前已有研究報(bào)道MGN技術(shù)可應(yīng)用于玉米等作物的基因組修飾[47]。

1.4 CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)

CRISPR/Cas是細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中應(yīng)對(duì)外來(lái)病毒和DNA入侵而形成的一種免疫應(yīng)答反應(yīng)系統(tǒng)[48-54]。1987年大阪大學(xué)(Osaka University) 的研究人員報(bào)道了細(xì)菌基因組中存在成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)[52]，隨后發(fā)現(xiàn)在CRISPR附近區(qū)域還存在高度保守的CRISPR相關(guān)蛋白Cas[53]，并證明Cas蛋白具有核酸酶活性，可以對(duì)DNA序列進(jìn)行特異性切割[54]。CRISPR/Cas系統(tǒng)通過(guò)將入侵的噬菌體和質(zhì)粒DNA的片段整合到CRISPR序列中，并利用CRISPR RNA (crRNA) 來(lái)指導(dǎo)同源序列的降解。根據(jù)功能元件的不同，可以將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為T(mén)ypeⅠ、TypeⅡ、Type Ⅲ三種類型，其中TypeⅡ類型CRISPR/Cas9系統(tǒng)最為簡(jiǎn)單，由pre-crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白構(gòu)成[12]，該系統(tǒng)的作用原理是tracrRNA與pre-crRNA結(jié)合，隨后在Cas9存在的條件下，RNase Ⅲ完成對(duì)pre-crRNA/tracrRNA的切割，進(jìn)而形成成熟的crRNA-tracrRNA-Cas9復(fù)合體對(duì)靶位點(diǎn)DNA序列進(jìn)行剪切，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂[13-14]。

2012年Jinek等將tracrRNA和crRNA表達(dá)為一條嵌合的向?qū)NA (Single guide RNA，sgRNA)，并在體外證明sgRNA可以發(fā)揮tracrRNA和crRNA的功能[55]。改造后的CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由sgRNA和Cas9蛋白構(gòu)成，Cas9在sgRNA的指引下對(duì)基因組的PAM基序(Protospacer adjacent motifs) 上游進(jìn)行定點(diǎn)切割[12]。通常PAM位點(diǎn)由3個(gè)保守的核苷酸NGG (N可以為任何氨基酸)[13]組成。由于CRISPR的sgRNA識(shí)別序列一般僅需20個(gè)核苷酸左右，且Cas9蛋白不需要形成蛋白二聚體起作用，因此CRISPR/Cas9系統(tǒng)與ZFN、TALEN和MGN等技術(shù)相比具有構(gòu)建簡(jiǎn)單、編輯高效等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物等基因組編輯研究[12,14,56]。圖1所示為ZFN、TALEN、MGN以及CRISPR/Cas9技術(shù)的原理示意圖。此外，由于Cas9能夠共定位RNA、DNA和蛋白，從而擁有巨大的改造和應(yīng)用潛力[14]。

圖1 ZFN、TALEN、MGN以及CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)原理示意圖

2 CRISPR/Cas9技術(shù)在植物中的研究進(jìn)展

2.1 基因定點(diǎn)敲除

CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)一經(jīng)面世就受到植物科學(xué)家的廣泛關(guān)注。2013年雜志同時(shí)報(bào)道利用CRISPR/Cas9技術(shù)可以在雙子葉植物擬南芥、煙草和單子葉作物水稻、小麥中成功實(shí)現(xiàn)基因編輯。Li等和Nekrasov等研究人員分別利用植物密碼子優(yōu)化的CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)對(duì)擬南芥和煙草中的基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，同時(shí)發(fā)現(xiàn)煙草的編輯效率明顯高于擬南芥[57-58]，表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)于不同植物的編輯效率存在差異。Shan等科研人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)分別定點(diǎn)突變了水稻和小麥兩個(gè)作物中的和等5個(gè)基因，并且在T0代獲得了水稻純合突變體，呈現(xiàn)預(yù)期的白化和矮小表型，該研究證實(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠應(yīng)用于水稻等單子葉作物的基因組編輯[59]。此后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被陸續(xù)報(bào)道成功應(yīng)用于擬南芥、煙草、水稻、小麥、玉米、高粱、番茄等多種植物和農(nóng)作物中[15-23]。表1所示為本文中介紹的CRISPR/Cas9技術(shù)在一些主要植物和作物中的應(yīng)用情況。

