一株野生彎柄靈芝的鑒定與多糖、三萜含量的研究

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(福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心,國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州 350002)

一株野生彎柄靈芝的鑒定與多糖、三萜含量的研究

趙麗麗,葉麗云,解凡,湯坤鵬,吳小平*

(福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心,國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州 350002)

通過生物學(xué)特性比較和ITS測序比對對野生靈芝進行鑒定,并通過液體深層發(fā)酵培養(yǎng)和子實體有效成分分析對其多糖、三萜含量進行研究。結(jié)果顯示,野生菌株屬于Ganodermaflexipes(彎柄靈芝)。有效成分分析中,菌絲三萜含量(8.85 mg/g)和子實體三萜含量(9.67 mg/g)都顯著高于參考菌株(p<0.05);發(fā)酵液多糖含量(6.59 mg/mL)極顯著低于參考菌株(p<0.01),子實體多糖含量(23.70 mg/mL)極顯著高于參考菌株(p<0.01),是參考菌株的2.56倍。子實體三萜HPLC指紋圖譜顯示,野生菌株三萜有效成分種類單一且含量少。說明野生菌株可以通過優(yōu)化栽培技術(shù)來提取多糖。

彎柄靈芝,ITS測序,多糖,三萜,HPLC指紋圖譜

我國靈芝人工栽培已有60多年的歷史,野生靈芝資源有限,難以滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求,近年來靈芝的開發(fā)越來越受到人們的重視。我國的靈芝主栽品種大多引自韓國、日本等地,由于引進品種的產(chǎn)地自然氣候和環(huán)境差異大,引起菌種活性退化、名稱混雜、產(chǎn)量低、品質(zhì)差、抗病蟲害及雜菌能力差等情況,缺乏適宜我國各產(chǎn)地栽培的優(yōu)良品種[1]。我國自主選育的靈芝專用品種較缺乏,有必要進行采集驗證,發(fā)掘其他靈芝種的價值。

現(xiàn)代化學(xué)分析表明,靈芝含有豐富的生物活性物質(zhì),如多糖、三萜、蛋白質(zhì)、多肽、核酸類、不飽和脂肪酸、生物堿、甾醇類、微量元素和維生素等[2]。靈芝多糖和靈芝三萜被認為是靈芝的主要藥效成分,已知有119種靈芝三萜物質(zhì)以及多種具有不同化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)和生物活性的靈芝多糖[3]。靈芝多糖具有降“三高”、抗癌、提高免疫調(diào)節(jié)作用等活性[4];靈芝三萜具有保肝、抑制腫瘤細胞以及抗艾滋病毒等活性[5]。三萜類可以分為靈芝酸、靈芝孢子酸、靈芝內(nèi)酯、靈芝醇、靈芝醛、赤靈酸、靈赤酸、赤芝酮等10多種,其中靈芝酸為三萜類的主要活性成分[6]。

采用水提法結(jié)合醇提法提取多糖,苯酚-硫酸法進行檢測;采用乙醇浸提結(jié)合超聲法提取三萜,香草醛-冰醋酸法進行檢測。分析該野生靈芝菌株多糖、三萜含量,以期為選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的靈芝菌株提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

野生靈芝 采集自南平市順昌縣,分離方法參考鄒莉等[7];參考菌株(分類號Ganoderma.5.0542) 來自中科院,是赤芝的一種,赤芝是常見的靈芝;固體PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g,瓊脂20 g,葡萄糖20 g,蒸餾水1000 mL;液體PDA培養(yǎng)基 除不加瓊脂外其余相同;LB固體培養(yǎng)基 胰化蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL;LB液體培養(yǎng)基 除不加瓊脂外其余相同;木屑培養(yǎng)基 木屑76%,麩皮20%,玉米粉3%,石膏1%;無水乙醇、苯酚、三氯甲烷、正丁醇、冰醋酸、高氯酸、香草醛、濃硫酸等 均為分析純;靈芝酸A、赤芝酸A、靈芝酸C等 均為標準品;甲醇、乙腈 為色譜純。

