復(fù)方中藥黃酮類成分提取工藝優(yōu)化及抑制黑素合成活性研究

杜卓，李麗，董銀卯，杜一杰

(北京工商大學(xué)，北京 100048)

·中藥工業(yè)·

復(fù)方中藥黃酮類成分提取工藝優(yōu)化及抑制黑素合成活性研究

杜卓，李麗，董銀卯*，杜一杰

(北京工商大學(xué)，北京 100048)

目的以總黃酮為指標(biāo)，對由當(dāng)歸、丹參、黃芪、黃芩、甘草、白薇六味中草藥形成的組方進行提取工藝優(yōu)化，并通過體外檢測對經(jīng)過UVB刺激后B16黑素瘤細(xì)胞黑素合成抑制活性，探究組方提取物美白功能。方法采用CCK8法檢測樣品對B16細(xì)胞的增殖抑制活性，用NaOH裂解法測定黑素含量，用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定總黃酮含量，以總黃酮為指標(biāo)，考察提取時間、提取溫度、料液比、溶劑4個主要因素，通過單因素和正交試驗，研究組方最佳提取工藝。結(jié)果組方最佳提取工藝為提取時間3 h，提取溫度85 ℃，提取料液比1∶20，提取溶劑75%乙醇。通過最佳提取工藝提取所得的組方提取物，對經(jīng)過UVB刺激后的B16黑素瘤細(xì)胞黑素合成均具有顯著抑制活性(P<0.01)，且呈劑量依賴型。結(jié)論采用最佳提取工藝提取的組方提取率高，具有較佳的美白活性，能為復(fù)方美白功能添加劑的開發(fā)提供參考。

中草藥組方；B16黑素瘤細(xì)胞；黑素含量；總黃酮；美白

皮膚白皙一直是東方女性所追求的熱點，故美白劑的開發(fā)也隨之成為化妝品行業(yè)關(guān)注的焦點[1]。目前市場上的美白劑主要為煙酰胺、熊果苷、曲酸等。文獻(xiàn)表明，這些物質(zhì)雖然具有較好的美白功能，但存在一定的安全隱患，如煙酰胺、曲酸等被報道均具有一定的皮膚刺激性[1-2]。利用中草藥提取物作為化妝品功能添加劑具有藥效持久穩(wěn)定、毒副作用小的優(yōu)勢，深受人們的青睞[3]。復(fù)方中草藥通過諸多藥合理配伍后，能發(fā)揮相輔相成的協(xié)同作用，使中草藥功能得到充分發(fā)揮[4]，這成為國內(nèi)外化妝品活性原料開發(fā)的主要趨勢。研究表明，中草藥中廣泛存在的黃酮類化合物具有清除皮膚中自由基、抗炎、抑制酪氨酸酶，減少色素沉著等作用[5-6]，具有良好的美白活性。文獻(xiàn)報道，黑色素的形成和沉積是影響膚色的決定因素[7]，故體外檢測樣品對B16黑素瘤細(xì)胞黑素合成抑制作用被廣泛用于美白功能評價。

本研究以由當(dāng)歸、丹參、黃芪、黃芩、甘草、白薇六味中草藥組成的復(fù)方為研究對象，以其主要美白成分總黃酮含量為指標(biāo)，考察提取時間、提取溫度、料液比、溶劑4個主要因素，通過單因素和正交試驗，對組方最佳提取工藝進行優(yōu)化，并通過體外檢測其對經(jīng)UVB刺激后的B16黑素瘤細(xì)胞黑素合成的抑制活性，探討其美白功能，以期為復(fù)方美白功能添加劑的開發(fā)提供參考。

1 試劑和儀器

復(fù)方中草藥(按照質(zhì)量比1∶1∶1∶1∶1∶1秤取甘草、白薇、丹參、黃芪、當(dāng)歸、黃芩6味中藥共250 g)；甘草GlycyrrhizauralensisFisch.產(chǎn)地內(nèi)蒙古，北京東方淼森生物科技有限公司提供，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所許利嘉鑒定；白薇RadixCynanchiAtrati.產(chǎn)地遼寧，北京東方淼森生物科技有限公司提供，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所許利嘉鑒定；丹參SalviamiltiorrhizaBunge.產(chǎn)地四川，北京東方淼森生物科技有限公司提供，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所許利嘉鑒定；黃芪stragalusmembranaceusFisch.Bunge.產(chǎn)地內(nèi)蒙古，北京東方淼森生物科技有限公司提供，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所許利嘉鑒定；當(dāng)歸RadixAngelicaeSinensis.產(chǎn)地甘肅，北京東方淼森生物科技有限公司提供，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所許利嘉鑒定；黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi.產(chǎn)地內(nèi)蒙古，北京東方淼森生物科技有限公司提供，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所許利嘉鑒定。

