碳點(diǎn)熒光探針的制備及其在食品分析中的應(yīng)用

葉松齡+黃佳佳+羅林+傅慧君+孫遠(yuǎn)明+沈玉棟+雷紅濤+徐振林

摘 要 碳點(diǎn)作為一種新型熒光碳納米材料，具有優(yōu)良的光學(xué)性能和小尺寸特性，以及良好的生物相容性、低毒性以及易于實(shí)現(xiàn)表面功能化等特點(diǎn)，是潛在的可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)半導(dǎo)體量子點(diǎn)等熒光探針的良好選擇?；谄洫?dú)特的熒光特性和高靈敏度，碳點(diǎn)熒光探針在食品分析領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用潛力。本文對(duì)近年來熒光碳點(diǎn)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，簡(jiǎn)述碳點(diǎn)的性能并對(duì)碳點(diǎn)的制備方法進(jìn)行總結(jié)對(duì)比，重點(diǎn)介紹了碳點(diǎn)熒光探針在食品分析領(lǐng)域的應(yīng)用，對(duì)目前碳點(diǎn)應(yīng)用的限制進(jìn)行了分析， 對(duì)其發(fā)展前景和展望。

1 引 言

熒光碳點(diǎn)（Carbon dots， CDs）是一種粒徑小于10 nm且近似球型的零維熒光碳納米粒子。碳點(diǎn)的首次發(fā)現(xiàn)是2004年Xu等[1]對(duì)電弧放電法產(chǎn)生的煙灰中的單壁碳納米管進(jìn)行分離純化時(shí)的意外收獲，在用凝膠電泳法處理單壁碳納米管的懸浮液時(shí)發(fā)現(xiàn)，分子量不同的3組熒光納米粒子，在紫外燈照射下分別發(fā)出藍(lán)綠色、黃色和橘紅色的熒光。經(jīng)過后續(xù)一系列研究， 2006年Sun等[2]采用激光刻蝕的方法獲得熒光性能較好的碳納米粒子，并首次將其稱為碳點(diǎn)。與傳統(tǒng)半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比，碳點(diǎn)不僅具有可與之媲美的熒光性能，且本身并不含有任何有毒重金屬元素，具有低毒性和良好的生物相容性，易于實(shí)現(xiàn)表面功能化，因此一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便引起研究者的廣泛研究興趣。對(duì)碳點(diǎn)的研究重點(diǎn)集中在碳點(diǎn)的制備和應(yīng)用兩個(gè)方面，且更多是研究其在生物成像[3～5]、生化分析檢測(cè)[6～8]和光電催化[9，10]等領(lǐng)域的應(yīng)用，在食品分析檢測(cè)領(lǐng)域方面的應(yīng)用研究并不多，而實(shí)際上碳點(diǎn)作為熒光探針在食品分析檢測(cè)中具有非常大的應(yīng)用潛力。本文對(duì)碳點(diǎn)的制備及其在食品分析檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了系統(tǒng)的綜述，并對(duì)目前碳點(diǎn)應(yīng)用的限制和發(fā)展進(jìn)行了分析和展望。

2 碳點(diǎn)及其性能

碳點(diǎn)通常為球體或近球體結(jié)構(gòu)，是一個(gè)三維團(tuán)簇結(jié)構(gòu)，其三個(gè)維度尺寸均在納米尺度[11]，可以通過控制合成碳點(diǎn)的反應(yīng)溫度[12]、反應(yīng)時(shí)間[13]等因素得到不同粒徑大小的碳點(diǎn)，但這一形成機(jī)制目前并不明確[14]。碳點(diǎn)表面一般存在大量的親水性官能團(tuán)如羥基、羰基等，可穩(wěn)定分散于水溶液中，更有利于表面修飾。由于獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，與傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比，碳點(diǎn)具有獨(dú)特的性能：（1）目前合成的熒光碳點(diǎn)大多在紫外區(qū)有強(qiáng)烈的光吸收，還可延伸至可見光區(qū)，一般位于270～320 nm處； （2）碳點(diǎn)具有寬而連續(xù)的激發(fā)光譜，與傳統(tǒng)量子點(diǎn)一樣，在單色光源激發(fā)下可以得到不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光，即“一元激發(fā)多元發(fā)射”[2]，這為實(shí)現(xiàn)生物分子的多組分同時(shí)檢測(cè)提供了可能[15，16]； （3）熒光穩(wěn)定性高且耐光漂白，即使在持續(xù)激發(fā)光照射幾個(gè)小時(shí)后其熒光強(qiáng)度也幾乎沒有降低[17]； （4）熒光強(qiáng)度可調(diào)性，可根據(jù)溶液pH值的變化而變化，且不同條件合成的碳點(diǎn)對(duì)pH響應(yīng)也不同[18～20]； （5）具有光電荷轉(zhuǎn)移特性，可作為優(yōu)良的電子供體和電子受體[21， 22]； （6）部分碳點(diǎn)具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光（UCPL）性質(zhì)，即在較長(zhǎng)激發(fā)光的激發(fā)下，碳點(diǎn)發(fā)出較短波長(zhǎng)熒光的現(xiàn)象[23， 24]，如Shen等[25]報(bào)道中的經(jīng)PEG鈍化后的碳點(diǎn)，在激發(fā)波長(zhǎng)為600～800 nm時(shí)，上轉(zhuǎn)換的發(fā)射波長(zhǎng)移至390～468 nm； （7）除了光致發(fā)光性能，與半導(dǎo)體量子點(diǎn)相似，碳點(diǎn)還具有電化學(xué)發(fā)光的發(fā)光特性[26]。研究認(rèn)為碳點(diǎn)的電致發(fā)光的熒光不受粒子尺寸和修飾劑的影響而更多是取決于表面態(tài)。碳點(diǎn)的ECL和PL機(jī)理如圖1所示。

