大網(wǎng)膜包埋移植肝臟去細(xì)胞生物支架血管化過(guò)程觀察

黃俊杰,王志斌,陳納,張建色,王志翊,黎婷,戴開(kāi)宇,梅勁,樓新法

(1.溫州醫(yī)科大學(xué) 生物支架移植與免疫研究所,浙江 溫州 325035;2.溫州醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院,浙江 溫州 325035;3.浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普外科,浙江 杭州 310058)

.論 著.

大網(wǎng)膜包埋移植肝臟去細(xì)胞生物支架血管化過(guò)程觀察

黃俊杰1,3,王志斌1,陳納2,張建色1,王志翊1,黎婷1,戴開(kāi)宇1,梅勁1,樓新法1

(1.溫州醫(yī)科大學(xué) 生物支架移植與免疫研究所,浙江 溫州 325035;2.溫州醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院,浙江 溫州 325035;3.浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普外科,浙江 杭州 310058)

目的:觀察肝臟去細(xì)胞生物支架(AHS)大網(wǎng)膜包埋移植后的血管新生過(guò)程.方法:采用TritonX-100灌注法制備大鼠肝臟AHS,HE染色、掃描電鏡、鑄型、DNA含量檢測(cè)、免疫熒光染色等方法鑒定去細(xì)胞效果;通過(guò)大網(wǎng)膜包埋移植肝臟AHS,分別于術(shù)后1、3、7、14、28 d處死大鼠,病理切片HE染色觀察移植肝臟AHS血管新生過(guò)程.結(jié)果:灌注法制備的肝臟AHS空間結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)成分保留完整,細(xì)胞成分基本被去除,AHS組DNA含量與正常對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);大網(wǎng)膜包埋移植肝臟AHS術(shù)后3 d,靠近網(wǎng)膜移植區(qū)的支架內(nèi)出現(xiàn)血竇,術(shù)后7 d出現(xiàn)新生血管,并逐漸向移植支架中心區(qū)域延伸,血管逐步分化成熟,14 d以后形成血管化網(wǎng)狀組織,28 d以后血管化網(wǎng)狀組織仍存在.結(jié)論:大網(wǎng)膜包埋移植促使肝臟AHS再細(xì)胞化,最終可形成血管化的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu).

肝臟;去細(xì)胞;血管;組織工程;大鼠

再造一個(gè)可供移植的肝臟組織或類器官是肝臟組織工程學(xué)的最終目標(biāo),除種子細(xì)胞外,支架材料是誘導(dǎo)種子細(xì)胞黏附、增殖、分化并維持功能的重要載體,也是構(gòu)建組織工程肝臟的基礎(chǔ).肝臟去細(xì)胞生物支架(acellular hepatic scaffolds,AHS)制備技術(shù)改變了傳統(tǒng)天然細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)和人工合成高分子聚合物等支架材料結(jié)構(gòu)成分單一、生物相容性差等缺點(diǎn),正常肝臟ECM的主要成分及其組成的三維空間結(jié)構(gòu)如肝動(dòng)靜脈、門靜脈和膽道等管道均得到完整保留[1],還能夠誘導(dǎo)各類干細(xì)胞向類肝細(xì)胞分化[2-3],是理想的可用于生物人工肝、器官重構(gòu)等研究的生物支架材料.支架材料血管化是實(shí)現(xiàn)組織工程肝臟的體外培養(yǎng)構(gòu)建與體內(nèi)移植的重要途徑,目前肝細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)的氧和營(yíng)養(yǎng)供給主要來(lái)自與培養(yǎng)液的滲透交換,這不但限制了肝細(xì)胞培養(yǎng)的數(shù)量與質(zhì)量,也使得體外構(gòu)建的組織工程肝臟無(wú)法通過(guò)血管縫合方式直接進(jìn)行體內(nèi)移植.為此本研究通過(guò)體內(nèi)大網(wǎng)膜包埋移植AHS,動(dòng)態(tài)觀察移植支架血管化過(guò)程,為后續(xù)深入研究移植支架中的血管再生機(jī)制以及體外AHS血管化組織構(gòu)建提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康10周齡雄性SD大鼠50只,體質(zhì)量(200±20)g,由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(浙)2010-0044.采用完全隨機(jī)法將SD大鼠分為AHS制備組(n=10)、正常對(duì)照組(n=10)和ASH大網(wǎng)膜包埋移植組(n=30,分移植術(shù)后1、3、7、14、28 d組,每組6只),正常對(duì)照組用于獲取正常肝臟和大網(wǎng)膜組織標(biāo)本.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》執(zhí)行.

