非人靈長類基因修飾模型研究進展

劉真，蔡毅君，孫強

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非人靈長類基因修飾模型研究進展

劉真，蔡毅君，孫強

中國科學院神經科學研究所中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心神經生物學國家重點實驗室中國科學院靈長類神經生物學重點實驗室，上海 200031

劉真, 蔡毅君, 孫強. 非人靈長類基因修飾模型研究進展. 生物工程學報, 2017, 33(10): 1665–1673.Liu Z, Cai YJ, Sun Q. Advance of gene-modified non-human primate models. Chin J Biotech, 2017, 33(10): 1665–1673.

非人靈長類動物在生命科學基礎研究和生物醫(yī)藥研究領域具有非常重要的地位。近年來隨著慢病毒載體轉染及靶向核酸酶 (ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9) 等基因操作技術的出現，科學家們成功地獲得了外源基因過表達的轉基因猴和目的基因定點切割的基因編輯猴。文中對目前利用慢病毒載體獲得轉基因猴和利用靶向核酸酶獲得基因編輯猴的研究進展進行了綜述，并討論了基因修飾猴的嵌合體現象、脫靶現象及非人靈長類動物較長性成熟時間這幾個影響非人靈長類基因修飾模型推廣應用的因素，最后展望了非人靈長類基因修飾模型構建技術的研究熱點及發(fā)展趨勢。

非人靈長類，基因修飾，慢病毒載體，靶向核酸酶

基因修飾動物模型在生命科學研究中發(fā)揮著極其重要的作用。其中大小鼠是哺乳類中最常用的模式動物，也是基因修飾手段應用最成熟的物種。利用慢病毒載體、轉座子、胚胎干細胞以及靶向核酸酶等基因操作手段，科學家們可以構建各種攜帶轉基因、基因敲除和基因敲入等基因修飾的大小鼠動物模型。這些動物模型被廣泛應用到免疫學、發(fā)育生物學、腫瘤學、神經生物學、心血管疾病等各個領域，為人們理解生命現象的本質作出了巨大的貢獻。盡管如此，利用大小鼠作為動物模型仍然有很多局限性，尤其是在神經科學認知研究領域，大小鼠很難有類似人的高級認知功能。另外絕大多數利用模擬人類腦疾病的大小鼠模型開發(fā)的藥物也都以失敗告終。

非人靈長類動物，指除人以外的所有靈長類動物，作為最接近于人的模式動物，其在基礎研究和生物醫(yī)藥研究領域有重要的地位[1]。相比于大小鼠等嚙齒類哺乳動物，非人靈長類與人類有著更多相似的生物學特征，被認為是研究高等認知以及腦疾病的最理想的模式動物。因此，國際科學界很早就對非人靈長類高度重視，并建立了很多非人靈長類研究中心。目前非人靈長類的實驗動物主要包括隸屬于舊大陸猴分支獼猴屬的食蟹猴和恒河猴及新大陸猴分支的絨猴。隨著轉基因技術和基因編輯技術的發(fā)展，科學家們已經可以成功地對非人靈長類的基因組進行基因修飾，獲得外源基因過表達的轉基因猴和目的基因定點切割的基因編輯猴。我們國家的非人靈長類資源非常豐富，全國各地有多個非人靈長類動物飼養(yǎng)繁殖基地。國家對利用非人靈長類開展科學研究也非常重視，即將開始的中國腦計劃中，非人靈長類動物將會發(fā)揮非常重要的作用。

慢病毒載體感染和分子靶向核酸酶(ZFN、TALEN及CRISPR/Cas9等) 是非人靈長類基因修飾模型構建中最常用的兩種方法。利用這兩種方法獲得的首建動物 (F0) 有可能是嵌合體，這導致科學家們很難在F0代得到基因型和表型一致的動物模型。傳代到F1可以有效解決嵌合體問題，但常用的恒河猴和食蟹猴正常性成熟時間至少需要4年，加上半年的懷孕期，即至少需要4.5年才能得到F1代。這嚴重限制了基因修飾恒河猴和食蟹猴模型的推廣和應用。