黑素瘤細(xì)胞(B16)(協(xié)和細(xì)胞庫，批號150203)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號150209)；DMEM培養(yǎng)基(gibco，批號8115216)；胰蛋白酶(gibco，批號1676922)；雙抗混合液(gibco，批號1697547)；PBS緩沖液(HyClone，批號NAH1449)；CCK-8試劑盒(同仁化學(xué)研究所，批號GW769)；蘆丁(北京百靈威科技有限公司，批號L330P88)。

酶標(biāo)儀(TACAN，M200pro)；真空冷凍干燥機(Virtis)；UVB燈、UVB311燈、KN-4006B(科諾)。

2 方法

2.1 組方提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗

2.1.1.1 提取時間 精密稱取6份5.0 g組方，按1∶30的料液比加入150 mL 75%乙醇，在85 ℃下，分別提取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h，過濾得樣品溶液，測定總黃酮含量。

2.1.1.2 提取溫度 精密稱取5份5.0 g組方，按1∶30的料液比加入150 mL 75%乙醇，分別在55、65、75、85、100 ℃，提取1.0 h，過濾得樣品溶液，測定總黃酮含量。

2.1.1.3 提取料液比 精密稱取5份5.0 g組方，分別按照1∶15、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，加入75%乙醇，在85 ℃下，提取1.0 h，過濾得樣品溶液，測定總黃酮含量。

2.1.1.4 提取溶劑 精密稱取5份5.0 g組方，按照1∶30料液比加入150 mL水95%乙醇、75%乙醇、60%乙醇、30%乙醇，在85 ℃下，分別提取1.0 h，過濾得樣品溶液，測定總黃酮含量。

2.1.2 正交試驗 精密稱取9份10.0 g組方，以提取時間、提取溫度、料液比、溶劑為考察因素，每個因素設(shè)3個水平，按L9(34)正交設(shè)計表進行試驗，并以總黃酮含量為評價指標(biāo)對組方提取工藝進行優(yōu)化。

2.1.3 硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定總黃酮含量 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作[8]：蘆丁于105 ℃下干燥至質(zhì)量恒定，準(zhǔn)確稱取蘆丁對照品10.0 mg，用30%乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)母液。精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)母液1、2、3、5、6、8 mL分別置于10 mL容量瓶中，分別加入30%乙醇溶液定容，得到質(zhì)量濃度為10、20、30、50、60、80 μg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。再于5 mL EP管中分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.50 mL，30%乙醇3.22 mL，5%亞硝酸鈉溶液0.14 mL，混勻，靜置5 min，加10%硝酸鋁0.14 mL，混勻，靜置6 min；加1 mol·L-1NaOH溶液1.00 mL，混勻，靜置10 min，以30%乙醇為空白對照，在510 nm處測定吸光值，以測得的吸光值(X)為橫坐標(biāo)，以對照品蘆丁的濃度(Y)為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y=132.3X-0.164 3，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1，表明樣品溶液在0～80 μg·mL-1具有良好的線性關(guān)系。

樣品總黃酮含量測定：將2.1.1和2.1.2制得的樣品溶液用30%乙醇稀釋10倍后，按上述方法測定總黃酮含量。

(1)

(2)

2.2 最佳UVB輻射劑量的篩選

2.2.1 CCK8法檢測不同劑量UVB對B16黑素細(xì)胞的毒性 本研究采用UVB作為外界刺激源，刺激B16細(xì)胞黑素合成上調(diào)。

將細(xì)胞以1×105個/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸浮液，待細(xì)胞貼壁后，吸出各孔的培養(yǎng)基，每孔加100 μL PBS緩沖液覆蓋底面，用10種不同劑量UVB(150、300、450、600、750、900、1050、1200、1350、1500 mJ·cm-2)輻射細(xì)胞，每個處理10個復(fù)孔，空白對照不使用UVB輻射。輻射完成后，用新鮮培養(yǎng)基替換PBS緩沖液繼續(xù)孵育48 h，再加入CCK8試劑10 μL反應(yīng)2 h后，酶標(biāo)儀405 nm測定其吸光度。

(3)

