堿性成纖維細胞生長因子對大鼠II度燒傷傷口的促愈合作用

林蓓蓓,郁引飛

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 藥劑科,浙江 溫州 325027)

堿性成纖維細胞生長因子對大鼠II度燒傷傷口的促愈合作用

林蓓蓓,郁引飛

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 藥劑科,浙江 溫州 325027)

目的:通過堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)在大鼠Ⅱ度燒傷傷口中的局部應(yīng)用,觀察其對燒傷傷口愈合和燒傷創(chuàng)面愈合各個階段中相關(guān)因子的作用.方法:10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠.采用同體對照的方法,用砝碼在其背部以脊柱為對稱軸,做2個直徑為2 cm的燒傷創(chuàng)面,2個創(chuàng)面間距>1.5 cm.右邊傷口給予不同濃度的bFGF,左邊傷口給予等體積的0.9%氯化鈉溶液為對照.隨機分成3組,每組15只,分別給予125、500和2 000 ng bFGF.隔天給藥1次至第14天.在造模后3 d、7 d、14 d、21 d和28 d處死大鼠,并取下傷口組織進行包埋切片.采用Masson染色法檢測組織中膠原的產(chǎn)生,并用免疫組織化學(xué)法檢測組織中巨噬細胞標記蛋白(CD68)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、增殖細胞核抗原(PCNA)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的表達.結(jié)果:傷口愈合率統(tǒng)計顯示bFGF可以促進大鼠皮膚燒傷傷口愈合.Masson染色顯示bFGF可以促進傷口肉芽組織形成和膠原產(chǎn)生.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示bFGF可以調(diào)節(jié)傷口中CD68、MMP-2、PCNA和TGF-β1的表達.結(jié)論:bFGF可以調(diào)節(jié)傷口中CD68、MMP-2、PCNA和TGF-β1的表達從而促使大鼠II度燒傷傷口愈合.

堿性成纖維細胞生長因子;II度燒傷;傷口愈合;大鼠

在所有的損傷中,燒傷被認為是引起年輕群體死亡率上升的主要原因之一.然而,到目前為止,除了皮膚的自體移植,幾乎不存在有效方法幫助大面積的燒傷傷口愈合.

傷口愈合的早期階段以炎癥為主,之后傷口慢慢修復(fù)與重塑[1].這個過程需要各種組織和各細胞間相互合作,包括炎癥細胞、成纖維細胞、角質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞等.這些細胞受到細胞因子、生長因子和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)分子的調(diào)節(jié)[2].傷口部位的炎癥細胞、角質(zhì)細胞和成纖維細胞會產(chǎn)生和釋放各種生長因子[3].研究表明,局部應(yīng)用外源性生長因子和細胞因子可以加速急性和慢性傷口的修復(fù)[4].

堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是生長因子家族的成員之一,它可以誘導(dǎo)DNA的合成和血管新生,刺激ECM的合成,降低I型膠原的合成[5].研究表明,bFGF應(yīng)用到皮膚傷口可以促進皮膚急慢性傷口的愈合[6].此外,bFGF基因敲除小鼠皮膚傷口愈合非常緩慢[7],這些研究都表明,bFGF在傷口愈合中起關(guān)鍵性作用.但是關(guān)于bFGF對促進燒傷的愈合作用的相關(guān)機制研究較少.本研究檢測了bFGF在大鼠皮膚燒傷中的作用,并進一步探索了bFGF在傷口愈合各個階段中可能影響的促愈合相關(guān)蛋白的表達.

1 材料與方法

1.1 模型建立 清潔級雌性SD大鼠,體質(zhì)量200~220 g,由上海斯萊克實驗動物中心提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2012-0028.參照文獻[8]報道的方法構(gòu)建大鼠II度燒傷模型,用8%的水合氯醛腹腔注射麻醉,固定于簡易操作臺,剪去背部毛發(fā),用碘伏對背部皮膚進行消毒.將在熱水浴中加熱的砝碼在其背部以脊柱為對稱軸,做2個相距1.5 cm以上直徑2 cm的傷口.右邊傷口給予bFGF,左邊給予等量的0.9%氯化鈉溶液.

