肝癌小鼠模型中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)樹突狀細(xì)胞的作用

杜勇,黃智銘,林秀清,陳新

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,浙江 溫州 325015,1.兒科;2.消化內(nèi)科)

肝癌小鼠模型中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)樹突狀細(xì)胞的作用

杜勇1,黃智銘2,林秀清2,陳新2

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,浙江 溫州 325015,1.兒科;2.消化內(nèi)科)

目的:構(gòu)建BALB/c小鼠原位肝癌模型,分離腫瘤小鼠體內(nèi)的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)和樹突狀細(xì)胞(DC),研究Tregs對(duì)DC功能的影響.方法:采用肝癌細(xì)胞懸液直接接種BALB/c小鼠肝臟建立原位肝癌模型.模型制作成功后25 d處死動(dòng)物,無菌取出脾臟,用免疫磁珠分選法分離純化肝癌小鼠脾臟中的Tregs、CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞和DC.Tregs和效應(yīng)T細(xì)胞共培養(yǎng),CCK8法檢測(cè)Tregs對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞增殖情況的影響.DC和Tregs直接接觸共培養(yǎng),用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面協(xié)同刺激分子CD80/CD86表達(dá)的變化,ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-12的分泌.結(jié)果:成功構(gòu)建了小鼠原位肝癌模型,并分離出高純度的Tregs、效應(yīng)T細(xì)胞和DC.Tregs在體外能抑制CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞的增殖.DC和Tregs共培養(yǎng)時(shí),Tregs會(huì)下調(diào)DC表面協(xié)同刺激分子CD80/CD86的表達(dá),并抑制DC分泌IL-12和TNF-α.結(jié)論:肝癌小鼠模型中Tregs能抑制DC的功能,從而抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫,針對(duì)Tregs進(jìn)行腫瘤免疫治療是腫瘤治療的新策略.

肝腫瘤;CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;樹突狀細(xì)胞;免疫抑制;小鼠

原發(fā)性肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,傳統(tǒng)的治療手段效果不佳,預(yù)后差.樹突狀細(xì)胞(dentritic cells,DC)疫苗可以有效地提呈腫瘤相關(guān)性抗原,激發(fā)宿主體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗腫瘤細(xì)胞的免疫,故成為近年來腫瘤治療的研究熱點(diǎn)[1].然而機(jī)體的腫瘤免疫抑制微環(huán)境與腫瘤免疫耐受及逃逸不利于免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮有效的抗腫瘤免疫.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)在肝癌患者外周血和腫瘤微環(huán)境中表達(dá)增加,可能與腫瘤免疫逃逸有關(guān)[2].為此,本研究通過建立小鼠原位肝癌模型,研究Tregs對(duì)DC功能的影響,探討腫瘤小鼠體內(nèi)Tregs抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)的作用及機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物:6~8周齡的SPF級(jí)雄性BALB/C小鼠30只,體質(zhì)量18~20 g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002,飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室.所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲本校倫理委員會(huì)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn).

1.1.2 細(xì)胞株:鼠源性H22腹水型肝癌細(xì)胞株購(gòu)自武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心.

1.1.3 主要試劑及儀器:FITC rat anti-mouse CD4及同型對(duì)照FITC rat IgG2b購(gòu)自美國(guó)BD公司;FITC rat anti-mouse CD80及同型對(duì)照FITC rat IgG2b、PE rat anti-mouse CD86及同型對(duì)照PE rat IgG2b、PE rat anti-mouse CD25及同型對(duì)照PE rat IgG2b購(gòu)自美國(guó)eBscience公司;小鼠CD4+CD25+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒及小鼠CD11C免疫磁珠分選試劑盒購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司;CCK8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所;TNF-α、IL-12 ELISA試劑盒購(gòu)自德國(guó)IBL公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司;光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司.