本文中，我們將對基因修飾非人靈長類模型的構建進行綜述，并對限制非人靈長類基因修飾模型推廣應用的因素展開討論，最后對非人靈長類基因修飾模型構建技術的研究熱點及發(fā)展趨勢進行展望。

1 慢病毒載體介導的非人靈長類轉基因技術研究進展

在生殖生理特性方面，食蟹猴和恒河猴都是有月經單胎繁殖動物，即每個經期排卵1?2枚。由于存在優(yōu)勢卵泡效應，即使是用激素對其進行超數排卵 (超排) 處理，自然受孕一般也只有1?2枚卵母細胞排出并受精。因此，用于大小鼠通過直接取受精卵后進行轉基因操作的方法在非人靈長類上并不適用。同時，由于既沒有足夠的卵巢用于收集成熟前卵母細胞，也沒有建立一種可靠的卵母細胞體外成熟體系，諸如在牛和豬等動物上通過體外成熟獲得卵母細胞資源的方法在非人靈長類上也不可行。在非人靈長類基因修飾模型構建中，要得到更多卵母細胞用于胚胎構建，需通過對動物進行超排處理使卵巢中多數卵泡生長，并在自發(fā)排卵前將更多發(fā)育的卵泡內成熟卵母細胞取出來實現。但即便如此，卵母細胞和胚胎資源還是有限，因此，為充分利用有限的胚胎資源，必須建立高效的轉基因或基因編輯技術。

2001年，Chan等利用高滴度的慢病毒轉染早期恒河猴卵母細胞后再進行單精子注射和胚胎移植，成功得到了轉GFP的恒河猴ANDi[2]。雖然在其得到的3只出生個體中僅有1只檢測到了外源基因GFP的整合和嵌合表達，但這一開創(chuàng)性的工作標志著轉基因非人靈長類技術的誕生。同年7月，Wolfgang等同樣利用慢病毒載體轉染恒河猴囊胚期胚胎后移植，也得到了在胎盤組織中整合了外源eGFP的轉基因恒河猴[3]。這兩個開創(chuàng)性的工作說明轉基因非人靈長類技術已經實現了從理想到現實的轉變。但他們都選擇綠色熒光蛋白作為轉入的目標基因，其主要目的還是用來探討轉基因非人靈長類技術的可行性。隨著研究的深入和技術的成熟，科學家們開始把目標轉向了功能基因。2008年該技術才終于在非人靈長類模式動物構建上得以成功應用，Yang等利用該技術將亨廷頓舞蹈癥的致病基因成功導入到恒河猴體內，并得到了具有類似亨廷頓舞蹈癥表型的動物模型[4]。亨廷頓疾病是一種顯性的神經性病變疾病，主要是因為人亨廷頓基因(HTT) 第一個外顯子中CAG重復擴增，導致表達的亨廷頓蛋白中含有多聚谷氨酰胺，從而引發(fā)運動機能損傷、認知功能退化和精神失調等一系列病癥，患者發(fā)病10?15年后就會死亡。雖然嚙齒類也有亨廷頓疾病轉基因動物模型，但這些模型都不能很好地模擬亨廷頓疾病在人體的表型特征。在亨廷頓轉基因恒河猴的工作中，作者把人HTT基因的第一個外顯子上后面鏈接84個CAG重復序列，并把這段重組序列包裝到慢病毒載體中，得到高滴度的慢病毒顆粒(滴度>109PFU/mL)。通過卵母細胞透明帶下注射把病毒粒子注射到恒河猴MⅡ期卵母細胞的卵周隙。之后，再通過單精注射讓卵母細胞受精和胚胎移植，成功得到轉基因恒河猴。分析結果顯示轉基因猴不僅表達了外源基因，而且出現了神經纖維網聚集、核內含物，同時，表現出肌無力和舞蹈癥等亨廷頓舞蹈癥病人的典型標志表型。作為第一個非人靈長類疾病動物模型，亨廷頓疾病轉基因恒河猴模型的意義之大是不言而喻的。該模型可以讓人們更好、更深入地了解亨廷頓疾病，研究其發(fā)病機制和致病機理，從而研發(fā)出相對應的治療方案和藥物。同時，該模型的建立也證明了構建其他非人靈長類疾病模型的可行性。其后，2009年日本科學家Sasaki等利用絨猴性成熟時間相對較短的特性，通過慢病毒載體轉染技術成功得到了可生殖系傳遞的GFP轉基因絨猴[5]。我國雖然在非人靈長類輔助生殖和轉基因技術上起步較晚，但是經過近10年的發(fā)展已經逐漸趕上并超過了美國、日本等國，處于世界領先地位。2008年華東師范大學報道了國內首例試管食蟹猴[6]；2010年中國科學院昆明動物研究所報道了國內首例轉基因猴[7]；2011年中國科學院神經科學研究所利用該技術將人的自閉癥相關致病基因MeCP2成功轉入食蟹猴個體，得到了多只MeCP2轉基因食蟹猴首建猴，并利用精巢移植技術提早得到了F1代轉基因猴，經過全面系統(tǒng)分析發(fā)現這些MeCP2轉基因食蟹猴有類似人類自閉癥表型[8]。