GSP-9160MB型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;ZHWY-2102型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;C1000型PCR儀 Bio-Rad;DYY-12型電泳儀 北京市六一儀器廠;TANON-2009型凝膠成像系統(tǒng) 上海天能公司;DHG-9240A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;SB25-12DTDN型超聲儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;UV-1601型紫外可見分光光度計 北分瑞利分析儀器(集團)公司;LC-20ADXR型超快速分離液相色譜儀 日本島津制作所。

1.2實驗方法

1.2.1 靈芝菌株的生物學(xué)特性 供試菌株的菌落形態(tài)的比較和生長速率的測定參考葉麗云等[8]的方法。

1.2.2 ITS測序及比對

1.2.2.1 DNA的提取 參照傅俊生改良的CTAB法[9]提取供試菌株的總DNA。

1.2.2.2 ITS序列擴增及測序 采用ITS通用引物對供試菌株進行PCR序列擴增。ITS-PCR反應(yīng)體系:10×Buffer 3 μL,dNTP 2 μL,ITS1和ITS4分別為1 μL,Taq DNA聚合酶0.3 μL,DNA模版1 μL,ddH2O 21.7 μL。ITS-PCR反應(yīng)程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃ 10 min,4 ℃保存。1.0%瓊脂糖凝膠電泳對ITS-PCR產(chǎn)物進行檢測。

1.2.2.3 ITS-PCR產(chǎn)物的克隆測序 進一步與載體pMD 18-T Vector連接實驗,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑選陽性轉(zhuǎn)化子在100 μL LB液體培養(yǎng)基于37 ℃在200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h左右,按照ITS體系和程序經(jīng)PCR驗證后,陽性克隆子委托福州鉑尚公司測序。

1.2.2.4 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹 測定的序列結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對,選擇在線BLAST分析,再選取nucleotide blast得到與測定序列相近的序列結(jié)果。于CLUSTXAL1.83軟件將ITS序列進行對位排列并去掉兩端差異部分,用MEGA 5.1軟件采用最大似然法(Maximum Likelihood,ML)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[10]。

1.2.3 靈芝菌株的液體深層發(fā)酵

1.2.3.1 搖瓶培養(yǎng) 靈芝菌株的搖瓶培養(yǎng)參考湯坤鵬等[11]的方法。

1.2.3.2 生物量的測定 收集菌絲并除去接種塊,蒸餾水反復(fù)洗滌3次,置于60 ℃烘箱中烘干至恒重。稱量菌絲球干重,此為菌絲生物量。

1.2.3.3 發(fā)酵液多糖的提取與檢測 提取方法為水提醇沉法[12]:用無菌水將菌絲沖洗至沖洗液澄清,將沖洗液和濾液合并。將合并液在60 ℃條件下真空濃縮,濃縮液中加入3倍體積的無水乙醇溶液,4 ℃醇沉24 h。然后將濃縮液離心(4000 r/min 8 min),收集沉淀,將沉淀物置于烘箱中,在60 ℃烘干至恒重,即靈芝發(fā)酵液多糖。發(fā)酵液多糖的檢測采用苯酚-硫酸法[13]。每組 3個重復(fù)。

1.2.3.4 菌絲三萜的提取與檢測 提取方法參考湯坤鵬的方法[11]:稱取0.2 g靈芝菌絲體粉末,并加入30 mL的85%乙醇常溫浸提2 h,然后進行超聲提取0.5 h,功率為150 W。將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃減壓蒸餾去除乙醇,最后用甲醇定容至25 mL。采用香草醛-冰醋酸法[14]測定菌絲三萜含量。

1.2.4 靈芝菌株的農(nóng)藝性狀 參考金珊珊[15]的實驗方法進行靈芝栽培,選用37×22聚乙烯塑料袋,生物轉(zhuǎn)化率(%)=(子實體重量/干料重量)×100[16]。記錄供試菌株菌絲、子實體生長狀況相關(guān)參數(shù)。

1.2.5 子實體有效成分分析

1.2.5.1 子實體多糖的提取及檢測 提取方法[17]:精確稱取靈芝干燥子實體粉末 2 g,加蒸餾水于90 ℃回流提取3 h,料液比為1∶50 (g/mL),提取后過濾,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮,定容至25 mL。吸取10 mL多糖溶液,加入80 mL無水乙醇,醇沉過夜(約12 h),5000 r/min離心10 min,將沉淀物用蒸餾水定容至25 mL。檢測方法與發(fā)酵液多糖的檢測相同。