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備:小鼠原位肝癌模型建立的具體步驟參照張海英等[3]的造模法.從液氮中取出凍存的肝癌細(xì)胞,常規(guī)復(fù)蘇后,培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1X107個(gè)/mL,用1 mL BD注射器直接注入小鼠腹腔0.1 mL.8~9 d后無菌抽出癌性腹水,洗滌2次后計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL,造模備用.4%水合氯醛腹腔麻醉小鼠(100 mg/μL),麻醉后,取仰臥位,四肢固定于手術(shù)臺(tái)上,備皮,酒精消毒后,于腹正中線劍突下作一長(zhǎng)約0.8 cm的縱行切口,濕紗布?jí)|于切口下方,輕壓雙側(cè)肋弓,擠出肝左葉,暴露肝臟,用1 mL BD注射器針頭與肝臟成30°角方向斜刺入肝實(shí)質(zhì)后,緩慢注入10 μL肝癌細(xì)胞懸液(104個(gè)細(xì)胞);退出針頭,壓迫止血,輕輕將肝臟送回腹腔,依次縫合肌肉皮膚,關(guān)閉腹腔.術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng),自由飲水進(jìn)食.

1.2.2 組織病理學(xué)檢查:25 d左右,肝癌小鼠模型建造成功.小鼠精神萎靡,活動(dòng)遲緩,大量腹水形成.解剖時(shí)可見肝臟表面有灰白色,質(zhì)偏硬,大小在0.5~1.0 cm范圍內(nèi)的塊狀癌組織.取出癌組織,甲醇溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,切片,HE染色,在光學(xué)顯微鏡下行組織學(xué)觀察.

1.2.3 Tregs的免疫磁珠分選:無菌條件下取出肝癌小鼠脾臟,剪碎,用注射器針芯研磨脾組織后,通過200目鋼網(wǎng)過濾,收集流出的單細(xì)胞懸液,制備脾單個(gè)核細(xì)胞懸液.嚴(yán)格按照Miltenyi的Tregs分離說明書,經(jīng)過陰性及陽性分選后,獲得純化的Tregs和CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞.按照Miltenyi的DC分離說明書進(jìn)行操作,從脾單個(gè)核細(xì)胞懸液中分離獲得DC.通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選出的Tregs、CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞和DC的純度.分別收集分選后的細(xì)胞,培養(yǎng)基洗滌,用于后續(xù)培養(yǎng).用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)分選出的細(xì)胞的存活率,顯微鏡下觀察死亡細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色,活細(xì)胞拒染呈無色透明狀,計(jì)算分選出的活細(xì)胞率均大于95%.

1.2.4 CCK8檢測(cè)增殖抑制試驗(yàn):Tregs(2X104,8X104)和CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞(8X104/孔)按1:4和1:1的比例混合培養(yǎng)在96孔板中,同時(shí)設(shè)對(duì)照組和空白孔,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,每孔加0.5 μg ConA,至終濃度為2.5 μg/mL,用含血清和雙抗的培養(yǎng)基每孔補(bǔ)足至200 μL,放于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,結(jié)束前4 h每孔加10 μL CCK8,用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm處OD值.

1.2.5 Tregs和DC的共培養(yǎng):分選出的Tregs和DC(5X105)以0:1、1:1的比例直接接觸共培養(yǎng)24 h后,加入脂多糖至終濃度為1 μg/mL,并設(shè)相應(yīng)的對(duì)照孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集培養(yǎng)后的細(xì)胞并分離DC,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD80/CD86的表達(dá);ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-12的表達(dá).

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析.計(jì)量資料用表示.進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),符合正態(tài)性分布,2組間比較用t檢驗(yàn);非正態(tài)分布的數(shù)據(jù),2組間比較用Mann-Whitney U檢驗(yàn).P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 肝癌荷瘤小鼠模型建立 解剖肝臟表面可見直徑0.5~1.0 cm大小的灰白色質(zhì)地偏硬的癌組織包塊,癌組織常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色.光學(xué)顯微鏡下觀察到肝臟失去正常結(jié)構(gòu),壞死明顯,癌細(xì)胞呈多角形或圓形,排列成巢而無間質(zhì)成分,排列紊亂,細(xì)胞大小不一,異形性明顯,見圖1.