1.2 分組 對照組:n=45,0.9%氯化鈉溶液0.5 mL;實驗組(bFGF混合0.9%氯化鈉溶液稀釋至0.5 mL):高劑量組,n=15,bFGF濃度為4 000 ng/mL;中劑量組,n=15,bFGF濃度為1 000 ng/mL;低劑量組,n=15,bFGF濃度為250 ng/mL;

1.3 給藥途徑及治療時間 給藥方法:傷口涂抹0.5 mL的bFGF或0.9%氯化鈉溶液后,無菌紗布包扎傷口,隔天換藥至14 d.

1.5 傷口愈合評價 分別于21 d和28 d量取傷口未愈合面積(用透明的紙畫下傷口面積,再將畫下的面積復(fù)印到坐標紙上,數(shù)格計算出面積),計算比較傷口愈合率.傷口愈合率(%)=(開始時傷口面積-取材日傷口面積)/開始時傷口面積X100%[8].

1.6 病理學(xué)評價 分別在造模后3、7、14、21、28 d取bFGF與相應(yīng)的0.9%氯化鈉溶液的組織塊,每個時間點取3只大鼠,進行石蠟包埋,切片.進行Masson染色,光鏡觀察;免疫組織化學(xué)染色方法分別檢測巨噬細胞標記蛋白(CD68)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)蛋白表達量.切片脫蠟脫水,高壓抗原修復(fù),山羊血清封閉,37 ℃孵育30 min,分別滴加鼠抗CD68(1:100稀釋)、鼠抗PCNA(1:100稀釋)、兔抗MMP-2(1:100稀釋)、兔抗TGF-β1(1:100稀釋),4 ℃過夜,37 ℃復(fù)溫30 min,滴加山羊抗兔FITC IgG(H+L)(1:200稀釋)、羊抗兔IgG-HRP(1:200稀釋)、羊抗鼠IgG-HRP(1:200稀釋),37 ℃孵育120 min,PBS溶液沖洗,DAB顯色,脫水,樹膠封片,顯微鏡觀察.每張切片隨機選3個高倍視野觀察相應(yīng)的陽性細胞分布.判斷標準:顯微鏡下觀察并計數(shù)陽性細胞數(shù),鏡下胞質(zhì)或胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞,無棕黃色顆粒者為陰性.

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理方法 所有數(shù)據(jù)均采用Graphpad prism統(tǒng)計軟件分析.計量資料以表示,傷口愈合率結(jié)果采用配對t檢驗,各實驗組間愈合率比較采用單因素方差分析,免疫組織化學(xué)結(jié)果分析采用秩和檢驗.P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 bFGF促進大鼠燒傷傷口愈合 在大鼠傷口部位放上比初始傷口面積稍大的由硬紙板剪成的正方形框,拍攝照片并進行圖像分析,如圖1所示,在21 d和28 d時,對照組的愈合率分別為65.19%±3.34%、88.77%±1.69%,實驗組的愈合率:低劑量組分別為84.79%±2.43%、97.53%±0.69%,中劑量組分別為86.31%±2.19%、97.68%±0.94%,高劑量組分別是81.34%±2.81%、96.99%±1.17%,給予bFGF治療的傷口的愈合速度明顯比對照組的傷口愈合速度快(P<0.05).中劑量促傷口愈合效果相對較好,但是各實驗組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),所以在后面的病理分析中選擇低劑量組作為實驗組.