UVB輻射細(xì)胞的具體條件如下：1)使用的科諾KN-4006B紫外線光療儀含兩根UVB紫外熒光燈(冷光源)，光譜范圍為280～320 nm，發(fā)射峰為311 nm，輻照強度固定為10 mW·cm-2，有效輻射面積為(104±2%)cm2；UVB劑量計算：UVB輻照劑量(mJ·cm-2)=UVB輻照強度(mW·cm-2)×?xí)r間(s)；3)照射細(xì)胞前開機預(yù)熱5 min，待UVB輻射度穩(wěn)定后開始對細(xì)胞進行紫外輻射。UVB輻射細(xì)胞時，用UVB燈照射細(xì)胞，紫外光源距細(xì)胞10 cm，垂直照射，分別照射15、30、45、60、75、90、105、120、135、150 s，即UVB輻射劑量分別為150、300、450、600、750、900、1050、1200、1350、1500 mJ·cm-2。

2.2.2 NaOH法檢測不同劑量UVB對B16黑素細(xì)胞黑素合成的促進作用 將細(xì)胞以3×105的密度接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)板中，待鋪板的細(xì)胞貼壁后，吸出平皿中的培養(yǎng)基，并向每個平皿中加入1 mL PBS緩沖液覆蓋底面，用10種不同劑量的UVB(150、300、450、600、750、900、1050、1200、1350、1500 mJ·cm-2)輻射細(xì)胞，每個處理設(shè)置三個平行，空白對照不進行UVB輻射處理。UVB輻射的具體條件如上2.2.1所述。輻射結(jié)束后，用新鮮培養(yǎng)基替換PBS緩沖液，繼續(xù)孵育48 h。孵育48 h后，用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，離心后PBS洗滌1次，加入1 mol·L-1NaOH(10%DMSO)200 μL，吹打數(shù)次，放入100 ℃的環(huán)境下沸騰10 min，使細(xì)胞溶解，取上清液加入96孔板，每孔200 μL，于450 nm讀取吸光度值，并計算黑素合成抑制率[9]。

(4)

2.3 組方對經(jīng)UVB刺激后的B16黑素瘤細(xì)胞黑素合成抑制活性

2.3.1 CCK8法檢測組方對B16黑素瘤細(xì)胞的增殖抑制作用 用得到的最佳提取工藝提取組方，70 ℃旋蒸濃縮后，冷凍干燥制得組方提取物凍干粉。稱取組方提取物凍干粉16 mg，溶解于2 mL的DMSO中，制備成8 mg·mL-1的樣品母液。再分別用培養(yǎng)基將樣品母液梯度稀釋成4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg·mL-1。

將細(xì)胞以1×105個/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸浮液，待細(xì)胞貼壁后，吸出廢舊培養(yǎng)基，用PBS清洗，再分別加入8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.13、0.06 3 mg·mL-1樣品溶液，對照組用培養(yǎng)基代替，每個處理設(shè)置3個平行。孵育48 h，加入CCK8試劑10 μL反應(yīng)2 h，酶標(biāo)儀405 nm測定其吸光度，計算細(xì)胞的存活率。

(5)

2.3.2 NaOH法檢測組方對B16黑素瘤細(xì)胞黑素合成抑制作用 樣品溶液的配制：稱取6 mg的組方提取物凍干粉，溶解于12 mL的DMSO中配制成500 μg·mL-1的樣品母液，再用培養(yǎng)基將樣品母液進行梯度稀釋，制成250、125、62.5、31.3 μg·mL-14個濃度。

陽性對照溶液的配制：稱取3 mg熊果苷粉末，溶于6 mL培養(yǎng)基中，即得500 μg·mL-1的熊果苷溶液。

實驗操作過程：1)將細(xì)胞以3×105的密度接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)板中并隨機分為三組：空白對照組、樣品組、陽性對照組；2)待細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)液，加入1 mL PBS緩沖液覆蓋平皿表面；3)用1050 mJ·cm-2UVB輻射細(xì)胞；4)輻射結(jié)束后，吸出PBS緩沖液，空白對照組加入5 mL新鮮培養(yǎng)基，樣品組加入5 mL含樣品培養(yǎng)基，陽性對照組加入5 mL含陽性對照培養(yǎng)基；5)繼續(xù)孵育48 h后用NaOH裂解法檢測黑素含量。實驗方法如上2.2.2所述。

(6)

2.4 統(tǒng)計分析

實驗中每個處理至少設(shè)置三組平行，取平均值，使用EXCEL軟件計算處理，所測數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。使用SPSS 17.0軟件進行組間顯著性差異分析。