1.2 主要試劑與儀器 TritonX-100(美國(guó)Sigma公司);肝素鈉(美國(guó)Sigma公司);PBS(美國(guó)Gibco公司);丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS,上海奔流化工技術(shù)有限公司);DNA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Omega公司);I型膠原(COL1)、IV型膠原(COL4)、纖維連接蛋白(FN)、層黏連蛋白(LN)抗體(美國(guó)Invitrogen公司);青霉素、鏈霉素(上海薄蘊(yùn)生物有限公司);Long pump蠕動(dòng)泵(YX1515X-A,保定蘭格恒流泵有限公司);超級(jí)潔凈工作臺(tái)(DL-CJ-1N,北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);恒溫循環(huán)水槽(HX-105,北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器公司);熒光顯微鏡(美國(guó)Olympus公司).

1.3 肝臟AHS的制備及鑒定

1.3.1 肝臟AHS的制備:SD大鼠經(jīng)5%水合氯醛(6 μL/g)行腹腔注射麻醉后,碘伏消毒,打開(kāi)腹腔,門靜脈插管,50 mL肝素PBS沖洗去除肝內(nèi)殘余血液后游離肝臟,放置無(wú)菌培養(yǎng)皿中,在無(wú)菌超凈臺(tái)上,37 ℃下調(diào)整門靜脈灌注液流速為0.9 mL/min,灌注壓調(diào)至40 mmHg,依次灌注300 mL肝素PBS,1 000 mL溶解于PBS(pH=12.0~12.5)的1% Triton X-100,500 mL乙醇與0.3%過(guò)氧乙酸溶液,2 000 mL添加青霉素和鏈霉素的PBS溶液.灌注后的肝臟去細(xì)胞支架于4 ℃的含有青霉素和鏈霉素的PBS溶液中無(wú)菌密封保存,用于大網(wǎng)膜包埋移植.

1.3.2 肝臟AHS鑄型制備:將ABS、丙酮、油畫顏料相混,充分?jǐn)噭?ABS濃度為5%,分別配成紅、藍(lán)、黃3種顏色.從AHS的肝總動(dòng)脈插管灌入紅色填充劑,門靜脈插管灌入藍(lán)色填充劑,下腔靜脈插管灌入黃色填充劑,灌注壓力為20~45 mmHg.分別隔2、6、12 h后再補(bǔ)灌,補(bǔ)灌壓力為40~60 mmHg,直至肝表面出現(xiàn)細(xì)小均勻的紅、藍(lán)、黃點(diǎn).灌注完畢后于4 ℃冰箱中放置24 h使填充劑凝固成型,再置于36.5%鹽酸溶液中腐蝕1周后,將標(biāo)本用流水緩慢沖洗干凈.

1.3.3 HE染色觀察:正常對(duì)照組的大鼠肝臟與肝臟AHS經(jīng)4%多聚甲醛固定,酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋后切片,HE染色后光鏡下觀察.

1.3.4 免疫熒光染色:石蠟切片厚度5 μm,常規(guī)脫蠟至水,并進(jìn)行抗原修復(fù),然后用PBS漂洗每5 min 3次;2% BSA在37 ℃濕盒內(nèi)封閉30 min;分別加入兔抗大鼠COL1、COL4、FN、LN抗體(通常1:100稀釋,用0.01 mol/L pH值7.4的PBS稀釋),4 ℃過(guò)夜;PBS漂洗5 min,共3次;加熒光標(biāo)記的二抗抗體,37 ℃濕盒避光孵育30 min;避光PBS漂洗5 min,共3次;室溫4'6-二脒基-2-苯基吲哚(4'6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)復(fù)染10 min,PBS沖洗5 min,共1次; 甘油緩沖液封片;熒光顯微鏡下觀察,胞核呈藍(lán)色熒光,COL1、COL4、FN、LN的表達(dá)為綠色熒光.

1.3.5 掃描電鏡觀察:將正常肝臟和肝臟AHS組織標(biāo)本切成小于1.0 mm3大小的組織塊,0.9%氯化鈉溶液漂洗,2%戊二醛溶液固定,經(jīng)PBS漂洗,用1%鋨酸固定液固定后,乙醇梯度脫水,干燥、鍍膜,置于電鏡下觀察.