3 碳點(diǎn)的制備

自碳點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)至今，其制備方法的研究一直是研究熱點(diǎn)。目前已經(jīng)建立了一系列碳點(diǎn)合成的方法，這些方法大體上可歸納為兩大類：自上而下法（Topdown）和自下而上法（Bottomup）。

自上而下法主要是將碳的前驅(qū)體通過化學(xué)、電化學(xué)或者物理方法等使其從大變小，得到納米尺度的碳點(diǎn)[33]，主要包括電弧放電法[1，34]、激光刻蝕法[2，35，36]、電化學(xué)氧化法[17，37，38]和化學(xué)氧化法[39～41]等。自下而上法通常以小分子為反應(yīng)前驅(qū)體，大多是采用化學(xué)方法合成熒光碳點(diǎn)，主要包括模板法[42～44]、微波法[45～47]和水熱合成法[48～50]等。以上方法得到的只是碳點(diǎn)粗產(chǎn)物，還需通過離心、透析或電泳等分離方法進(jìn)行純化。一般而言，自上而下法制得的碳點(diǎn)性能較好，但存在制備過程較復(fù)雜、部分儀器較為昂貴、熒光量子產(chǎn)率較低和收集困難等問題； 自下而上法所用碳源來源豐富，過程較簡(jiǎn)單，易于控制，熒光量子產(chǎn)率較高，但后續(xù)的分離純化較困難，且對(duì)碳點(diǎn)性能有較大影響。目前，制備碳點(diǎn)方法以自下而上法較多，近年來微波法和水熱法以其資源易得、過程綠色環(huán)保的特點(diǎn)更受研究者的青睞。典型的制備方法及其所得碳點(diǎn)的性能參數(shù)如表1和表2所示。

4 碳點(diǎn)在食品分析檢測(cè)中的應(yīng)用

與傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)一樣，碳點(diǎn)通過與待測(cè)物的作用從而改變表面電子空穴對(duì)之間的復(fù)合效率，導(dǎo)致其熒光的增強(qiáng)或猝滅，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的定性或定量分析[51]。由于碳點(diǎn)的低毒性、良好的生物相容性，以及優(yōu)良的光學(xué)特性，以碳點(diǎn)作為熒光探針的分析方法具有高效簡(jiǎn)便、高靈敏度和選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，在食品分析檢測(cè)方面得到越來越廣泛的重視和應(yīng)用。

4.1 食品添加劑檢測(cè)