2 靶向核酸酶介導的非人靈長類基因編輯研究進展

通過慢病毒載體介導得到的非人靈長類轉基因技術只能完成外源基因的過表達操作，致其應用范圍有限。由于在非人靈長類上還未建立可生殖系整合的猴胚胎干細胞系，因此還不能像通過胚胎干細胞基因打靶操作獲得基因敲除小鼠模型那樣來構建基因敲除猴模型。近年來，隨著鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFN)、類轉錄激活因子效應物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALEN) 和RNA介導的基于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列和Cas9蛋白的DNA核酸內切酶 (Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas9-based RNA-guided DNA endonucleases，CRISPR/Cas9) 這3種靶向核酸酶技術的出現及其在模式動物構建上的應用[9-16]，使得我們可以跨過非人靈長類無胚胎干細胞用于進行同源重組基因打靶的這一技術障礙，直接通過早期猴胚胎期注射用于靶向特定基因的ZFN、TALEN或Cas9/sgRNA對靶基因進行編輯，進而獲得相應靶基因突變的猴模型。2014年，來自昆明理工大學和中國科學院神經科學研究所的兩個團隊分別通過受精卵注射靶向食蟹猴Mecp2基因的TALEN質粒和mRNA得到了Mecp2基因突變食蟹猴[17-18]。Mecp2是一個位于X染色體上的純合突變致死基因，該基因突變的病人會發(fā)生瑞特氏綜合征。隨后南京大學、南京醫(yī)科大學和昆明理工大學聯合報道了使用CRISPR/Cas9技術獲得了基因編輯的食蟹猴。該工作通過將針對Ppar-γ、Rag1和Nr0b1三個基因的5條sgRNA和Cas9 mRNA混合注入食蟹猴受精卵的卵胞質并將注射后的胚胎移植到代孕受體，最后得到了兩只Ppar-γ和Rag1基因編輯的個體[19]。之后，中國科學院動物研究所的團隊報道了利用CRIPSR-Cas9技術獲得了p53基因雙等位基因突變的食蟹猴[20]。2015年，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所和昆明理工大學聯合報道了DMD基因編輯恒河猴[21]。2016年，日本科學家利用ZFN和TALEN成功獲得了IL2RG基因編輯絨猴[22]。至此，過表達和基因編輯這兩項主要的模式動物構建技術在非人靈長類的主要物種恒河猴、食蟹猴和絨猴上都獲得了成功。

3 限制非人靈長類基因修飾模型推廣應用的因素

無論是利用慢病毒載體轉染獲得的轉基因猴還是利用靶向核酸酶獲得的基因編輯猴，其首建猴多數都以嵌合體的形式存在。對于存活的嵌合體首建猴，我們很難精確地將轉基因或目的基因突變和潛在表型對應起來。因此，利用這些方法得到的嵌合體首建猴，并不能稱之為標準的動物模型。

