納升液相色譜質(zhì)譜分析方法的重現(xiàn)性對(duì)尿液多肽組分析結(jié)果的影響

王勇+吳利+徐金玲+李水明 劉寧 姜亮

摘 要 多肽組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的延伸和擴(kuò)展，在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究中的應(yīng)用日益廣泛，但是，多肽組鑒定方法的重現(xiàn)性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響目前尚不清楚。本研究利用納升液相色譜高分辨質(zhì)譜對(duì)健康人的尿液多肽組進(jìn)行了7次平行分析，考察圖譜數(shù)目、圖譜利用率、鑒定的肽段數(shù)目、蛋白質(zhì)數(shù)目、樣品總離子強(qiáng)度和肽段保留時(shí)間等指標(biāo)的變化，以揭示重復(fù)實(shí)驗(yàn)之間分析結(jié)果的可變性和穩(wěn)定性。7次測(cè)定的肽段數(shù)目平均值為208，標(biāo)準(zhǔn)偏差為38； 7次結(jié)果合并后，得到了歸屬于114個(gè)蛋白質(zhì)的426個(gè)肽段，肽段和蛋白質(zhì)數(shù)目均顯著增加； 而35個(gè)蛋白質(zhì)的109個(gè)肽段在所有7次實(shí)驗(yàn)中均被檢出，表明多肽組的單次分析結(jié)果既具有一定的隨機(jī)性，又具有相對(duì)的穩(wěn)定性。增加平行實(shí)驗(yàn)次數(shù)會(huì)擴(kuò)大多肽組數(shù)據(jù)集，但測(cè)定3次以上后增加幅度減小。相比于肽段，多肽組的結(jié)果在蛋白質(zhì)水平上更為穩(wěn)定，提示利用蛋白質(zhì)為多肽組的生物標(biāo)志物更為穩(wěn)健。

1 引 言

多肽組學(xué)的概念提出于20世紀(jì)初期，多肽組是指體液、組織和細(xì)胞等生物體內(nèi)全部?jī)?nèi)源性多肽，蛋白質(zhì)的異常降解產(chǎn)物與多種生理病理過程相關(guān)，因此多肽組是生物標(biāo)記物的重要來源[1～3]，血液，尿液，唾液、腦脊液、汗液、眼淚和胸腔積液等體液的多肽組均已有報(bào)道[4～12]。此外，還出現(xiàn)了神經(jīng)活性多肽[13，14]、細(xì)胞[15，16]、組織[17，18]、植物汁液[19]和各種標(biāo)記或非標(biāo)記的定量多肽組學(xué)研究[20～22]。

多肽組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)延伸和擴(kuò)展，將肽段分離后不經(jīng)過特異性酶切直接進(jìn)行質(zhì)譜分析。早期的多肽組研究通常采用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOF）方法[23]，該方法只能給出分子量信息并且由于電離抑制效應(yīng)導(dǎo)致檢出的肽段數(shù)目較少，與液相色譜（LC）MALDI聯(lián)用和使用串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF/TOF）可獲得更多的肽段數(shù)目和序列信息[24，25]，但改善并不顯著。近年來高分辨質(zhì)譜技術(shù)愈發(fā)成熟，掃描速度也不斷增加，與液相色譜聯(lián)用顯著地提高了分離分析能力，因此，納升液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜成為多肽組分析的重要方法，不僅可以準(zhǔn)確鑒定肽段序列，還能發(fā)現(xiàn)階梯序列肽段以及氧化和磷酸化修飾的肽段。此外，各種蛋白質(zhì)組學(xué)中的定量標(biāo)記方法也開始應(yīng)用于多肽組學(xué)分析。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中， 考察質(zhì)譜分析的重現(xiàn)性時(shí)發(fā)現(xiàn)， 肽段水平的可變性高于蛋白質(zhì)，高分辨質(zhì)譜的重現(xiàn)性優(yōu)于低分辨質(zhì)譜； 此外，分析結(jié)果的重現(xiàn)性還與樣本復(fù)雜程度相關(guān)，技術(shù)性重復(fù)的最高重現(xiàn)性也只有80%，而最低僅為35%[26]，但分析方法的重現(xiàn)性對(duì)多肽組分析結(jié)果的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過將同一樣品連續(xù)分析7次，考察數(shù)據(jù)依賴的掃描方式下方法的重現(xiàn)性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分析方法的重現(xiàn)性對(duì)多肽組的鑒定結(jié)果，尤其是對(duì)低豐度肽段和蛋白仍有一定影響。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

