氧化苦參堿對(duì)阿爾茨海默病認(rèn)知功能障礙的作用研究*

丁未堯,周 凱,謝 航,徐華容,李彩蓉,蔡 飛**

(1.湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室)

氧化苦參堿對(duì)阿爾茨海默病認(rèn)知功能障礙的作用研究*

丁未堯1,2,周 凱1,謝 航1,2,徐華容1,2,李彩蓉1,蔡 飛1,2**

(1.湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室)

目的研究氧化苦參堿(OMT)對(duì)阿爾茨海默病(AD)大鼠認(rèn)知功能障礙的作用及機(jī)制。方法取32只雄性SD大鼠分為四組，正常對(duì)照組給予生理鹽水灌胃；STZ組給于大鼠側(cè)腦室注射鏈脲佐菌素(STZ)制作AD學(xué)習(xí)記憶障礙模型后給于生理鹽水灌胃；STZ+OMT組在建立AD模型后給予OMT灌胃；OMT組給予OMT灌胃。每組各8只，連續(xù)給藥2周。通過Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶情況；Elisa法測(cè)定海馬組織炎癥因子的變化。結(jié)果大鼠Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)STZ組大鼠記住原有平臺(tái)所在位置的能力較差，經(jīng)過OMT治療后，大鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間有明顯的增加(P<0.05)。STZ組大鼠海馬組織細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的含量明顯升高(P<0.01)，經(jīng)過OMT給藥后，TNF-α和IL-6的含量明顯的下降(P<0.01)。結(jié)論OMT可改善STZ側(cè)腦室注射所致大鼠學(xué)習(xí)記憶損害，該作用與抑制腦組織炎性反應(yīng)有關(guān)。

氧化苦參堿；鏈脲佐菌素；阿爾茨海默病；學(xué)習(xí)記憶

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種與年齡密切相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能障礙。AD是導(dǎo)致癡呆癥的主要原因之一，隨著人口老齡化的增加，AD的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)，給患者、家庭以及社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。大量的研究表明[1]，氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)是AD神經(jīng)元損傷的早特特征，尋找抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的藥物，有助于防治AD神經(jīng)元損傷及其認(rèn)知功能障礙。

氧化苦參堿(Oxymatrine，OMT)是從豆科屬植物苦參或平科植物廣豆根中分離出來的生物堿，具有廣泛的藥理活性，在肝纖維化、病毒性肝炎、皮膚病、自身免疫性疾病的治療中起到重要作用[2]。最近研究發(fā)現(xiàn)OMT可改善糖尿病所致的認(rèn)知功能障礙，并且可通過Toll樣受體抑制炎癥反應(yīng)防治腦組織損傷作用[2]，但其是否對(duì)AD樣認(rèn)知功能障礙有作用，尚未見報(bào)道。本研究通過大鼠側(cè)腦室注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)制作AD樣學(xué)習(xí)記憶障礙動(dòng)物模型，并給予OMT進(jìn)行干預(yù)，從而研究OMT對(duì)STZ所致的AD學(xué)習(xí)記憶損害的防治作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

32只雄性SPF級(jí)SD大鼠[購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2014]，體重230～250g。實(shí)驗(yàn)共分為四組，每組各8只。正常對(duì)照組：灌胃1mL/100g生理鹽水，連續(xù)2周；STZ組：側(cè)腦室注射STZ建立AD模型，手術(shù)結(jié)束后給予灌胃1mL/100g生理鹽水，連續(xù)2周；STZ+OMT組：側(cè)腦室注射STZ建立AD模型，手術(shù)結(jié)束后灌胃OMT 50mg/(kg·d)，連續(xù)2周；OMT組：灌胃OMT 50mg/(kg·d)，連續(xù)2周。

1.2 AD樣學(xué)習(xí)記憶障礙模型制備

采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠并固定在立體定位儀上。去除大鼠頸部的毛，在前囟向后1.0mm，右側(cè)旁開1.5mm處用微鉆頭鉆開顱骨，用微量注射器將10μL的STZ溶液(1.5mg/kg)注射到右側(cè)側(cè)腦室(垂直進(jìn)針3.6mm)。給藥完成后用牙科粉對(duì)鉆孔位置進(jìn)行填補(bǔ)，常規(guī)飼養(yǎng)48h后在大鼠另一側(cè)的側(cè)腦室也同樣進(jìn)行注射。具體操作參考我們以前的方法進(jìn)行[3]。

1.3 Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

將大鼠放置Morris水迷宮的第Ⅰ象限中，將平臺(tái)放置第III象限，讓大鼠自由尋找平臺(tái)，適應(yīng)平臺(tái)的位置，連續(xù)進(jìn)行5d。在第6d，進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠從象限Ⅰ到達(dá)平臺(tái)所需的時(shí)間，稱為逃逸潛伏期。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤除水下平臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，選取象限I作為入水點(diǎn)，記錄90s內(nèi)大鼠在平臺(tái)原來所在象限Ⅲ內(nèi)停留的時(shí)間，從而檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。具體操作參考我們以前的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行[4]。

1.4 炎癥因子檢測(cè)

細(xì)胞因子TNF-α和IL-6檢測(cè)采用ELISA法進(jìn)行，用TNF-α和IL-6抗體包被微孔板形成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入處理好的海馬組織樣本，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的TNF-α和IL-6抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺顯色。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中TNF-α和IL-6的濃度。具體按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 大鼠AD樣學(xué)習(xí)記憶障礙分析