2.2 基因定點(diǎn)插入和替換

利用基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因組水平的基因定點(diǎn)插入和精確替換對(duì)于植物遺傳改良具有重要的應(yīng)用意義。2015年Svitashev等和Li等利用CRISPR/Cas9技術(shù)分別在玉米和大豆中實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)插入和替換[17,60]。2016年，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所的研究人員通過(guò)非同源末端修復(fù)(NHEJ) 途徑開(kāi)發(fā)了一種內(nèi)含子介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性基因定點(diǎn)插入和替換方法，通過(guò)使用一對(duì)靶向相鄰內(nèi)含子的sgRNA和包含同一對(duì)sgRNA位點(diǎn)的供體DNA模板，在水稻中實(shí)現(xiàn)了5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3- phosphate synthase，EPSPS) 基因的定點(diǎn)替換[61]。該研究拓展了CRISPR/Cas9技術(shù)在植物中的應(yīng)用，為植物基因功能的解析和農(nóng)作物分子設(shè)計(jì)育種提供了一個(gè)全新的技術(shù)路線。

2.3 多基因敲除

作物的重要農(nóng)藝性狀通常受到多基因調(diào)控，因此開(kāi)發(fā)多基因CRISPR定點(diǎn)編輯技術(shù)對(duì)于解析作物重要農(nóng)藝性狀形成的遺傳基礎(chǔ)非常重要。Li等利用擬南芥原生質(zhì)體系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9可以實(shí)現(xiàn)多基因敲除[57]。Xing等于2014年開(kāi)發(fā)了基于pGreen或pCAMBIA骨架的CRISPR/Cas9載體，可以在1個(gè)克隆步驟中同時(shí)產(chǎn)生Cas9蛋白和1個(gè)或多個(gè)gRNA的表達(dá)載體，并利用該套CRISPR載體成功獲得可以穩(wěn)定遺傳的多基因敲除突變體，表明CRISPR/Cas9技術(shù)可以應(yīng)用于植物的多基因編輯[62]。2015年，Ma等設(shè)計(jì)出了一種基于PCR的方式來(lái)快速構(gòu)建多個(gè)sgRNA表達(dá)盒，并采用Golden Gate ligation或Gibson Assembly連接方法在一輪克隆中將表達(dá)盒裝配到CRISPR/Cas9雙元載體中[63]，研究人員利用該系統(tǒng)在水稻中成功編輯了46個(gè)靶位點(diǎn)，突變率平均為85.4%，其中大多數(shù)為純合突變和雙等位基因突變(Biallelic mutation)；同時(shí)在雙子葉植物擬南芥中利用該多基因表達(dá)載體在T1代獲得了雙重雜合、純合和嵌合突變，并證實(shí)在水稻和擬南芥中的上述突變位點(diǎn)都可以穩(wěn)定遺傳[63]。上述工作為研究植物基因家族功能以及創(chuàng)制多基因突變體提供了一個(gè)重要的研究工具。