1.2.5.2 子實體三萜的提取及檢測 提取和檢測方法與菌絲中三萜的提取和檢測方法相同。

1.2.5.3 子實體三萜的HPLC圖譜分析 提取液用0.45 μm的有機微孔過濾膜過濾備用,三萜的HPLC分析程序方法采用金珊珊[15]的方法。采用Inertsustain C18色譜柱,以0.1%乙酸水(A)和乙腈(B)的梯度洗脫系統(tǒng),洗脫比例B濃度為:0～20 min:30%～40%;20～25 min:40%～55%;25～30 min:55%～65%;30～40 min:65%;柱溫40 ℃,流速0. 8 mL/min,進樣量10 μL,檢測波長254 nm。

靈芝酸A標準樣品圖譜,精確稱取4.0 mg的靈芝酸A晶體,用色譜級甲醇定容至50 mL,得到濃度為0.08 mg/mL的靈芝酸A標準液。按照以上方法對其進行HPLC分析。其他標準樣品的分析同理。

1.3數(shù)據(jù)處理

實驗中每個處理重復(fù)三次,數(shù)據(jù)分析采用Excel、SPSS DPS軟件和中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版。

2 結(jié)果與分析

2.1供試菌株的生物學(xué)性狀

2.1.1 菌株菌落形態(tài) 食用菌菌絲在不同條件下培養(yǎng),生長狀態(tài)不同,其菌絲生長速度、長勢、色澤等菌落形態(tài)特征存在一定差別,同時菌絲顯微結(jié)構(gòu)也會發(fā)生一些細微變化[18]。如圖1所示,野生菌株菌絲密度濃密,潔白呈匍匐狀,邊緣整齊有力;參考菌株氣生菌絲較厚,白色呈絨毛狀,邊緣不整齊,菌絲容易退化。

圖4 靈芝菌株系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of Ganoderma

圖1 不同靈芝種菌落形態(tài)特征Fig.1 The morphological specificity of different Ganoderma species

2.1.2 菌絲生長速率 從圖2可以看出,在相同的培養(yǎng)條件下,不同菌株的生長速率不同。野生菌株的生長速率較慢,為0.158 cm/d;參考菌株的生長速率較快,為0.475 cm/d,顯著高于野生菌株(p<0.05)。由于野外生長環(huán)境的不同,在人工培養(yǎng)的條件下,不同種類靈芝對營養(yǎng)元素的需求也有較大的差別[19]。

圖2 不同靈芝種的生長速率Fig.2 The growth rate of different Ganoderma species

2.2ITS測序及比對

2.2.1 ITS瓊脂凝膠電泳圖 采用特異性引物ITS1和ITS4對供試菌株DNA進行PCR擴增,得到的ITS瓊脂凝膠電泳圖如圖3所示,可以看出野生菌株和參考菌株的ITS序列片段大小都在500～750 bp。ITS序列在物種屬內(nèi)、近緣屬間以及科內(nèi)系統(tǒng)進化關(guān)系研究中有一定的價值,真菌ITS區(qū)域長度一般在650～750 bp[20]。

圖3 不同靈芝種的ITS-PCR圖譜Fig.3 ITS-PCR spectra of different Ganoderma species注:M為Marker,1,2,3為野生菌株,4,5,6為參考菌株。

2.2.2 ITS系統(tǒng)發(fā)育樹 將菌株進行單克隆測序,所得序列置于NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析比對。比對結(jié)果顯示該野生菌株和Ganodermaflexipes的相似性為97%,E值為0.0,表明該野生菌株屬于Ganodermaflexipes[21]。下載不同種靈芝屬的菌株ITS序列:JQ520182.1和JN222421.1;KJ868083.1和JQ781874.1;JN383978.1和JN383979.1;JQ781853.1和JQ781854.1;KR183855.1和KR733545.1;HQ235633.1和KF494998.1一起構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。從圖4可以看出該野生菌株與Ganodermaflexipes親緣關(guān)系較近,與BLAST分析比對結(jié)果相一致。