1.3.6 正常肝臟與肝臟AHS組織DNA含量測(cè)定:取正常肝臟和肝臟AHS組織標(biāo)本100 mg,經(jīng)蛋白酶K酶解后,提取基因組DNA(按照DNA試劑盒說(shuō)明操作),微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度.

1.4 大網(wǎng)膜包埋移植肝臟AHS及其血管化過(guò)程觀察

用75%乙醇擦洗無(wú)菌超凈臺(tái)3遍,將密封保存的肝臟AHS切成約8 mmX8 mmX8 mm大小的立方體,用大網(wǎng)膜對(duì)支架進(jìn)行包裹并縫合后,將移植物置入腹腔,分別于術(shù)后1、3、7、14、28 d處死大鼠,獲取大網(wǎng)膜包埋AHS移植物,HE染色動(dòng)態(tài)觀察支架內(nèi)血管新生過(guò)程.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理.計(jì)量資料用表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn).P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 肝臟AHS的鑒定

2.1.1 肝臟AHS組織形態(tài)與結(jié)構(gòu):肝臟在灌注過(guò)程中顏色逐漸變淺,最后成為半透明狀,肉眼可見(jiàn)清晰完整的白色分支狀脈管結(jié)構(gòu).HE染色顯示正常肝臟組織結(jié)構(gòu)清楚、肝細(xì)胞條索狀排列、細(xì)胞核清晰;在匯管區(qū)可見(jiàn)肝動(dòng)脈、門靜脈、膽管的分支,見(jiàn)圖1A;掃描電鏡可見(jiàn)正常肝臟為大量的肝細(xì)胞整齊排列,見(jiàn)圖1B;肝臟AHS呈透明"蜂窩狀",僅可見(jiàn)細(xì)胞外基質(zhì)成分,肝小葉、血管和膽管內(nèi)均無(wú)細(xì)胞殘留,無(wú)細(xì)胞核結(jié)構(gòu),但肝臟特有的小葉狀結(jié)構(gòu)依舊清晰可見(jiàn),中央靜脈和匯管區(qū)管道也保留完整,見(jiàn)圖1C.肝臟AHS細(xì)胞外基質(zhì)呈連續(xù)"漁網(wǎng)狀"結(jié)構(gòu),管腔完整、中空而無(wú)細(xì)胞殘留,見(jiàn)圖1D.肝臟AHS鑄型標(biāo)本顯示肝動(dòng)脈(紅色)、肝靜脈(藍(lán)色)和門靜脈(黃色)主干及其分支管道結(jié)構(gòu)基本完整,走形清晰,見(jiàn)圖1E-F.

2.1.2 2組DNA含量分析:與正常肝臟比,肝臟AHS的DNA含量顯著降低(P<0.01),見(jiàn)表1.

2.1.3 肝臟AHS免疫熒光染色:正常對(duì)照組的肝臟COL1、COL4、FN及LN免疫熒光陽(yáng)性結(jié)果呈綠色,細(xì)胞密集,DAPI熒光顯示藍(lán)色胞核清晰(陽(yáng)性),見(jiàn)圖2A-D.肝臟AHS相應(yīng)區(qū)域可見(jiàn)綠色熒光表達(dá)的COL1、COL4、FN及LN,DAPI熒光顯示綠色胞核清晰(陰性),見(jiàn)圖2E-H.

2.2 大網(wǎng)膜包埋移植肝臟AHS后血管化過(guò)程 實(shí)驗(yàn)過(guò)程未出現(xiàn)大鼠死亡.大網(wǎng)膜包埋移植肝臟AHS術(shù)后1、3、7、14、28 d,肝臟去細(xì)胞支架移植物隨著植入時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸縮小,并失去其原有的形狀.HE染色顯示支架植入1 d后,支架與大網(wǎng)膜邊界清楚,兩者交界處有許多深染的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),見(jiàn)圖3C-D;植入3 d后炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)范圍由交界處逐漸向支架中心蔓延,交界處已有少許血竇,見(jiàn)圖3E-F;植入7 d后支架全部被炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),支架內(nèi)形成較多的新生血管,血管密度由移植支架邊緣區(qū)向中心區(qū)遞減,見(jiàn)圖3G-H;植入14 d后新生血管仍然較多,炎癥細(xì)胞密度較移植第7天時(shí)明顯增加,但支架結(jié)構(gòu)整體呈現(xiàn)萎縮趨勢(shì),見(jiàn)圖3I-J;植入28 d后移植的支架區(qū)域范圍縮小,但依然能夠看到大量新生血管與細(xì)胞,見(jiàn)圖3K-M.