2.4 基因單堿基精確突變

基因敲除是解析植物基因功能的重要研究手段，然而在植物研究中發(fā)現(xiàn)，一些單核苷酸點(diǎn)突變是作物許多重要農(nóng)藝性狀發(fā)生變異的遺傳基礎(chǔ)。2016年，美國(guó)哈佛大學(xué)的Komor等對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行定向改進(jìn)，構(gòu)建出一種新型的“堿基編輯” (Base editor，BE) 系統(tǒng)[64]。研究人員首先突變Cas9蛋白使其喪失DNA雙鏈切割活性但保持其DNA雙鏈的解旋功能(BE1)；隨后把可以將胞嘧啶(C) 轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U) 的大鼠胞嘧啶脫氨酶APOBEC1融合到突變的Cas9蛋白N端，同時(shí)將尿嘧啶DNA糖基酶抑制劑(Uracil DNA glycosylase inhibitor，UDI) 連接到APOBEC1-CRISPR/dCas9融合蛋白的C端(BE2)，實(shí)現(xiàn)單堿基的精確轉(zhuǎn)變；為進(jìn)一步提高點(diǎn)突變的編輯效率，研究人員利用了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中固有的錯(cuò)配修復(fù)(Mismatch repair，MMR) 機(jī)制，通過(guò)定點(diǎn)突變恢復(fù)Cas9蛋白的DNA單鏈切割活性(BE3)，最終實(shí)現(xiàn)高效的基因單堿基精確突變[64]。2016年，Li等通過(guò)利用胞嘧啶脫氨酶、Cas9 (D10A) 和尿嘧啶糖基化酶抑制劑(UGI) 的融合蛋白(BE3)，構(gòu)建植物表達(dá)載體，成功對(duì)水稻和基因進(jìn)行單堿基定點(diǎn)替換，效率最高可達(dá)20%左右[65]。最近，Zong等利用Cas9變體(nCas9-D10A) 融合大鼠胞嘧啶脫氨酶(rAPOBEC1) 和UGI，構(gòu)成了高效的植物單堿基編輯系統(tǒng)nCas9-PBE，成功地在水稻、小麥和玉米等農(nóng)作物基因組中實(shí)現(xiàn)高效、精確的單堿基定點(diǎn)突變[66]，該項(xiàng)技術(shù)不需要外源DNA供體和雙鏈DNA的切割，具有簡(jiǎn)單、廣適、高效的特點(diǎn)，為高效和大規(guī)模創(chuàng)制單堿基突變體提供了一個(gè)可靠方案。

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在苜蓿等豆科飼草作物中的應(yīng)用

紫花苜蓿是世界著名優(yōu)良牧草，也是我國(guó)栽培面積最大的一種豆科飼料作物，由于其具有蛋白質(zhì)豐富、適應(yīng)性強(qiáng)、能改良土壤和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)而享有“牧草之王”的美譽(yù)。但由于紫花苜蓿是多年生同源四倍體牧草，蟲(chóng)媒傳粉，其復(fù)雜的遺傳特性使得紫花苜蓿與二倍體作物相比在重要性狀基因挖掘及遺傳改良方面的研究工作相對(duì)滯后。蒺藜苜蓿是豆科苜蓿屬一年生放牧型牧草，二倍體，與紫花苜蓿、黃花苜蓿、三葉草等豆科飼草具有高度的遺傳相似性，隨著蒺藜苜蓿全基因組測(cè)序的完成，蒺藜苜蓿已成為研究紫花苜蓿等豆科牧草遺傳學(xué)和功能基因組學(xué)的理想模式[67]。

與水稻、小麥、玉米、大豆等主要糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物相比，目前關(guān)于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在苜蓿等豆科飼草作物中的應(yīng)用研究非常有限。為研究CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在大豆等豆科作物中的應(yīng)用，美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)的研究人員開(kāi)發(fā)了一個(gè)可以預(yù)測(cè)CRISPR/Cas9目標(biāo)位點(diǎn)的網(wǎng)頁(yè)工具，在此基礎(chǔ)上，利用大豆密碼子優(yōu)化的Cas9蛋白構(gòu)建了一個(gè)同時(shí)包含sgRNA的CRISPR/Cas9載體，并通過(guò)根毛轉(zhuǎn)染的方法分別轉(zhuǎn)化大豆和豆科模式牧草蒺藜苜蓿，分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在大豆和蒺藜苜蓿的根毛轉(zhuǎn)化細(xì)胞中靶標(biāo)基因出現(xiàn)一系列的突變[68]。2016年，Wang等在豆科模式植物百脈根中利用CRISPR技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)、和的多基因敲除，導(dǎo)致百脈根產(chǎn)生白色根瘤[69]。最近，我們實(shí)驗(yàn)室利用蒺藜苜蓿特異表達(dá)的U6啟動(dòng)子結(jié)合密碼子優(yōu)化的Cas9蛋白建立了1個(gè)適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苜蓿CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)成功對(duì)蒺藜苜蓿的內(nèi)源基因進(jìn)行了定點(diǎn)敲除，在T0代得到了比例達(dá)到10.35%的具有白化表型的蒺藜苜蓿純合敲除突變體[70]。上述研究工作為苜蓿等豆科植物功能基因組學(xué)研究提供了重要的研究工具，同時(shí)為CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于紫花苜蓿等具有復(fù)雜基因組豆科飼草作物的遺傳改良提供研究思路和技術(shù)參考。