EksigentnanoLCUltraTM 2D 系統(tǒng)、TripleTOF 5600 plus高分辨質(zhì)譜儀、Protein Pilot 4.5軟件（美國(guó)AB SCIE公司）； 真空冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Thermo Savant公司）； C18反相色譜捕集柱（100 μm × 3 cm，3 μm，15 nm， 美國(guó)Eksigent公司）； C18反相色譜分析柱（75 μm × 15 cm， 3 μm， 12 nm，美國(guó)Eksigent公司）。納升液相色譜流動(dòng)相 A為0.1% 甲酸2% 乙腈，流動(dòng)相 B為0.1% 甲酸98% 乙腈； 所用試劑為質(zhì)譜純或優(yōu)級(jí)純，均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司； 氧化石墨烯磷酸鑭納米磁性復(fù)合材料為自行合成[1]。

2.2 反相色譜Triple TOF質(zhì)譜分析

多肽的分離和富集如文獻(xiàn)[1]所述， 以上步驟7份樣品同時(shí)操作， 收集上清合并后冷凍干燥。將分離凍干的多肽樣品溶解于NanoRPLC流動(dòng)相 A中， NanoRPLC液相色譜為EksigentnanoLCUltraTM 2D系統(tǒng)（美國(guó)AB SCIEX）， 溶解后的樣品以2 μL/min的流速上樣到C18預(yù)柱上（100 μm×3 cm， 3 μm， 15 nm）， 然后保持流速?zèng)_洗脫鹽10 min。分析柱是C18反相色譜柱（75 μm×15 cm， 3 μm， 12 nm）， 梯度洗脫條件： 0～42 min， 5%～25% B； 42～56 min， 25%～40% B； 56～64 min， 80% B； 64～70 min， 5% B。質(zhì)譜采用TripleTOF 5600+ 系統(tǒng)（美國(guó)AB SCIEX公司）。， 納升噴霧III離子源， 噴霧電壓為2.4 kV， 氣簾氣壓為207 kPa， 霧化氣壓為34.5 kPa， 加熱溫度為150℃， 質(zhì)譜掃描方式為數(shù)據(jù)依賴的采集工作模式（Information dependent analysis， IDA）。一個(gè)質(zhì)譜循環(huán)3 s， 1張全譜加30張串聯(lián)質(zhì)譜， 選取前top20并且CPS>300的前體離子進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析， 每張串聯(lián)譜的采集時(shí)間為80 ms。

2.3 數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜采集到的原始wiff圖譜文件， 采用Protein Pilot Software v. 4.5（AB SCIEX， USA）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)加工處理和檢索分析， 數(shù)據(jù)庫(kù)為uniprot庫(kù)中的Homo sapiens人種專一數(shù)據(jù)庫(kù)（包含20210條蛋白質(zhì)序列， 2015年1月2日下載）， 檢索參數(shù)設(shè)置為非酶切、磷酸化強(qiáng)調(diào)和生物學(xué)修飾， 假陽性率控制為1% FDR。

3 結(jié)果與討論

3.1 多肽組鑒定結(jié)果的重現(xiàn)性分析

如圖1所示， 7次分析的總離子流圖相近， 說明分析結(jié)果具有重現(xiàn)性， 但是， 經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后， 發(fā)現(xiàn)圖譜總數(shù)、圖譜利用率、特異性肽段數(shù)目、所有肽段所歸屬的蛋白質(zhì)數(shù)目和總離子強(qiáng)度等指標(biāo)有較大變化（表1）。其中， 不同次測(cè)量中數(shù)值幅度變化最小的為圖譜數(shù)目， 最高值為最低值的1.29倍；endprint