圖1 4組創(chuàng)面在0、21、28 d的傷口愈合情況

2.2 Masson染色結(jié)果 Masson染色可將組織中膠原纖維染成綠色,如圖2所示,在3 d時所有組別的皮膚上皮都深染壞死,層次增厚,表面有血痂,上皮下真皮纖維變性;與對照組比,實驗組的真皮變性更加嚴重,并有空泡樣的變性;在7、14 d時,實驗組的真皮纖維比對照組有更多的水腫壞死,結(jié)構(gòu)破壞,毛囊及腺體壞死變性固縮,并且壞死的組織也開始被清除;在21 d時,表面血痂剝脫,壞死組織被清除,組織重塑,膠原生成,實驗組的皮膚膠原排列更加清晰,有新生血管形成;在28 d時,對照組的膠原纖維排列紊亂,而實驗組的膠原排列致密清晰.

2.3 bFGF調(diào)節(jié)傷口中CD68的表達水平 在清除壞死組織的早期(3、7、14 d時),實驗組中CD68表達量明顯高于對照組(P<0.05);在組織的重塑后期(21 d時),實驗組的CD68表達量低于對照組(P<0.05),見圖3.

圖2 造模后不同時間點的傷口組織切片Masson染色(X400)

2.4 bFGF影響傷口中TGF-β1的水平 實驗組在給藥14 d、21 d后,TGF-β1的表達量高于對照組(P<0.05),而28 d時TGF-β1的表達量下降(P<0.05),見圖4.

圖3 bFGF對傷口中CD68表達的影響

2.5 bFGF對傷口中PCNA水平的影響 在7、14和21 d時,實驗組PCNA蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.05);在28 d時實驗組與對照組的PCNA蛋白表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖5.

2.6 bFGF影響傷口中MMP-2的水平 MMP-2在創(chuàng)面愈合早期(14 d)表達較高,并且實驗組表達要高于對照組(P<0.05).而在21 d和28 d時,MMP-2的表達逐漸降低,但實驗組表達仍要高于對照組(P<0.05),見圖6.

一旦自動制動手柄放置在此位置，列車管迅速減壓到零，均衡風(fēng)缸以常用制動速率減壓到零，16CP模塊響應(yīng)列車管減壓變化，迅速給作用管（16#管）充風(fēng)到最大允許壓力，BCCP模塊響應(yīng)作用管壓力增加，給機車制動缸充風(fēng)產(chǎn)生緊急制動作用；同時車輛副風(fēng)缸給車輛制動缸充風(fēng)，車輛制動機制動。

3 討論

bFGF作為一種重要的促有絲分裂原,能夠促進組織修復(fù),誘導(dǎo)細胞外基質(zhì)沉積,刺激結(jié)締組織增生,加速上皮細胞移行增殖,現(xiàn)已證明許多生長因子在創(chuàng)面修復(fù)中具有重要作用[9-10],且已有用含bFGF的人造真皮用于燒傷創(chuàng)面修復(fù)等[11].然而,bFGF在大鼠II度燒傷傷口愈合的作用及其分子機制還未見報道.為此,我們構(gòu)建了大鼠燒傷模型,考察不同劑量的bFGF對于傷口愈合的作用,并設(shè)置給予0.9%氯化鈉溶液的空白對照組.在證實bFGF促創(chuàng)傷愈合的作用基礎(chǔ)之上,采用Masson染色和免疫組織化學(xué)分析證實bFGF通過促進創(chuàng)傷中膠原蛋白的形成和炎癥反應(yīng)從而加速了這一燒傷愈合的過程.

燒傷傷口愈合是個復(fù)雜的過程.燒傷傷口中的一些印跡激活炎癥細胞,而這些炎癥細胞一旦激活,會釋放炎癥因子,并結(jié)合生長因子試圖去清除引起傷口損傷的介質(zhì).隨后,細胞因子和生長因子開始修復(fù)由于燒傷摧毀的表皮,使皮膚再上皮化,并觸發(fā)受傷真皮層中的成纖維細胞增殖[12].炎癥反應(yīng)主要是清除受損的組織碎片.中性白細胞和巨噬細胞中的溶酶體,活性氧的代謝物,花生四烯酸類代謝物像白三烯類和前列腺素類在炎癥過程中起著非常重要的作用.這些炎癥介質(zhì)也有能力引起內(nèi)皮損傷和組織損傷,它們可能會加劇燒傷部位的損害[12].燒傷傷口愈合的另一個過程是血管新生,肉芽組織生成,細胞外基質(zhì)蛋白合成,膠原蛋白存儲和組織重塑.