2.2 Tregs和CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞的分離結(jié)果 肝癌小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞按照Miltenyi的Tregs分離說明書經(jīng)過免疫磁珠陰性分選和陽性分選后,分別獲得Tregs和CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞.肝癌小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞按照Miltenyi的DC分離說明書進(jìn)行操作,獲得DC.流式細(xì)胞儀檢測(cè)Tregs純度>90%,CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞純度>90%,DC純度>90%;見圖2-4.

圖1 肝癌組織標(biāo)本及病理學(xué)檢查結(jié)果

圖2 免疫磁珠分選后DC的純度

圖3 免疫磁珠分選后CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞的純度

2.3 CCK8檢測(cè)Tregs抑制CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞的增殖 當(dāng)Tregs與CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞比為1:4混合共培養(yǎng)時(shí),抑制率為23.61%.當(dāng)Tregs與CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞比為1:1混合共培養(yǎng)時(shí),抑制率為53.95%,CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞孔OD值為(1.28±0.09),Tregs與CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞比為1:1混合共培養(yǎng)時(shí),OD值為(0.82±0.03),2組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.616,P<0.05).純化的Tregs對(duì)CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用,見圖5.

圖4 免疫磁珠分選后Tregs的純度

圖5 Tregs和CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞1:1共培養(yǎng)時(shí),Tregs對(duì)CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞增殖的影響

2.4 分選純化后的各組形態(tài)DC 分為3組,DC單獨(dú)培養(yǎng)(DC組);DC單獨(dú)培養(yǎng)經(jīng)LPS刺激活化(DC+LPS組);DC與Tregs直接接觸共培養(yǎng)24 h后,再經(jīng)LPS(1 μg/mL)刺激活化(DC+Tregs+LPS組).光學(xué)顯微鏡下DC和Tregs各細(xì)胞形態(tài),見圖6.

2.5 Tregs抑制DC表面協(xié)同刺激分子的表達(dá)及細(xì)胞因子的分泌 LPS刺激活化的DC表達(dá)高水平的協(xié)同刺激分子CD80/CD86,并分泌大量的免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)TNF-α和IL-12,當(dāng)Tregs和DC共培養(yǎng)時(shí),Tregs會(huì)抑制DC表面協(xié)同刺激分子的表達(dá)和細(xì)胞因子的分泌.當(dāng)Tregs和DC以1:1比例直接接觸共培養(yǎng)后,共培養(yǎng)組DC表面CD80的表達(dá)明顯低于DC+LPS組中DC表面CD80的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(209.4±25.8 vs.859.4±47.0,t=27.104,P<0.05);共培養(yǎng)組DC表面CD86的表達(dá)明顯低于DC+LPS組中DC表面CD86的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(312.0±40.1 vs.1 083.4±68.6,t=21.707,P<0.05),見圖7.Treg和DC共培養(yǎng)組上清液中TNF-α的表達(dá)明顯低于DC+LPS組中TNF-α的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(275.4±19.7 vs. 578.0±49.2,t=12.781,P<0.05);共培養(yǎng)組上清液中IL-12的表達(dá)明顯低于DC+LPS組中IL-12的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(163.4±11.5 vs.411.2±29.1,t=17.686,P<0.05),見圖8.

圖6 光學(xué)顯微鏡下的DC和Tregs

圖7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子CD80/CD86的表達(dá)

3 討論

Tregs在維持機(jī)體的免疫耐受中發(fā)揮重要的作用,能抑制CD4+Th細(xì)胞、CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞、自然殺傷性細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能.近年來研究發(fā)現(xiàn),Tregs除了在自身免疫性疾病、哮喘、感染等方面發(fā)揮著作用,在腫瘤免疫方面也起著重要的作用,在胃癌、肝癌等多種腫瘤患者體內(nèi)均有增多,其數(shù)量的增多預(yù)示癌癥患者的預(yù)后變差[4-5],而去除Tregs可以增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫[6]. 在肝癌小鼠模型中,靶向藥物索菲尼通過抑制Tregs的增殖和誘導(dǎo)其凋亡,從而產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答[7].在III期臨床試驗(yàn)?zāi)[瘤患者中,通過ipilimumab單抗阻斷CTLA-4可達(dá)到治療效果[8].腫瘤免疫是以細(xì)胞免疫為主的免疫反應(yīng),腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞是宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)的重要途徑之一.研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤微環(huán)境中雖然有大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),但廣泛的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)并沒有控制腫瘤的發(fā)生及生長(zhǎng),提示腫瘤局部免疫監(jiān)視和控制的失敗.腫瘤細(xì)胞可以通過擴(kuò)增或招募Tregs,抑制機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫作用. Tregs可通過一系列的機(jī)制抑制機(jī)體的免疫功能,包括依賴抑制性細(xì)胞因子的途徑、溶解細(xì)胞的途徑、破壞細(xì)胞代謝的途徑和調(diào)節(jié)抗原提呈細(xì)胞功能的途徑[9-10].