而變化幅度最大的為總離子流強(qiáng)度， 最高值為最低值的3.96倍； 特異性肽段數(shù)目的變化倍數(shù)為1.72倍， 但蛋白質(zhì)檢出差異相對(duì)較小， 為1.43倍； 肽段數(shù)目、蛋白質(zhì)數(shù)目和總離子強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為18%、11%和52%。以上結(jié)果說明， 多肽組的單次分析結(jié)果具有一定的隨機(jī)性。此外， 雖然總體上圖譜數(shù)目與檢出的肽段、蛋白質(zhì)數(shù)目和總離子強(qiáng)度具有正相關(guān)性， 但并不具有嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系。值得注意的是， 將7次結(jié)果合并后， 得到了歸屬于114個(gè)蛋白質(zhì)的426個(gè)肽段， 肽段和蛋白質(zhì)數(shù)目均比單次測(cè)定的最高值增加50%以上， 該尿液樣品所鑒定得肽段數(shù)目少于本研究組前期報(bào)道的790條肽段的結(jié)果[1]， 可能是由于樣品差異所致， 但兩次實(shí)驗(yàn)都檢測(cè)到了血紅蛋白和尿調(diào)節(jié)素等蛋白質(zhì)[1]， 同時(shí)觀察到了高豐度蛋白質(zhì)的階梯序列特征。 Hart等人[27]利用碰撞誘導(dǎo)解離（CID）方式鑒定到了歸屬于40個(gè)蛋白質(zhì)的74個(gè)肽段， 肽段數(shù)目不到蛋白質(zhì)數(shù)目的2倍， 應(yīng)該無明顯的階梯序列存在。進(jìn)一步比較7次分析中的共有肽段和蛋白發(fā)現(xiàn)， 歸屬于35個(gè)蛋白質(zhì)的109個(gè)肽段在所有7次測(cè)量中均被檢出， 但其中60個(gè)肽段歸屬于血紅蛋白α亞基和β亞基， 尿調(diào)節(jié)素、凝聚素和血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑5種蛋白質(zhì)， 這也進(jìn)一步驗(yàn)證了之前所提出的多肽組中肽段分布具有不均一性的結(jié)論[1]。

3.2 共有肽段實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的分析

液相色譜保留時(shí)間和信號(hào)強(qiáng)度是衡量結(jié)果重現(xiàn)性的兩個(gè)重要指標(biāo)， 為說明重復(fù)實(shí)驗(yàn)中這兩種指標(biāo)的變化幅度， 在109條共有肽段中隨機(jī)選取了歸屬于血紅蛋白α鏈和尿調(diào)節(jié)素的各5條肽段考察保留時(shí)間的變化幅度（表2）， 發(fā)現(xiàn)雖然肽段SGSVIDQSRVLNLGPITRK出峰時(shí)間最多相差了1 min以上， 但大多數(shù)肽段的保留時(shí)間較為恒定， 在不同分析輪次中的變化幅度小于0.5 min， 最小相差0.004 min， 10條肽段的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.031%～1.500%， 以上結(jié)果達(dá)到了目前納升液相色譜儀器的性能指標(biāo)， 提示不同次分析中肽段和蛋白質(zhì)數(shù)目的差別不是由于實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤導(dǎo)致。從表2還可知， 肽段序列僅變化1個(gè)氨基酸就可能對(duì)液相色譜的保留時(shí)間造成較大改變。

在多肽組學(xué)的生物標(biāo)記物研究中， 通常利用同一肽段在不同樣本的離子強(qiáng)度作為非標(biāo)記定量的指標(biāo)， 本研究比較上述10條肽段在7次平行實(shí)驗(yàn)中的變化（表3）， 發(fā)現(xiàn)變化幅度很大， RSD為6.7%～59.4%， 平均值為32.9%， 只有3條肽段的RSD<15%， 有3條肽段的最低離子強(qiáng)度和最高離子強(qiáng)相差約10倍， 但多數(shù)肽段的強(qiáng)度接近平均值。以上現(xiàn)象的原因可能是由于采用目前分析常用的數(shù)據(jù)依賴性的采集模式， 每個(gè)色譜峰的采集點(diǎn)數(shù)有限， 液相色譜保留時(shí)間的微小變化就可能對(duì)信號(hào)強(qiáng)度造成較大影響， 但也不排除電噴霧過程具有一定的隨機(jī)性。以上結(jié)果提示， 在利用同一肽段在不同樣本中的離子強(qiáng)度作為生物標(biāo)志物篩選依據(jù)時(shí)， 需要考慮方法重現(xiàn)性的影響。

3.3 測(cè)量次數(shù)對(duì)肽段和蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目的影響