圖4 bFGF對傷口中TGF-β1表達的影響

研究表明,bFGF可以作用于巨噬細胞并促進巨噬細胞表達促重塑因子TGF-β1[13].外源性應(yīng)用bFGF能夠通過提高TGF-β1的分泌,進而協(xié)同其他生長因子對肌成纖維細胞形成和凋亡發(fā)揮作用,最終影響愈合的結(jié)局[14].通過CD68免疫組織化學(xué)染色表明,經(jīng)bFGF治療后顯著的增加了燒傷修復(fù)早期3 d、7 d和14 d的巨噬細胞標記蛋白CD68.這表明在創(chuàng)傷修復(fù)炎癥階段早期,bFGF可以趨化炎癥細胞像傷口部位聚集.而在燒傷修復(fù)后期bFGF治療組的減少,這也表明炎癥得到了控制,可以進入燒傷修復(fù)的下一階段.再將組織切片進行TGF-β1免疫組織化學(xué)染色,創(chuàng)面14 d和21 d時,實驗組TGF-β1的表達較對照組高.TGF-β1可以引起成纖維細胞中膠原的合成[15].這一結(jié)果意味著bFGF是通過增加傷口部位的TGF-β1的合成從而促進了膠原的產(chǎn)生.在體內(nèi)不同微環(huán)境的影響下,巨噬細胞可以被極化為經(jīng)典活化的M1型巨噬細胞或選擇性活化的M2型巨噬細胞[16].M1型巨噬細胞在IFN-α、TNF-γ的誘導(dǎo)下生成,可分泌IL-1、IL-2等促進炎性細胞因子和趨化因子,參與殺傷病原體微生物,導(dǎo)致機體組織炎癥和免疫損傷;而M2型巨噬細胞在IL-4、IL-13的誘導(dǎo)下生成,可分泌IL-10、TGF-β等抗炎性細胞因子,具有限制炎癥反應(yīng)、參與組織修復(fù)重塑的作用.在我們的研究中,傷口經(jīng)bFGF治療后早期炎癥增加,可能這個時期的M1型巨噬細胞多,利于清除壞死細胞和組織,而在14 d、21 d時,實驗組中TGF-β1表達較高,可能實驗組中M1型巨噬細胞較早地進行M2型的轉(zhuǎn)化,促進TGF-β1分泌有利于組織修復(fù).所以,我們的研究表明bFGF可以適當(dāng)?shù)钠胶饩奘杉毎鸐1/M2亞型轉(zhuǎn)化對于調(diào)節(jié)反應(yīng)及加速損傷修復(fù)再生具有重要意義.

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),PCNA與細胞DNA合成關(guān)切,在細胞增殖過程中起重要調(diào)控作用.最近研究報道,PCNA亦可參與許多其他細胞重要活動,如細胞周期調(diào)控、細胞DNA損傷修復(fù)、細胞凋亡、染色體重組及DNA甲基化等.通過PCNA的免疫組化染色表明bFGF顯著增加了傷口部位細胞增殖.有研究表明,PCNA、α-SMA以及IL-1α和胎兒皮膚創(chuàng)傷后無瘢痕愈合可能相關(guān)[17].并且,PCNA表達變化趨勢和血漿IL-1α含量的變化趨勢基本一致,都是先升后下降的過程,說明PCNA蛋白和IL-1α存在相關(guān)性[18].本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致,PCNA和巨噬細胞的含量變化趨勢一致.