圖1 肝臟AHS組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)圖

表1 正常肝臟與肝臟AHS的DNA含量比較(n=10,)

表1 正常肝臟與肝臟AHS的DNA含量比較(n=10,)

與正常對(duì)照組比:aP<0.01

組別 核酸(μg/μL) 260 nm吸光度值 280 nm吸光度值 260/280正常對(duì)照組 4 350.0±378.0 86.992±12.894 46.692±7.564 1.86±0.32 AHS制備組 211.6± 25.3a 3.890± 0.873 2.251±0.683 5.19±1.67

圖2 正常肝臟與肝臟AHS COL1、COL4、FN和LN免疫熒光染色圖(X200)

3 討論

肝臟是一個(gè)由多管道構(gòu)成的復(fù)雜器官,制備具有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物輸送管道的支架材料是構(gòu)建組織工程肝臟的關(guān)鍵,目前可用于肝臟組織工程的支架材料主要有天然ECM和人工合成支架等,一般為多孔隙結(jié)構(gòu)支架材料,雖然可以為肝細(xì)胞提供黏附生長(zhǎng)空間,但由于沒(méi)有完整的血流灌注通道,加上肝細(xì)胞對(duì)氧需求量旺盛,很難在此基礎(chǔ)上構(gòu)建結(jié)構(gòu)和功能完整的組織工程肝臟.AHS制備技術(shù)的出現(xiàn)突破了傳統(tǒng)支架材料的局限性,在心臟[4]、肺臟[5-6]、腎臟[7]等器官的AHS制備以及再生與重構(gòu)研究領(lǐng)域均取得了顯著進(jìn)展.本研究通過(guò)灌注法制備的大鼠AHS,肝內(nèi)ECM成分及其組成的脈管管道結(jié)構(gòu)如肝動(dòng)脈、肝靜脈、門靜脈、膽道等均得到完整保留,HE染色顯示ECM結(jié)構(gòu)連續(xù)完整,未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核殘留,DNA含量測(cè)定僅為(211.6±25.3)ng/μL,為后續(xù)通過(guò)循環(huán)灌注培養(yǎng)等方式體外構(gòu)建血管化的組織工程肝臟提供了理想的支架材料.此外深入研究AHS的成分與結(jié)構(gòu),可為通過(guò)3D打印等先進(jìn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)肝臟支架材料的規(guī)模研發(fā)提供基礎(chǔ).

支架材料的血管化是實(shí)現(xiàn)體外組織工程肝臟構(gòu)建和移植的重要基礎(chǔ),雖然可將血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于支架材料,構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞化支架材料,方便人工組織的體內(nèi)移植,但是血管內(nèi)皮細(xì)胞在支架材料上存活率低、易凋亡,不能形成功能性血管來(lái)維持移植物中細(xì)胞的氧和營(yíng)養(yǎng)供給[8].簡(jiǎn)單的支架血管內(nèi)皮細(xì)胞化很難與具備完整結(jié)構(gòu)與功能血管的支架材料相比,深入研究體內(nèi)移植支架材料的血管化過(guò)程,是實(shí)現(xiàn)體外支架材料血管化的重要研究途徑.大網(wǎng)膜含有豐富的毛細(xì)血管,具備較強(qiáng)的再生能力,易于和移植支架材料建立廣泛的側(cè)枝循環(huán),是研究支架材料血管化過(guò)程及機(jī)制的重要自體生物反應(yīng)器,在脊髓[9]、骨骼[10]等組織的體內(nèi)移植血管化過(guò)程中均取得了良好的效果.大網(wǎng)膜包埋移植AHS證明移植的支架能在7 d左右形成新生血管,移植支架在14 d左右雖然有部分降解,但形成了結(jié)構(gòu)完整的新生動(dòng)靜脈和微血管網(wǎng),這種血管化的網(wǎng)狀組織結(jié)構(gòu)為體外構(gòu)建血管化AHS提供全新研究平臺(tái).