食品添加劑的種類繁多，其濫用及超標(biāo)或超范圍使用問題也非常突出，因此對(duì)其進(jìn)行定量分析檢測(cè)十分必要。

Lin等[52]以甘油為碳源，PEG1500N為鈍化劑，通過微波法處理得到表面經(jīng)過絲氨酸修飾后的碳點(diǎn)，該碳點(diǎn)在亞硝酸鹽和酸化的H2O2的作用下有強(qiáng)的發(fā)光，可用于定量檢測(cè)樣品中的亞硝酸鹽。在1.0 ×10mol/L范圍內(nèi)，碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度變化與亞硝酸鹽含量呈線性相關(guān)，并成功應(yīng)用于牛奶中亞硝酸鹽的測(cè)定。Yuan等[53]通過在空氣中加熱N羥乙基乙二胺三乙酸（HEDTA）制備得到發(fā)藍(lán)色熒光的碳點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該碳點(diǎn)與日落黃之間存在熒光能量共振轉(zhuǎn)移而使碳點(diǎn)發(fā)生熒光猝滅，由此可用于分析檢測(cè)樣品中日落黃的含量，碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與日落黃的濃度在0.3～8.0 μmol/L 呈良好線性關(guān)系，檢出限為79.6 nmol/L，并應(yīng)用于軟飲料樣品中日落黃的測(cè)定。如圖2所示，Xu等[54]將新鮮蘆薈通過水熱法處理得到的碳點(diǎn)能與檸檬黃相互作用形成基態(tài)復(fù)合物而導(dǎo)致熒光猝滅，該反應(yīng)為靜態(tài)猝滅過程。在0.25～32.50 μmol/L范圍內(nèi)碳點(diǎn)熒光信號(hào)變化與檸檬黃的濃度呈線性關(guān)系，檢出限為73 nmol/L。該方法已成功用于玉米饅頭、糖果和蜂蜜樣品中檸檬黃含量的檢測(cè)。近年來，熒光光譜檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)逐步應(yīng)用于食品添加劑檢測(cè)領(lǐng)域并取得一定進(jìn)展[55～58]，但結(jié)合碳點(diǎn)探針方法的報(bào)道仍較少，且研究的對(duì)象范圍較狹窄，可以改良樣品前處理方法，進(jìn)一步提高該類方法的靈敏度和選擇性。endprint

4.2 金屬離子檢測(cè)

一些常見金屬離子，包括Al3+、Hg2+、Cu2+等，可通過食物鏈在人體內(nèi)長(zhǎng)期蓄積，從而對(duì)人體產(chǎn)生多方面的危害[59，60]。因此加強(qiáng)對(duì)食品中金屬離子尤其是有毒重金屬離子的檢測(cè)是保證食品安全中重要措施。利用碳點(diǎn)與金屬離子形成的“熒光猝滅”現(xiàn)象，可實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬離子的快速高靈敏檢測(cè)。

Yan等[61]以檸檬酸為碳源，4，7，10三氧1， 13十三烷二胺為鈍化劑，利用一步水熱法制備可特異性識(shí)別Al3+的碳點(diǎn)，如圖3所示，在4～40 μmol/L的范圍內(nèi)碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與Al3+的濃度呈線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.0329 μmol/L，且?guī)缀醪皇芷渌x子的影響， 采用此方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)油條、饅頭、薯?xiàng)l、面包等食品中Al3+的檢測(cè)。Liu等[62]報(bào)道了一種新型熒光探針（NCNPs），并成功用于牛奶和海帶樣品中的Hg2+的檢測(cè)。該探針是以檸檬酸為碳源、（NH4）3PO4為氮源，經(jīng)過水熱處理制備得到的一種氮摻雜碳點(diǎn)。碳點(diǎn)表面的NH或吡咯狀NH與Hg2+之間有較其它金屬離子更強(qiáng)的相互作用以引起熒光猝滅，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的特異性檢測(cè)，檢出限為2.3 nmol/L。表面修飾后或復(fù)合型碳點(diǎn)能在復(fù)雜環(huán)境中對(duì)特定離子進(jìn)行特異性檢測(cè)[51]。Zhu等[63]使用天然海帶作為碳源，通過水熱法制備熒光碳點(diǎn)，并用聚乙烯亞胺（PEI）修飾碳點(diǎn)表面，成功用于檢測(cè)酸奶樣品中的Cu2+。利用碳點(diǎn)檢測(cè)金屬離子的過程中，多數(shù)情況是利用金屬離子引起碳點(diǎn)的熒光內(nèi)濾效應(yīng)導(dǎo)致的熒光猝滅[64，65]。相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，基于碳點(diǎn)探針方法的靈敏度和選擇性都有較明顯的優(yōu)勢(shì)，但從目前的研究來看，靶向金屬離子的種類并不多，且可能由于實(shí)際處理樣本較復(fù)雜而較少能運(yùn)用到實(shí)際食品中的檢測(cè)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，可以利用多種碳點(diǎn)組裝的熒光傳感器對(duì)多種金屬離子進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。Gui等[66]基于碳點(diǎn)的上轉(zhuǎn)換熒光，將聚亞乙基亞胺功能化的碳點(diǎn)和表面修飾有羧基的碳點(diǎn)組合，開發(fā)了一種新型熒光傳感器，能夠可逆和同時(shí)檢測(cè)Cu2+和Hg2+，其中不同濃度的Cu2+和Hg2+的加入會(huì)分別引起465和600 nm處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度的線性變化，其檢出限分別為0.05和0.08 mol/L。