在利用慢病毒載體構建轉基因猴時，不同數目的慢病毒載體基因組可以在早期胚胎多個時間點整合到猴基因組，其整合數目和整合時間呈一定的隨機性。這就導致注射同一批病毒載體的不同胚胎發(fā)育得到的個體的轉基因拷貝數及轉基因整合位點差別有可能很大，而且同一只轉基因個體其體內不同細胞所含有的轉基因數目和整合位點也有可能不同。那么利用相同的慢病毒獲得的同批轉基因首建猴就可能會出現表型的差異。在我們利用慢病毒構建Mecp2轉基因食蟹猴的工作中，對獲得的10只轉基因陽性首建猴的轉基因拷貝數進行分析，發(fā)現轉基因猴中，最少含有1個轉基因拷貝數，而最多則含有7個轉基因拷貝數。我們利用其中1只含有6個Mecp2轉基因數的雄性首建猴進行傳代，獲得了5只Mecp2轉基因F1代食蟹猴。分析發(fā)現這5只F1代的Mecp2轉基因拷貝數從2–6不等[8,23]。這既可能是由于F1代的基因分離所導致的，也可能是由于Mecp2轉基因首建猴生殖細胞為轉基因嵌合體所導致的。雖然每只F1代轉基因食蟹猴體內含有不同的Mecp2拷貝數，但是可以肯定的是每只F1代的個體內不同組織和細胞含有的轉基因拷貝數目及整合位點是一致的，即F1代轉基因食蟹猴不是以嵌合體存在。利用F1代轉基因猴作為動物模型獲得的結果會更具有說服力。

在利用ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等靶向核酸酶來進行基因編輯猴構建時，獲得的首建猴基本上也都以嵌合體形式存在[24]。這是因為靶向核酸酶在對目的打靶序列實現雙鏈切割后，切割斷裂后的DNA多數會以非同源末端連接來進行修復，修復后的目的打靶序列會出現各種形式的基因突變，從而可能導致該基因功能的失活。注射針對同一打靶位點的靶向核酸酶，獲得的同一批首建猴很可能含有不同的目的基因突變序列，同一只首建猴體內的不同組織細胞內也會有不同形式的目的基因突變序列。另外不同基因編輯首建猴體內也往往會含有不同比例的野生型序列。在我們利用TALEN和CRISPR/Cas9技術獲得的多個基因編輯首建猴模型中，我們發(fā)現基本所有的首建猴都是以嵌合體形式存在，即使有的首建猴體內沒有檢測到野生型序列，該首建猴也包含有不同形式的突變型序列。嵌合現象的存在使我們很難判斷該靶基因在不同細胞組織中是否真正失活，所以從實驗動物的角度來說，獲得的首建猴我們只能稱之為基因編輯猴，而不能稱之為基因敲除猴。由于每個生殖細胞只能獲得一種突變型，通過F0代基因編輯首建猴與野生型猴交配得到的子代猴 (F1代) 將不會再有嵌合現象，如果F1代中含有使該基因失活的基因突變，那么我們可以稱此F1代為雜合的基因敲除猴。因此通過F0代基因編輯首建猴直接互配，就有機會獲得真正的 (F1代) 基因敲除猴。考慮到非人靈長類較長的性成熟時間及靶向核酸酶技術應用于非人靈長類基因編輯模型構建才3年左右的時間，目前未見真正的F1代基因敲除猴報道。

利用ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等靶向核酸酶來進行基因編輯猴構建存在的另外一個問題就是脫靶現象[24]。在使用CRISPR/Cas9構建基因編輯動物模型時，脫靶現象尤為突出。前文中提到的已經報道的多個基因編輯猴都沒有檢測到脫靶現象的存在，但由于檢測位點數目的限制，很難說這些首建基因編輯猴就沒有脫靶突變發(fā)生。在我們通過CRISPR/Cas9技術獲得的多批基因編輯首建猴中都檢測到了脫靶突變。因此，脫靶現象的存在也是潛在的限制基因編輯首建猴作為動物模型開展深入研究不可回避的因素之一。