MMPs是一組由效應(yīng)細胞分泌、參與細胞外基質(zhì)降解的蛋白酶,影響組織修復(fù)、重塑和瘢痕形成[19].MMPs是創(chuàng)傷早期清除壞死組織的重要物質(zhì),也是上皮細胞遷移覆蓋創(chuàng)面所必需的.隨著修復(fù)進程的延續(xù),在組織愈合后期,MMPs主要定位于皮膚基底膜、血管內(nèi)皮細胞和創(chuàng)傷深部皮膚附件上皮細胞中,另外成纖維細胞中也有表達[20].創(chuàng)面外用bFGF治療14 d,21 d和28 d后,MMP-2的表達高于對照組.這表明bFGF可以促進MMP-2的表達,有利于壞死組織的及時清除,角質(zhì)形成細胞遷移.綜上所述,TGF-β1、PCNA和MMP-2的表達都與炎癥因子存在著相關(guān)性,炎癥階段是傷口愈合的基礎(chǔ),為肉芽組織的形成和組織重塑做準備.

圖5 bFGF對傷口中PCNA表達的影響

在本研究中,我們證明了bFGF可以促進燒傷創(chuàng)面的愈合.bFGF通過調(diào)節(jié)皮膚傷口中CD68、TGF-β1、PCNA和MMP-2的表達從而加速傷口再上皮化、肉芽組織的形成和膠原的產(chǎn)生.在以往關(guān)于bFGF對燒傷創(chuàng)面愈合的研究并不少.但在我們的研究中首次對燒傷創(chuàng)面愈合各個階段中的相關(guān)因子進行了全面的研究.在今后的研究中我們還可以通多細胞層面對這幾個蛋白的相關(guān)性作出更確切的研究.bFGF在臨床上應(yīng)用還需要大量的實驗研究,例如最佳給藥劑量、給藥的時間間隔、治療窗口和bFGF與其他因子在傷口中的協(xié)同作用等,這些都需要被進一步的探討研究.

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圖6 bFGF對傷口中MMP-2表達的影響

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(本文編輯:趙翠翠)

The healing function of basic fibroblast growth factor on the wound of second degree burns in rats

LIN Beibei, YU Yinfei.
Department of Pharmacy, the Eye Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou,325027

Objective:To examine the effect of topical basic fibroblast growth factor (bFGF) on wound healing in a rat skin partial thickness burn wound model.Methods:Female Sprague-Dawley rats were anaesthetized with an intraperitoneal injection of 10% chloralic hydrate (3.5 mL/kg). Hairs on the rat dorsum were clipped and then two partial thickness burn skin flaps were cut per rat. The two wounds were separated by at least 1.5 cm of unwounded skin. The right-side wounds were treated with different doses of bFGF, while the left-side wounds

equal volumes of saline as controls. Wounded rats were randomly divided into three groups (fifteen rats per group) and they were treated with 125, 500 and 2 000 ng of bFGF in right wounds respectively. bFGF treatments were repeated under anesthesia every other day for 14 days. The tissues were harvested and detected with Masson stain and immunohistochemistry to observe the expression of CD68, MMP-2,PCNA and TGF-β1.Results:By quantitative assessment of wound healing, we found that bFGF treatment significantly accelerated the rate of burn wound healing. Masson staining show that bFGF promoted the formation of granulation tissue and collagen production of wound. Immunohistochemical staining showed that the levels of CD68, MMP-2, PCNA and TGF-β1were significantly regulat in bFGF-treated groups compared to control.Conclusion:These findings suggest that bFGF significantly accelerates the healing of partial thickness burn wound healing by regulating the expression of CD68, MMP-2, PCNA and TGF-β1in rats.

basic fibroblast growth factor; partial thickness burn wound; wound healing; rats

R966

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.10.005

2017-02-20

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計劃項目(2016KYB207).

林蓓蓓(1989-),女,浙江蒼南人,藥師,碩士.

郁引飛,主任藥師,Email:wz88068866@163.com.