4.3 食品營(yíng)養(yǎng)成分分析

利用碳點(diǎn)表面電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的熒光猝滅的原理，可檢測(cè)食品中具有金屬絡(luò)合物能力的營(yíng)養(yǎng)成分。金屬離子與碳點(diǎn)表面間的靜電相互作用和發(fā)生電子轉(zhuǎn)移使碳點(diǎn)的熒光猝滅。再根據(jù)被檢測(cè)的物質(zhì)與該金屬離子有更強(qiáng)的絡(luò)合作用從而破壞“金屬離子碳點(diǎn)”體系，使碳點(diǎn)的熒光恢復(fù)， 最終實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的定量檢測(cè)。

谷胱甘肽（Glutathione， GSH）廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，對(duì)維持機(jī)體適宜的氧化還原環(huán)境起到至關(guān)重要的作用[67]。Xu等[68]利用檸檬酸鈉和尿素通過水熱法制備得到碳點(diǎn)，加入Hg2+后與碳點(diǎn)表面間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移， 使碳點(diǎn)發(fā)生明顯的熒光猝滅，在體系中加入對(duì)Hg2+有更強(qiáng)絡(luò)合作用的GSH后，碳點(diǎn)熒光恢復(fù)，形成對(duì)GSH的“Offon”型熒光探針，檢出限達(dá)到37 nmol/L。該探針被成功應(yīng)用到西紅柿、圣女果、葡萄、黃瓜和菠菜等果蔬樣品中GSH的檢測(cè)。Hg2+還可以被較低毒性的Cu2+代替[69]，同樣可以實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中GSH的高效檢測(cè)。Purbia等[70]用微波輔助水熱法合成的碳點(diǎn)與Cu2+形成熒光探針，用于維生素B1的檢測(cè)，如圖4所示，Cu2+的加入使碳點(diǎn)熒光猝滅，加入維生素B1后， 通過共價(jià)鍵作用與Cu2+結(jié)合，使其從碳點(diǎn)表面脫離從而使碳點(diǎn)熒光恢復(fù)。 該方法檢測(cè)維生素B1的靈敏度高、抗干擾性強(qiáng)，檢出限為280 nmol/L，線性范圍10～50 μmol/L。由于食品的多樣性和食品營(yíng)養(yǎng)成分組成的復(fù)雜性，樣品的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性有較大的影響，因此需要選擇恰當(dāng)?shù)那疤幚矸椒?，開發(fā)具有更好穩(wěn)定性和選擇性的碳點(diǎn)材料用于檢測(cè)。

4.4 食源性致病菌檢測(cè)

近年來，在世界范圍內(nèi)因食源性疾病導(dǎo)致的食品安全突發(fā)事故時(shí)有發(fā)生，而食源性致病菌是其主要誘因，常見的致病菌有沙門氏菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌等[71，72]。

夏圣等[73]將抗沙門菌Ha因子抗體偶聯(lián)碳點(diǎn)CDs制備免疫納米熒光碳點(diǎn)，可有效結(jié)合抗O4磁珠富集的細(xì)菌，分離后，通過測(cè)定熒光光譜分析樣品中乙型副傷寒沙門氏菌的污染情況。結(jié)果表明，該方法對(duì)乙型副傷寒沙門氏菌的檢測(cè)限為103 CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間約為2 h。Weng等[74]以檸檬酸銨為碳源通過加熱的方法制備碳點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)甘露糖修飾的碳點(diǎn)由于甘露糖與大腸桿菌的凝集素單位的選擇性結(jié)合而能夠?qū)Υ竽c桿菌進(jìn)行特異性標(biāo)記和檢測(cè)，如圖5所示，并成功應(yīng)用于自來水、蘋果汁、人尿液等實(shí)際樣品中大腸桿菌的檢測(cè)。應(yīng)用碳點(diǎn)熒光探針對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)方法中，尋找合適的表面配體是關(guān)鍵之一，既能與碳點(diǎn)牢固結(jié)合，在保證碳點(diǎn)的化學(xué)和光學(xué)性能穩(wěn)定的同時(shí)，又能保證同目標(biāo)物的有效結(jié)合。阿米卡星是一種常見的氨基糖苷類抗生素，Chandra等[75]將其作為大腸桿菌的結(jié)合配體，與水熱法合成的碳點(diǎn)結(jié)合形成熒光探針用于檢測(cè)大腸桿菌，其熒光強(qiáng)度與大腸桿菌的濃度在3.9×105～7.6×102 CFU/mL的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為552 CFU/mL，并且成功應(yīng)用于不同果汁樣品（如蘋果汁、菠蘿汁和橙汁）中大腸桿菌的檢測(cè)。