在MALDITOF質(zhì)譜分析的過程中， 激光激發(fā)次數(shù)一般在上千次以上， 得到的圖譜實(shí)際上是多張圖譜的疊加， 因此， MALDITOF質(zhì)譜具有較好的重現(xiàn)性， 但對(duì)于多肽組和蛋白質(zhì)組這樣的復(fù)雜體系， 得到的信息量不夠。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜可以給出更豐富的信息， 但如上所述， 一次分析的結(jié)果不能代表尿液多肽組的全部情況， 由于在實(shí)際分析過程中受樣本量和分析成本等的限制， 較難進(jìn)行過多的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)， 并且實(shí)驗(yàn)次數(shù)過多也會(huì)造成邊際效應(yīng)遞減， 因此， 本研究考察了重復(fù)次數(shù)對(duì)分析結(jié)果的影響。

如將7次分析合并后的歸屬于114個(gè)蛋白質(zhì)的426個(gè)肽段近似視為尿液多肽組的“全集”。將任意兩次分析結(jié)果排列組合后產(chǎn)生了21種組合， 結(jié)果表明， 兩種組合的肽段及其歸屬蛋白的數(shù)目都與全集相差較大（圖2）。比較3～6種組合情況下所得到的肽段和蛋白質(zhì)數(shù)目（圖3）， 發(fā)現(xiàn)3次分析次數(shù)以上肽段和其歸屬蛋白質(zhì)的數(shù)目增加幅度開始變緩， 而5次分析的結(jié)果已經(jīng)與7次分析基本接近?；诖耍?可以認(rèn)為對(duì)同一樣品進(jìn)行至少3次分析的合并結(jié)果會(huì)更全面地反映其多肽組的組成。由于個(gè)體差異， 在利用多肽組方法研究實(shí)際問題時(shí)， 多未提及重復(fù)次數(shù)[11～16]， 說明該問題尚未引起足夠重視。

3.4 共有肽段和差異肽段在蛋白質(zhì)水平上的分析

由于液相色譜質(zhì)譜分析方法的偶然性， 隨著測(cè)量次數(shù)增加， 所鑒定到的交集數(shù)目越來越小。例如， 1和2的共有特異性肽段數(shù)目為189條， 前5次測(cè)量的共有肽段數(shù)目則為132條， 而7次合并后該數(shù)目則為109條， 隨著合并次數(shù)的增加， 共有肽段數(shù)目的減小幅度也減小， 因此， 可以認(rèn)為在7次分析中均檢測(cè)到的肽段具有較高的檢出概率， 即雖然數(shù)據(jù)依賴的掃描和采集方式的分析結(jié)果具有一定偶然性， 但仍具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。例如， 雖然每次分析所鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)目不同， 但排名在前20位的蛋白質(zhì)具有90%以上的檢出率， 血紅蛋白α鏈和尿調(diào)節(jié)素的Unused值排名總是在第一和第二位， 血紅蛋白α鏈在7次檢測(cè)中鑒定到的數(shù)目分別為24、27、30、31、33、34和36次， 其它蛋白質(zhì)也存在類似規(guī)律， 即如果某蛋白質(zhì)被鑒定的肽段數(shù)目較多， 則它總體上就有更高的檢出概率并且可靠性排名（Unused值）相對(duì)穩(wěn)定。換言之， 如果在兩個(gè)不同結(jié)果中排名靠前的蛋白質(zhì)發(fā)生明顯變化， 則一定是樣本本身的原因而非來自方法的偶然誤差。但反之未必成立， 有些排名靠后的蛋白質(zhì)也具有穩(wěn)定性， 例如， 歸屬于40S核糖體蛋白S12的只有一個(gè)肽段AEEGIAAGGVMDVNTALQEVLK， 但它在所有7次測(cè)定中均被檢出。值得注意的是， 肽段的檢出率受離子強(qiáng)度的影響并不大， 這可能是因?yàn)橘|(zhì)譜儀具有4個(gè)數(shù)量級(jí)以上的線性范圍。例如， 在第一次分析中， 共檢測(cè)到277個(gè)肽段， 離子強(qiáng)度的最小值為198， 最大值為204816， 平均值為4650， 而在第一次分析結(jié)果的共同109個(gè)肽段中， 最低值為363， 最高值為50366， 平均值為3582。值得注意的是， β防御素1的肽段GNFLTGLGHRSDHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCC在所有277個(gè)肽段中的離子強(qiáng)度最高， 為204816， 但其在第2、3、4和7輪分析中均未測(cè)到， 在第5和第6次分析中的強(qiáng)度分別為197775和182780， 具體原因尚需進(jìn)一步分析。endprint