2.3靈芝菌株的液體深層發(fā)酵

表2 供試靈芝出芝參數(shù)Table 2 The parameters of Ganoderma

經(jīng)過195 h的發(fā)酵培養(yǎng),檢測記錄菌絲生物量、多糖和三萜含量。如表1所示,野生菌株的菌絲生物量為0.269 g/100 mL,極顯著高于參考菌株(0.149 g/100 mL)(p<0.01)。對于發(fā)酵液多糖,野生菌株的含量為6.59 mg/mL,低于參考菌株(7.01 mg/mL)。野生菌株菌絲三萜含量為8.85 mg/g,比參考菌株高出37.0%。菌株的液體深層發(fā)酵受到很多因素的影響,除了培養(yǎng)基質(zhì),調(diào)控工藝也能顯著影響液體發(fā)酵,主要表現(xiàn)在pH、溫度、接種量、氧溶量、攪拌速度等[22]。菌株經(jīng)過液體深層發(fā)酵后菌絲生物量和代謝產(chǎn)物的量存在一定差異,在本實驗條件下野生菌株的菌絲生物量和三萜含量較高。

表1 靈芝液體深層發(fā)酵相關(guān)參數(shù)及分析Table 1 Ganoderma lucidum submerged fermentation parameters and analysis

注：字母表示差異的顯著性,小寫字母表示顯著差異,p<0.05;大寫字母表示極顯著差異,p<0.01；ZK:參考菌株，SC：野生菌株；表2、表3同。

2.4靈芝菌株的農(nóng)藝性狀

供試靈芝菌株的出芝相關(guān)參數(shù)[23]如表2所示,與參考菌株相比,野生菌株菌絲滿袋天數(shù)較長為43 d,開袋至成熟天數(shù)較短為40 d,顏色偏淺,分支多,能產(chǎn)生少量孢子。野生菌株的出芝率比參考菌株低了30個百分點,生物轉(zhuǎn)化率低了7.6個百分點。靈芝整個生長期的生理活動除了與營養(yǎng)條件相關(guān)外,還受到溫度、濕度、光照、空氣、酸堿度等理化因素的影響。在本實驗條件下野生菌株SC的出芝率和生物轉(zhuǎn)化率偏低,商品價值不高。

2.5靈芝子實體的主要成分分析

2.5.1 子實體多糖和三萜含量的檢測 由表3經(jīng)計算可知,靈芝子實體多糖和三萜含量檢測發(fā)現(xiàn),菌株之間的子實體多糖含量有極顯著性差異。野生菌株SC的子實體多糖含量為23.70 mg/g,是參考菌株ZK的2.56倍。品種不同導(dǎo)致靈芝多糖含量有所不同,可能與菌絲生長速率相關(guān),菌株SC滿袋時間長于ZK(表2),有利于多糖的積累。不同提取方法所得靈芝多糖的提取率不同,微波法高于超聲波法,超聲波法高于索氏法[24]。菌株SC三萜含量為9.67 mg/g,比參考菌株ZK提高9.27%。靈芝酸為三萜類的主要活性成分,不能以總?cè)坪看砭甑撵`芝酸含量,需進一步HPLC分析其三萜種類和含量。

表3 子實體的多糖和三萜含量Table 3 Fruiting bodies of polysaccharides and triterpenoids

2.5.2 子實體三萜的HPLC分析 如圖5所示,從6個三萜酸的標準樣品HPLC指紋圖譜可知,保留時間逐漸遞增對應(yīng)的標準樣品為靈芝酸C2、靈芝酸C、靈芝酸A、赤芝酸A、靈芝酸E、靈芝酸F,其保留時間分別為15.90、19.96、22.89、25.92、27.29、28.32 min。以S1為參照圖譜進行匹配,利用軟件中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版將供試靈芝菌株子實體進行圖譜之間的相似度比較。由圖6可知,結(jié)合標準樣品的指紋圖譜發(fā)現(xiàn),菌株SC較顯著的出峰僅有1個靈芝酸A,由峰面積可知其含量不高;菌株ZK除靈芝酸A外,還含有其他靈芝酸。菌株SC、ZK相似度為81.7%,但從圖6中可以看出其匹配度不高,主要峰形的數(shù)量和保留時間有明顯差別,菌株ZK靈芝酸A含量高于菌株SC且含有赤芝酸A、靈芝酸E、靈芝酸F等其他成分,菌株SC三萜有效成分種類少且含量低,說明兩菌株三萜成分存在一定差異,通過HPLC指紋圖譜可將這兩種靈芝菌種區(qū)分開。