4.5 有機(jī)污染物檢測(cè)

農(nóng)獸藥的廣泛使用，自然環(huán)境和生產(chǎn)加工過程中的污染等，均可造成食品中的有害有機(jī)物污染，嚴(yán)重威脅食品安全。近幾年，已經(jīng)建立了多種基于碳點(diǎn)熒光探針的檢測(cè)方法，包括熒光測(cè)定法、免疫分析法、電化學(xué)傳感器法等方法。 Chang等[76]制備了能發(fā)射強(qiáng)烈黃色熒光的碳點(diǎn)，423 nm激發(fā)時(shí)，最大發(fā)射波長(zhǎng)為 524 nm， 農(nóng)藥對(duì)氧磷可以濃度依賴的方式對(duì)該碳點(diǎn)的熒光猝滅，檢出限為（0.22±0.02） μmol/L， 并成功用于白菜樣品中的對(duì)氧磷檢測(cè)。除了常用的基于熒光猝滅的方法，還可以與分子印跡等方法結(jié)合開發(fā)靈敏度更高和選擇性更好的傳感器，進(jìn)一步拓展其應(yīng)用。Li等[77]開發(fā)一種由分子印跡聚合物（Molecularly imprinted polymers， MIPs）和適配體組成的雙識(shí)別系統(tǒng)的生物傳感器，其中MIPs是將碳點(diǎn)標(biāo)記的DNA適配體與林可霉素和鄰氨基苯酚通過電聚合的方法在由氧化石墨烯修飾的電極上合成的。該方法實(shí)現(xiàn)對(duì)林可霉素的雙重識(shí)別，具有高的靈敏度，檢出限為1.6 ×10mol/L， 并成功應(yīng)用于雞肉、牛肉等多種肉類樣品中林可霉素的檢測(cè)，但穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步改進(jìn)。這些檢測(cè)方法可對(duì)食品中有害有機(jī)污染物進(jìn)行快速靈敏的檢測(cè)，典型方法如表3所示。

5 總結(jié)與展望

碳點(diǎn)作為一種新型納米材料，因其突出的熒光性能、低毒性和生物相容性的特點(diǎn)，在食品安全領(lǐng)域得到了越來越廣泛的研究，具有良好的應(yīng)用潛力。然而，對(duì)于碳點(diǎn)的開發(fā)利用仍處于初級(jí)研究階段，其熒光機(jī)理尚不十分明確。在合成制備方面，碳源的選擇呈現(xiàn)多樣性且方法趨于靈活簡(jiǎn)便，但多數(shù)仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，對(duì)碳點(diǎn)后續(xù)純化的步驟往往比較繁瑣和耗時(shí)，且會(huì)對(duì)碳點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率和熒光活性有較大的影響。在食品分析應(yīng)用方面，從目前的報(bào)道可看出碳點(diǎn)在該領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛力； 由于食品組成成分的復(fù)雜性，仍存在較多有待解決的問題，例如檢測(cè)的特異性不強(qiáng)而靈敏度也有待提高，而且現(xiàn)建立的方法檢測(cè)的多是單一目標(biāo)物，對(duì)于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)物的報(bào)道非常少，需進(jìn)一步的研究和開發(fā)。

因此，選擇合適的碳源和對(duì)合成工藝的優(yōu)化，以達(dá)到降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)率、化學(xué)穩(wěn)定性和重現(xiàn)性是實(shí)現(xiàn)碳點(diǎn)大規(guī)模應(yīng)用的關(guān)鍵。在后續(xù)的摻雜或表面功能化應(yīng)用中，與其它方法（如免疫分析、電化學(xué)傳感器、分子印跡聚合物等方法）的聯(lián)用會(huì)進(jìn)一步拓寬應(yīng)用范圍，提高方法的靈敏度、準(zhǔn)確度以及特異性，這是碳點(diǎn)的一個(gè)重要發(fā)展方向。近年來，免疫分析方法、傳感器等技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用不斷拓展，將碳點(diǎn)與免疫分析、傳感器等方法結(jié)合，有望為食品安全監(jiān)管提供有效的新技術(shù)和新方法。endprint