大網(wǎng)膜包埋移植AHS血管化從動(dòng)態(tài)觀察來(lái)看,是一個(gè)機(jī)體對(duì)外來(lái)支架材料的再加工過(guò)程.首先是炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn),在對(duì)移植支架再加工的基礎(chǔ)上,成纖維細(xì)胞參與了移植支架的重塑,在此基礎(chǔ)上發(fā)生血管新生,并逐步分化成熟.血管生成(angiogenesis)和血管發(fā)生(vasculogenesis)可能參與了這一過(guò)程,在支架近網(wǎng)膜移植側(cè),大網(wǎng)膜通過(guò)血管生成,向移植支架內(nèi)新生血管、炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞通過(guò)血管進(jìn)入到支架內(nèi),對(duì)支架進(jìn)行結(jié)構(gòu)重塑,這一過(guò)程發(fā)生在支架移植早期;在支架重塑基礎(chǔ)上,移植支架內(nèi)逐漸出現(xiàn)新生血管,這些血管早期管腔閉合,內(nèi)無(wú)紅細(xì)胞,并逐步發(fā)育成熟,與體內(nèi)循環(huán)聯(lián)通后形成成熟的動(dòng)靜脈和網(wǎng)狀血管.通過(guò)大網(wǎng)膜包埋移植AHS,大網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠合成具有強(qiáng)烈血管生成作用的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子[11],可快速誘導(dǎo)移植支架材料內(nèi)血管再生,另一方面AHS雖然去除了大部分細(xì)胞成分,但仍保留了大量具有生物學(xué)活性的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等[12],能夠促進(jìn)移植支架材料再細(xì)胞化過(guò)程中的血管生成,但具體機(jī)制仍值得進(jìn)一步研究,并且血管化的網(wǎng)狀組織結(jié)構(gòu)是否能夠應(yīng)用于種子細(xì)胞的移植也值得深入觀察.

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(本文編輯:吳彬)

Observation on the process of vascular reconstruction in acellular hepatic scaffolds of rat after transplantation into the greater omentum

HUANG Junjie1,3, WANG Zhibin1, CHEN Na2, ZHANG Jianse1, WANG Zhiyi1, LI Ting1,DAI Kaiyu1, MEI Jin1, LOU Xinfa1.
1.Institute of Bioscaffold Transplantation and Immunology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.School of the Second Clinical Medical Sciences, Wenzhou Medical University,Wenzhou, 325035; 3.Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Zhejiang University, Hangzhou,310058

Objective: To observe the process of vascular reconstruction in acellular hepatic scaffolds of rat after transplantation into the greater omentum. Methods: Acellular hepatic scaffolds were harvested from adult SD rats by perfusing with TritonX-100. The scaffolds and native livers were observed through genomic DNA content analysis, scanning electron microscopy, HE stain, immunofluorescence and vascular cast. Then the acellular hepatic scaffolds were transplanted into the greater omentum in rats to investigate the vascular reconstruction. Rats were sacrificed respectively at 1, 3, 7, 14 or 28 days post-implantation and sections from the explanted grafts were analyzed by HE stain for morphology and microstructures. Results: Scanning electron microscope, HE stain and immunofluorescence showed most collagen fibers but no visible cell nuclei remained after decellularization in the scaffolds compared with the native livers. Vascular cast showed the pipeline structures of acellular hepatic scaffolds were intact and clear. Quantitative analysis of DNA content within the scaffolds showed only (211.6 ± 25.3) ng/μL. Then the blood sinus were observed on border of grafts at 3 days after transplantation into greater omentum. Afterwards the neovessels appeared, got into the internal of scaffolds, and formed microvascular network gradually in hepatic scaffolds after 14 days. The de novo microvascular network were still existed in hepatic scaffolds on 28 days. Conclusion: The implantation of greater omentum can promote the recellularization and eventually formation of vascularized reticular structures in the decellularized hepatic scaffolds.

hepar; decellular; vessel; tissue engineering; rats

R329.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.10.001

2017-03-11

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LY13H030010,LY14H180008);浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013KYA121,2016KYA061,2016KYA135);溫州市科技局公益類項(xiàng)目(Y20140664);浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(2014R 413024,2015R413031).

黃俊杰(1991-),男,浙江溫州人,碩士生.

樓新法,教授,Email:wzb326@126.com.