另一方面， 如果在實(shí)際工作中只做一次實(shí)驗(yàn)， 希望能對(duì)可能漏檢的肽段做出趨勢(shì)性預(yù)測(cè)， 因此， 將單次分析結(jié)果與7次分析合并的結(jié)果進(jìn)行了比較。首先， 重復(fù)實(shí)驗(yàn)可能發(fā)現(xiàn)肽段序列中氨基酸殘基取代信息， 例如， 在第1次實(shí)驗(yàn)中共檢測(cè)到5個(gè)含有YQKVVAGVANALAHKYH序列的肽段， 但在7次合并結(jié)果中測(cè)到了7個(gè)， 多出的兩個(gè)分別為該肽段的12位亮氨酸被谷氨酸取代和11位的甘氨酸被絲氨酸取代。其次， 有些合并后增加的肽段來自單次分析已鑒定出的蛋白質(zhì)， 即鑒定出的肽段數(shù)目增加， 但歸屬蛋白的數(shù)目未增加， 例如， 與第1次分析相比， 7次合并后血紅蛋白α鏈多鑒定出6條肽段， 尿調(diào)節(jié)素多鑒定出7條肽段， 這些新增肽段與已鑒定肽段存在關(guān)聯(lián)性， 例如， 在第一次分析中鑒定含有DQSRVLNLGPITR序列的總共15條肽段（如VIDQSRVLNLGPITRK）， 但未鑒定到該肽段， 鑒定到肽段VIDQSRVLNLGPITRKGV， 但未鑒定到VIDQSRVLNLGPITRKG， 血紅蛋白α鏈和膠原蛋白α1鏈等其它蛋白也存在類似情況， 因此， 可以謹(jǐn)慎推測(cè)， 在單次分析的情況下， 特別是對(duì)于階梯序列肽段， 還存在一些未被鑒定的相關(guān)肽段是可能的。通過增加測(cè)定次數(shù)鑒定到的肽段出現(xiàn)頻率很低， 通常僅在7次中的1或2次能被檢測(cè)到， 但歸屬于新的蛋白質(zhì)， 因此， 以這類蛋白質(zhì)作為潛在的生物標(biāo)志物最好進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證以排除方法原因。

蛋白質(zhì)組學(xué)和多肽組學(xué)的檢測(cè)對(duì)象都為肽段， 分析結(jié)果都受樣本處理方法和分析次數(shù)的影響， 對(duì)于高豐度的蛋白質(zhì)或肽段這兩種分析體系的重現(xiàn)性都較好， 但后者為不經(jīng)過特異性酶切的天然降解肽段， 經(jīng)常檢出的階梯降解序列肽段對(duì)于蛋白質(zhì)鑒定而言有冗余性。因此， 多肽組的分析結(jié)果在蛋白質(zhì)水平上的重現(xiàn)性要優(yōu)于肽段。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明， 即使對(duì)于尿液這樣簡(jiǎn)單的體系， 鳥槍法的重現(xiàn)性對(duì)多肽組定性結(jié)果的影響仍不可忽視。研究發(fā)現(xiàn)3次平行實(shí)驗(yàn)后肽段及其歸屬蛋白質(zhì)數(shù)目增加趨于平緩。進(jìn)一步分析表明， 多肽組中低豐度肽段的鑒定具有一定的偶然性， 而高豐度肽段的鑒定具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性； 在蛋白質(zhì)水平上， 單次測(cè)定與7次合并分析對(duì)高豐度蛋白質(zhì)的鑒定結(jié)果基本一致， 說明利用蛋白質(zhì)作為多肽組學(xué)生物標(biāo)志物的指標(biāo)在方法學(xué)上更為穩(wěn)健， 提示若兩組不同樣品在蛋白質(zhì)水平存在多條肽段的有和無的差異， 則單次分析亦可得到可靠的結(jié)果。但是， 如果僅利用單一肽段的差異表征生物標(biāo)記物， 則需要進(jìn)行3次以上的平行實(shí)驗(yàn)。本研究結(jié)果可為多肽組學(xué)生物標(biāo)記物研究提供方法學(xué)依據(jù)和參考。endprint