3 結(jié)果

3.1 組方提取工藝的優(yōu)化

3.1.1 單個因素對組方總黃酮含量的影響

3.1.1.1 不同提取時間對組方總黃酮含量的影響 按照2.1.3所述方法，按照測定2.1.1.1不同提取時間所得的樣品溶液中的黃酮含量，每個樣品設(shè)置3個平行，結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取時間對組方總黃酮含量的影響(n=3)

圖1表明，隨著提取時間增加，組方提取物中的總黃酮含量先增加后減少，在提取時間為3 h時達(dá)到最大值，故選取3 h為最佳提取時間。

3.1.1.2 不同提取溫度對組方總黃酮含量的影響 按照2.1.3所述方法，按照測定2.1.1.2不同提取溫度所得的樣品溶液中的黃酮含量，每個樣品設(shè)置3個平行，結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取溫度對組方總黃酮含量的影響(n=3)

圖2表明，隨著提取溫度的增加，組方提取物中的總黃酮含量先增加后減少，在提取溫度為75 ℃時達(dá)到最大值，故選取75 ℃為最佳提取溫度。

3.1.1.3 不同提取料液比對組方總黃酮含量的影響 按照2.1.3所述方法，按照測定2.1.1.3不同提取料液比所得的樣品溶液中的黃酮含量，每個樣品設(shè)置3個平行，結(jié)果見圖3。

圖3 不同料液比對組方總黃酮含量的影響(n=3)

圖3表明，隨著提取料液比的增加，組方提取物中的總黃酮含量先增加后減少，在料液比為1∶30時達(dá)到最大值，故選取1∶30為最佳提取料液比。

3.1.1.4 不同提取溶劑對組方總黃酮含量的影響 按照2.1.3所述方法，按照測定2.1.1.4不同提取溶劑所得的樣品溶液中的黃酮含量，每個樣品設(shè)置3個平行，結(jié)果見圖4。

圖4 不同提取溶劑對組方總黃酮含量的影響(n=3)

圖4表明，隨著提取溶劑中乙醇含量的增加，組方提取物中的總黃酮含量先增加后減少，在提取溶劑為75%乙醇時達(dá)到最大值，故選取75%乙醇為最佳提取溶劑。

3.1.2 最佳提取工藝的優(yōu)化 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，按照2.1.2所述，選擇L9(34)正交表，對提取時間、提取溫度、提取料液比、提取溶劑4因素進行正交試驗，以總黃酮含量為評價指標(biāo)，對組方提取工藝進行優(yōu)化，結(jié)果見表1。

表1表明，4因素中提取時間對組方總黃酮含量影響最大，各因素對總黃酮含量的影響主次順序依次為提取時間>提取溶劑>提取溫度>料液比。分析正交試驗結(jié)果，確定組方最佳提取工藝為提取時間3 h，提取溫度85 ℃，提取料液比1∶20，提取溶劑75%乙醇。

3.2 最佳UVB輻射劑量的篩選

按照2.2.1和2.2.2的方法，測定不同劑量UVB對B16細(xì)胞的增殖抑制活性和黑素合成促進作用。結(jié)果見表2～3。由表2可知，UVB對B16細(xì)胞增殖的影響隨劑量增加起到先促進后抑制的作用，其中在UVB輻射劑量為1050 mJ·cm-2時，B16細(xì)胞活性達(dá)到最高。

表1 正交試驗結(jié)果

表2 不同劑量UVB對B16細(xì)胞毒性作用(n=10)

表3 不同劑量UVB對B16細(xì)胞黑素合成作用(n=3)

由表3可知，隨劑量的增加，UVB對B16細(xì)胞黑素合成起到不同程度的促進作用，其中在UVB輻射劑量為1050 mJ·cm-2時，對B16細(xì)胞黑素合成促進效果最明顯。綜合比較，選擇1050 mJ·cm-2為刺激B16細(xì)胞黑素合成上調(diào)的UVB最佳輻射劑量。

3.3 組方對經(jīng)UVB刺激后的黑素瘤細(xì)胞黑素合成抑制活性

3.3.1 組方對B16黑素瘤細(xì)胞的增殖抑制活性 按照2.3.1的方法測定組方提取物在8000、4000、2000、1000、500、250、125、62.5 μg·mL-1濃度下對B16黑素瘤細(xì)胞的增殖抑制活性，每組處理3個復(fù)孔。結(jié)果見表4。我們規(guī)定樣品作用于B16黑素瘤細(xì)胞后，細(xì)胞存活率≥80%時，則認(rèn)定該樣品對細(xì)胞無毒。