無論是首建猴的嵌合體現象還是脫靶現象，傳代至F1代是將不同轉基因或基因突變及脫靶突變分離進而獲得真正的轉基因或基因敲除動物模型的一個有效策略，但這還有一個性成熟時間長的問題無法回避。常用的恒河猴和食蟹猴其性成熟約需要4?5年的時間[25-27]。我們也針對蘇州猴群的公猴進行了精液采集和精子檢測，發(fā)現至少要50月齡以上的公猴精液中才會出現精子。針對這一障礙，我們開發(fā)了食蟹猴的精巢異種移植技術來加速其精子生成。通過將青少年食蟹猴精巢組織塊移植到去勢成年雄性裸鼠的背部，成功將食蟹猴的精子發(fā)生時間縮短到了24個月，并利用獲得的精子進行胚胎構建和移植得到了健康的食蟹猴后代[23]。這將推動非人靈長類基因修飾模型在基礎研究及生物醫(yī)藥研究中的應用。

4 非人靈長類基因修飾模型構建技術研究熱點及展望

基因編輯首建猴的嵌合體現象是影響其作為動物模型用于科學研究的一大障礙，除了傳代至F1代以外，通過改進方法一步獲得無野生序列嵌合現象的基因編輯首建猴，將提高利用基因編輯首建猴作為科學研究的可能性。根據我們的經驗，當利用CRISPR/Cas9進行基因編輯猴構建時，其基因組內不同位點對于切割效率的影響非常大，有些位點可以利用CRISPR/Cas9對其實現高效切割，有些位點則很難被切割。所以首先篩選高效的sgRNA打靶位點，是利用CRISPR/Cas9獲得基因編輯猴的重要因素。另外我們發(fā)現通過將多條sgRNA混合注射的方法，也可以明顯提高獲得無野生型序列嵌合的基因編輯首建猴。

另外針對脫靶，通過分析篩選脫靶效應低的sgRNA進行首建猴構建，或利用兩條sgRNA及Cas9 nickase來對目的打靶位點的兩條DNA鏈分別切割，可以潛在大大降低脫靶效應[28]。在非人靈長類上是否可以得到同樣效果，還有待進一步的實驗來驗證。

無論是脫靶現象還是嵌合體現象，都可以通過傳代來對不同基因型和脫靶突變進行分離。由于非人靈長類性成熟周期非常漫長，那么研究縮短非人靈長類性成熟周期的方法進而實現繁殖加速將會推動非人靈長類研究應用。我們已經開發(fā)了食蟹猴的精巢異種移植來實現其繁殖加速，但是該方法技術復雜而且效率較低[23]。那么開發(fā)其他非人靈長類繁殖加速的方法也會是未來非人靈長類基因修飾模型的一個重要的研究方向。

盡管科學家們已經可以利用靶向核酸酶對非人靈長類目的基因進行定點切割，獲得目的基因突變的基因編輯猴，然而目前還沒有成功利用靶向核酸酶和外源同源片段通過同源重組來獲得基因敲入猴[29]的報道。傳統(tǒng)的方法是利用CRISPR/Cas9對目的序列插入位點進行切割及同源臂介導的同源重組來實現外源片段的插入，但是該方法總體效率偏低。目前在細胞和大小鼠水平，已經有多篇文章報道可以提升利用CRISPR/Cas9等靶向核酸酶介導的基因敲入。例如通過加入小分子抑制NHEJ (非同源末端連接) 的發(fā)生，可以提高CRISPR/Cas9介導的細胞或小鼠胚胎水平基因敲入的效率[30-31]；也有報道稱將細胞同步化在特定細胞周期也可以提高CRISPR/Cas9介導的細胞水平的基因敲入[32]；通過TALEN及CRISPR/Cas9和短的同源臂介導的末端連接也能在細胞和胚胎水平提高外源片段精確敲入的效率[33]。值得一提的是，我們實驗室與本所楊輝課題組合作的課題中，通過利用CRISPR/Cas9及800 bp同源臂介導的末端連接實現了高效的小鼠和食蟹猴胚胎水平的基因敲入[34]。盡管有多種方法提升基因敲入的效率，但是總體來說仍不理想，且獲得的首建動物很有可能以嵌合體形式存在，可以判斷即使利用此方法獲得了陽性基因敲入猴，其距離作為真正的動物模型用于科學研究仍有較長的路要走。