圖5 標準樣品的指紋圖譜Fig.5 The fingerprint of standard samples

圖6 子實體三萜指紋圖譜Fig.6 The fingerprint of hyphae triterpene of fruiting body 注:S1表示參考菌株(ZK),S2表示野生菌株(SC)。

3 結(jié)論

本實驗從形態(tài)學(xué)特征結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)手段鑒定了野生菌株屬于Ganodermaflexipes。其菌絲潔白濃密,生長速率(0.158 cm/d)顯著低于參考菌株(p<0.05)。野生菌株在液體深層發(fā)酵中菌絲生物量(0.269 g/100 mL)極顯著高于參考菌株(p<0.01),發(fā)酵液多糖含量極顯著低于參考菌株(p<0.01),菌絲三萜含量(8.85 mg/g)顯著高于參考菌株(p<0.05)?？梢娨吧暌后w深層發(fā)酵除了菌絲生物量較高效果并不理想。液體深層發(fā)酵在食藥用菌產(chǎn)品的生產(chǎn)上占據(jù)重要地位,先后在蟲草、牛樟芝、長根菇、白靈菇等得到廣泛應(yīng)用[25-28]。食用菌液體發(fā)酵技術(shù)主要涉及培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵過程的動態(tài)調(diào)控等方面[29]。

野生菌株子實體多糖含量(23.70 mg/g)極顯著高于參考菌株(p<0.01),是參考菌株的2.56倍;三萜含量(9.67 mg/g)顯著高于參考菌株(p<0.05)。由HPLC指紋圖譜分析可知,野生菌株含有效三萜成分種類少,主要是靈芝酸A,且含量低,說明野生菌株三萜的含量較高但質(zhì)量不高。人工栽培靈芝所需周期長、抗外界環(huán)境因素干擾弱以及存在活性成分波動大等缺點[30],可以進一步優(yōu)化栽培技術(shù),使該野生彎柄靈芝成為提取多糖的優(yōu)良菌株。

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IdentificationofawildGanodermaflexipesandstudyonthecontentofpolysaccharidesandtriterpenoids

ZHAOLi-li,YELi-yun,XIEFan,TANGKun-peng,WUXiao-ping*

(Mycological Research Center of Fujian Agricultural and Forestry University, JUNCAO National Engineering Technology Research Center,Fuzhou 350002,China)

The wild-type strain was identified by comparison of biological characteristics and ITS sequencing. The contents of polysaccharides and triterpenoids in this strain were evaluated by submerged fermentation and effective component analysis. The results confirmed that the wild-type strain wasG.flexipes. Active ingredient analysis showed that triterpenoids in mycelial(8.85 mg/g)and fruiting body(9.67 mg/g)of wild-type strain were significantly higher as comparing with the reference strain(p<0.05).However,polysaccharides content were significantly lower in fermentation broth(6.59 mg/mL)of wild-type strain than that of the reference strain(p<0.01). Whereas,polysaccharides(23.70 mg/mL)were 2.56 times higher in fruiting body of wild-type strain as comparing with the reference strain(p<0.01). HPLC analysis of the fruiting body extract showed a low prominent single peak with others non-significant low peaks of triterpenoids in the wild-type strain. Results also indicated that the wild-type strain has great potential for polysaccharides production and extraction of these components could be increased with optimized cultivation techniques.

Ganodermaflexipes;ITS sequencing;polysaccharides;triterpenoids;HPLC fingerprinting

2017-03-04

趙麗麗(1992-),女,碩士研究生,從事食用菌遺傳育種方面的研究,E-mail:18363833962@163.com。

*

吳小平(1965-),男,博士,教授,從事食用菌教學(xué)與科研方面的研究,E-mail:fjwxp@126.com。

福建省食用菌產(chǎn)業(yè)重大農(nóng)技推廣服務(wù)試點項目(KNJ-153013)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)21-0137-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.028