4 展望

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，人民生活水平日益提高，廣大城鄉(xiāng)居民的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大改變，居民口糧消費(fèi)逐漸下降，對(duì)牛羊肉、禽肉和奶制品等草食畜產(chǎn)品的消費(fèi)不斷加大，進(jìn)而對(duì)苜蓿等優(yōu)質(zhì)飼草料的需求與日俱增。目前我國(guó)苜蓿等優(yōu)質(zhì)草種和飼草產(chǎn)品缺口較大，無(wú)法滿足畜牧業(yè)生產(chǎn)的消費(fèi)需要，導(dǎo)致苜蓿大量進(jìn)口，對(duì)我國(guó)的飼料產(chǎn)業(yè)和畜產(chǎn)品安全造成嚴(yán)重威脅。

通過(guò)分子育種與傳統(tǒng)育種相結(jié)合，加快培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苜蓿新品種，對(duì)于解決我國(guó)飼料作物生產(chǎn)和畜產(chǎn)品安全等問(wèn)題至關(guān)重要。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種新興的基因編輯技術(shù)，由于其具有操作簡(jiǎn)單靈活、編輯特異高效等特點(diǎn)，并且可以同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行高效精確定點(diǎn)修飾，目前已在植物基因定點(diǎn)編輯方面得到了大量應(yīng)用，然而CRISPR/Cas9系統(tǒng)在使用上仍存在著一定的局限性。CRISPR/Cas9系統(tǒng)工作時(shí)需要將crRNA與tracrRNA融合在一起，并且需要在宿主RNA酶的幫助下才能發(fā)揮作用。最近，Zetsche等發(fā)現(xiàn)并改造出新型CRISPR/Cpf1系統(tǒng)，克服了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的上述局限，CRISPR/Cpf1系統(tǒng)不需要tracrRNA的輔助，并且Cpf1蛋白兼具DNA剪切酶和RNA修剪酶雙重功能，不但可以切割DNA雙鏈，而且能把非成熟型crRNA (pre-crRNA)加工剪切為成熟型crRNA[71]，目前科研人員利用該系統(tǒng)可簡(jiǎn)單高效地在動(dòng)植物中實(shí)現(xiàn)多基因敲除，進(jìn)一步拓展了CRISPR技術(shù)的應(yīng)用[71-73]。相信隨著CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，未來(lái)基因編輯技術(shù)將在農(nóng)作物，尤其是飼草作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等重要性狀的基因功能解析和遺傳改良中發(fā)揮更大的作用。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Genome editing technology and its application in forage legumes

Huan Liu, Yingying Meng, Lifang Niu, and Hao Lin

Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Genome editing is a novel targeted genome modification biotechnology, which could successfully mutate specific loci as well as generate gene replacement and insertion in various organisms. So far, genome editing technology has been widely applied in investigating gene function and developing valuable traits in both model plants and major crops. In this review, we briefly survey the historical development of genome editing technology, summarize recent progress using the CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and explore the potential of the CRISPR/Cas technology in improving forage legumes.

genome editing, CRISPR/Cas9, forage legumes,

April 24, 2017;

June 12, 2017

Hao Lin. Tel: +86-10-82105492; E-mail: linhao@caas.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31570309), Agricultural Science and Technology Innovation Program of Chinese Academy of Agricultural Sciences (No. Y2016JC30).

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31570309)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(No.Y2016JC30) 資助。

林浩 博士，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所研究員、博士生導(dǎo)師。主要從事飼草作物功能基因組學(xué)和遺傳改良研究，在苜蓿重要農(nóng)藝性狀控制基因的挖掘和功能解析方面取得重要進(jìn)展，并成功應(yīng)用于飼草作物的遺傳改良，相關(guān)研究成果發(fā)表在、、等國(guó)際主流學(xué)術(shù)期刊。入選首批中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院“青年英才計(jì)劃”，擔(dān)任中國(guó)草學(xué)會(huì)草業(yè)生物技術(shù)專業(yè)委員會(huì)理事。