采用Morris水迷宮觀察OMT對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)能力的影響。在定位巡航實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，STZ組與正常對(duì)照組相比大鼠逃逸潛伏期明顯延長(zhǎng)，表現(xiàn)出較差的學(xué)習(xí)能力。STZ+OMT組、OMT組與STZ組相比顯著提高了AD樣學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠的空間學(xué)習(xí)能力，表現(xiàn)為在水迷宮中找到目標(biāo)平臺(tái)所需要的時(shí)間顯著縮短(P<0.01)。在空間探索實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，STZ組大鼠記住原有平臺(tái)所在位置的能力較差，表現(xiàn)為在目標(biāo)象限停留的時(shí)間明顯減少，經(jīng)過OMT治療后，大鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間有明顯的增加(P<0.05)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OMT顯著改善大鼠AD樣學(xué)習(xí)記憶障礙。見表1。

表1 大鼠Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

與正常對(duì)照組相比，*P<0.01;與STZ組相比，#P<0.05、##P<0.01

2.2 大鼠海馬組織炎癥因子檢測(cè)

炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦組織損傷的重要因素，我們檢測(cè)了海馬組織炎癥因子含量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)STZ組大鼠海馬組織細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的含量較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，經(jīng)過OMT給藥后，TNF-α和IL-6的含量明顯的下降(P<0.01)。研究還發(fā)現(xiàn)OMT對(duì)正常海馬組織中的TNF-α及IL-6沒有明顯的影響(P>0.01)。以上研究結(jié)果表明，OMT可通過腦組織炎性細(xì)胞因子的水平，從而改善AD樣學(xué)習(xí)記憶障礙。見表2。

表2 大鼠海馬組織炎癥因子檢測(cè)結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，*P<0.01;與STZ組相比，#P<0.01；與STZ+OMT組相比，△P<0.01

3 討 論

AD是老年性癡呆癥最為常見的形式之一，葡萄糖糖利用減少，能量代謝障礙以及炎癥反應(yīng)可能是AD認(rèn)知功能障礙產(chǎn)生的重要原因[5]。大量研究發(fā)現(xiàn)AD的腦部病理特性和2型糖尿病腦部病變之間關(guān)系密切[6]。STZ是一種腹腔內(nèi)注射可導(dǎo)致胰島壞死的藥物，常常用來制作糖尿病動(dòng)物模型。側(cè)腦室注射少量的STZ可引起大鼠的大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)葡萄糖代謝降低、氧化應(yīng)激損傷、炎性反應(yīng)，其病理生理學(xué)改變與AD樣學(xué)習(xí)記憶障礙模型的損傷非常相似，大鼠表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知行為的損害，因此STZ側(cè)腦室注射是制作AD癡呆動(dòng)物模型的重要方法之一[7]。

在本研究中，我們首先使用Morris水迷宮來觀察大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室注射STZ的大鼠需要較長(zhǎng)時(shí)間才能找到目標(biāo)平臺(tái)，并且在目標(biāo)象限停留的時(shí)間也明顯減少，反映出SZT側(cè)腦室注射可導(dǎo)致大鼠空間學(xué)習(xí)障礙。通過給予OMT進(jìn)行治療后發(fā)現(xiàn)大鼠逃避潛伏期變短，并增加其在目標(biāo)象限停留的時(shí)間，提示OMT具有防治AD樣癡呆的作用。我們通過對(duì)海馬組織TNF-α和IL-6水平的檢測(cè)，證實(shí)了OMT可抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

綜上所述，OMT可改善STZ側(cè)腦室注射所致大鼠學(xué)習(xí)記憶損害，該作用可能與抑制腦組織炎性反應(yīng)有關(guān)。

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TheEffectsofOxymatrineonLearningandMemoryDeficitsofAlzheimer'sDisease

DING Wei-yao,ZHOU Kai,CAI Fei,et al

(HubeiProvincialKeyLaboratoryofDiabeticCardiovascularDisease,HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

ObjectiveTo explore the effect and mechanism of oxymatrine on cognitive dysfunction in rats with Alzheimer's disease.Methods32 male SD rats were divided into four groups. The control group was given normal saline.The model of AD like learning and memory impairment was made by intracerebroventricular injection of streptozotocin (STZ). The STZ+OMT group was given orally with OMT after intracerebroventricular injection of STZ. The OMT group was given intragastric administration of OMT. Each group had 8 rats，and they were given 2 weeks of continuous administration. The learning and memory ability of rats was detected by Morris water maze and the changes of inflammatory reaction in hippocampus were determined by Elisa test.ResultsThe Morris Morris water maze test showed that the ability of STZ treated rats to remember the location of the original platform was poor. After OMT treatment，the time of the rats staying in the target quadrant was significantly increased(P<0.05).The levels of TNF-α and IL-6 in hippocampus of STZ group were significantly increased (P<0.01)，and the contents of TNF-α and IL-6 were significantly decreased after OMT administration，(P<0.01).ConclusionOxymatrine can improve the learning and memory impairment induced by intracerebroventricular injection of STZ in rats which may be related to the inhibition of inflammatory response in brain tissue.

Oxymatrine;Streptozotocin;Alzheimer's disease;Learning and memory

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(201410927001，201510927010)，湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2017CFB410)

**通訊作者，E-mail:xncf@163.com

R-332

A

2095-4646(2017)05-0372-03

10.16751/j.cnki.2095-4646.2017.05.0372

2017-06-03)