圖8 Tregs和DC直接接觸共培養(yǎng)后上清液中TNF-α和IL-12的表達(dá)

DC是已知的體內(nèi)抗原提呈功能最為強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞,是連接固有免疫和獲得性免疫的橋梁,在腫瘤免疫中起到十分重要的作用.在抗原提呈過程中,活化的DC會(huì)表達(dá)高水平的CD80/CD86,分泌大量的免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)TNF-α和IL-12來激活初始和記憶性T細(xì)胞,誘導(dǎo)抗原特異性CTL活化和增殖,從而殺傷腫瘤細(xì)胞.以DC為基礎(chǔ)制備的DC腫瘤疫苗,可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤免疫應(yīng)答能力,在臨床免疫治療試驗(yàn)中顯示出一定的治療效果.但腫瘤患者體內(nèi)常常存在DC數(shù)量的減少和功能的缺陷.在大鼠肝癌模型中,Tregs表達(dá)增高,而DC存在功能障礙.

本研究發(fā)現(xiàn)Treg和效應(yīng)T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),Tregs能顯著抑制CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞的增殖,且抑制率隨Tregs濃度的增大而增大.當(dāng)Tregs與DC直接接觸共培養(yǎng)時(shí),Tregs可通過下調(diào)DC表面的CD80/CD86協(xié)同刺激分子,降低抗原提呈細(xì)胞活化T細(xì)胞的能力,并通過抑制DC TNF-α和IL-12的分泌,抑制T細(xì)胞的活化.

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(本文編輯:吳彬)

The influence of regulatory T cells on dendritic cells in mice with hepatocellular carcinoma

DU Yong1,HUANG Zhiming2, LIN Xiuqing2, CHEN Xin2.
1.Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Gastroenterology and Hepatology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To investigate how CD4+CD25+regulatory T cells (Tregs)impacted on dendritic cells which were separated from BALB/c mice with hepatocellular carcinoma.Methods:BALB/c mice with hepatocellular carcinoma were established in laboratory. Twenty-five days after the models, the tumor-bearing mice were sacrificed and fresh spleen tissues were separated. Tregs, CD4+CD25-T cells and dendritic cells were separated from the mice's spleen and purified by immuno-magnetic beads according to the manufacturers' instructions. Tregs were co-cultured with CD4+CD25-T cells and the proliferation experiment was measured with CCK8. Tregs were directly co-cultured with dendritic cells and then the expression of CD80/CD86 on dendritic cells was detected by flow cytometry. The levels of TNF-α and IL-12 in supernatants were detected by ELISA.Results:We successfully established the tumor model of hepatocellular carcinoma and obtained high purity of Tregs, CD4+CD25-T cells and dendritic cells. Tregs could suppress the proliferation of CD4+CD25-T cells in vitro. Tregs could down-regulate the expression of CD80/CD86 on dendritic cells and inhibit the expression of TNF-α and IL-12.Conclusion:Tregs play an important role in the establishment and persistence of tumor immune suppression. Tregs can inhibit the function of dendritic cells in tumor-bearing mice. So Tregs may be a promising therapeutic target for cancer.

hepatocellular carcinoma; CD4+CD25+regulatory T cells; dendritic cells; immunosuppression;mice

R392

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.10.004

2017-03-14

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(Y2090660).

杜勇(1986-),女,浙江溫州人,住院醫(yī)師,碩士.

黃智銘,主任醫(yī)師,Email:wfyhzm@163.com.