由表4可知，組方提取物對B16細(xì)胞無毒的最大濃度為250 μg·mL-1。

3.3.2 組方對B16黑素瘤細(xì)胞黑素合成抑制活性 在組方無毒濃度范圍內(nèi)，選取250、125、62.5、31.3 μg·mL-14個濃度，按照2.3.2的方法檢測組方提取物對B16細(xì)胞黑素合成的抑制作用。以500 μg·mL-1熊果苷溶液作為陽性對照，結(jié)果見表5。

表4 組方提取物對B16細(xì)胞毒性作用(n=3)

表5 組方及陽性對照對B16細(xì)胞黑素合成的抑制率(%)(n=3)

由表5可知，按最優(yōu)提取工藝提取的組方，對經(jīng)過UVB刺激后的B16細(xì)胞黑素合成具顯著抑制效果(P<0.01)，并呈一定劑量依賴性。

4 討論

黃酮類物質(zhì)存在于大多數(shù)中草藥中，具有多種生物活性。Badria F A等[10]研究表明，27種測試黃酮類化合物中有6種能顯著抑制酪氨酸酶活性，具有抑制黑素合成的美白功能。目前，國內(nèi)外對植物中黃酮類物質(zhì)的提取工藝研究比較成熟，提取方法也很多，例如水提法、有機溶劑提取法、熱回流提取法、微波輔助提取法、生物酶提取法等，其中以用乙醇溶液為提取溶劑的熱回流提取法最為常見。

本研究通過單因素和正交試驗，以總黃酮得率為指標(biāo)，考察提取時間、提取溫度、料液比、提取溶劑4個因素，對由甘草、白薇、丹參、當(dāng)歸、黃芪、黃芩六味藥組成的復(fù)方提取工藝進行優(yōu)化，并對組方提取物黑素合成抑制活性進行研究。結(jié)果表明，隨著單因素的依次優(yōu)化，最優(yōu)條件逐漸增多，提取出的總黃酮量也逐漸增大，各因素對組方總黃酮得率的影響順序依次為提取時間>提取溶劑>提取溫度>料液比，最終優(yōu)化的組方總黃酮提取工藝：提取時間為3 h、提取溫度為85 ℃、提取料液比為1∶20、提取溶劑為75%乙醇。通過最優(yōu)提取工藝，1 g組方生藥能提取出16.84 mg黃酮類物質(zhì)，所得的組方提取物對經(jīng)過UVB刺激后的B16黑素瘤細(xì)胞黑素合成具有顯著抑制活性(P<0.01)，且呈劑量依賴型。由此可見，采用最佳提取工藝提取的組方，提取率高，具有較佳的美白活性，能對復(fù)方美白功能添加劑的開發(fā)提供參考。

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StudyonExtractiveTechnologyofTotalFlavonesfromCompoundChineseHerbalMedicineandItsInhibitoryEffectonMelaninSynthesis

DU Zhuo，LI Li，DONG Yinmao*，DU Yijie

(BeijingTechnologyandBusinessUniversity，Beijing100048，China)

Objective：The extraction process of Compound Chinese herbal medicine which contains Radix Astragali，Radix Scutellariae，Radix Angelicae Sinensis，Radix Salviae Miltiorrhizae，Radix et Rhizoma Glycyrrhizae and Radix Cynanchi Atrati was optimized with the content of total flavonoids as index.And through theinvitrodetection of the inhibitory activities on the melanogenesis of B16 melanoma cells after UVB stimulation，the whitening effect of component herbs extracts was studied.MethodsThe cell proliferation inhibitory activity was detected by cck8 assay，the melanin content was detected by NaOH assay，the content of total flavonoids was detected by colorimetry with Al(NO3)3-NaNO2，with the content of total flavonoids as index the four major factors of extraction time，extraction temperature，solid-liquid ratio and extraction solvent were investigated.With single factor and orthogonal experiments，the best extraction process of the prescription was explored.ResultsThe best extraction process of prescription was as follows：extraction time 3 h；extraction temperature 85 ℃；extracting solid-liquid ratio 1∶20；extraction solvent 75% ethanol.And the prescription extracts showed a significant inhibitory activity(P<0.01)on the melanogenesis of B16 melanoma cells after UVB stimulation in dose-dependent manner.ConclusionThe prescription extracts through the best extraction process has high extraction efficiency and high skin-whitening activity，which can provide a reference for the development of compound whitening efficacy additive.

Compound Chinese herbal medicine；B16 melanoma cells；melanin content；total flavonoids；skin-whitening

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董銀卯，教授，研究方向：化妝品植物功效原料與配方技術(shù)；E-mail：ymdong2008@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.020

2016-12-19)