在猴的精確基因敲入實現之前，想要在特定細胞類型內表達標記蛋白或功能蛋白 (如光敏感通道蛋白等)，利用腺相關病毒進行成體動物注射是一個折中的選擇。2016年劍橋大學Stauffer等首次報道利用包含特異啟動子THp啟動的Cre和包含Cre依賴的ChR2兩種腺相關病毒混合注入恒河猴中腦，實現了通過外部光源特異性激活恒河猴中腦多巴胺能神經元的目的[35]。

在小鼠基因修飾模型構建中，除了慢病毒載體和靶向核酸酶以外，利用胚胎干細胞囊胚注射、體細胞核移植、單倍體干細胞及生殖干細胞介導的轉基因等技術雖然不如以CRISPR/Cas9為代表的靶向核酸酶簡單易行，但是這些方法都有各自的優(yōu)勢并且在小鼠水平都取得了成功[36-38]。而且利用以上方法可以獲得攜帶復雜基因修飾的基因敲入首建動物模型。體細胞核移植、單倍體干細胞及生殖干細胞介導的轉基因獲得的首建動物更是沒有嵌合體現象存在。但是目前這些方法在非人靈長類都還沒有獲得成功?？紤]到非人靈長類自身特點，此類方法在非人靈長類的應用研究也是非人靈長類基因修飾模型構建技術的一個重要的方向[39]。

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(本文責編 陳宏宇)

Advance of gene-modified non-human primate models

Zhen Liu, Yijun Cai, and Qiang Sun

State Key Laboratory of Neuroscience, Key Laboratory of Primate Neurobiology, CAS Center for Excellence in Brain Science and Intelligence Technology, Institute of Neuroscience, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China

Non-human primates would be particularly valuable in life sciences and biomedical research area. Gene-modified monkeys with gene overexpression or loss of function have been successfully generated with the rapid advance in gene manipulation technology such as lentivirus infection and programmable nucleases (ZFN, TALEN, CRISPR-Cas9). Here we review the recent development on gene-modified monkey generation by lentivirus and programmable nucleases. Then we discuss three concerns, the long time for sexual maturation, the off target and the mosaicism of founders, which limit the wide application of gene-modified non-human-primates. At last, hotspots and future trend for gene-modified non-human-primates generation are proposed.

non-human primate, gene-modified, lentivirus, programmable nucleases

May 5, 2017;

June 28, 2017

Qiang Sun. Tel: +86-21-54921757; E-mail: qsun@ion.ac.cn

國家科技支撐計劃(No. 2014BAI03B00) 資助。

2017-08-04

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170804.1028.001.html

Supported by: Key Technologies Research and Development Program of China (No. 2014BAI03B00).

孫強 正高級工程師，中國科學院神經科學研究所非人靈長類 (蘇州) 研究平臺主任，獲中國科學院關鍵技術“百人計劃”支持。孫強博士致力于非人靈長類基因修飾動物模型的構建及技術研發(fā)。他領導的團隊建立了高效的非人靈長類轉基因和基因敲除技術平臺；并且開發(fā)了食蟹猴精巢異種移植技術，大大縮短了食蟹猴的性成熟周期。作為通訊作者或第一作者在、、等著名學術期刊發(fā)表多篇研究論文。其作為通訊作者在發(fā)表的具有自閉癥表型的轉基因食蟹猴的工作被科技部評為“2016中國科學十大進展”。