基因工程單純皰疹病毒-1 KTR27治療骨肉瘤的實驗研究

王迪凡徐立輝吳杰*

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院骨科，北京100050；2.北京大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院北京積水潭醫(yī)院骨腫瘤科，北京100035）

基因工程單純皰疹病毒-1 KTR27治療骨肉瘤的實驗研究

王迪凡1徐立輝2吳杰1*

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院骨科，北京100050；2.北京大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院北京積水潭醫(yī)院骨腫瘤科，北京100035）

背景：近年來，骨肉瘤的治療處于一個平臺期，探索新的治療方式成為廣泛的共識。隨著腫瘤分子生物學(xué)和基因工程學(xué)的發(fā)展，使用溶瘤病毒治療惡性腫瘤成為一個熱點。目的：探討基因工程單純皰疹病毒-1（herpes simplex virus 1，HSV-1）KTR27對骨肉瘤細(xì)胞系U2OS的體外作用以及裸鼠骨肉瘤模型局部原發(fā)腫瘤的作用。方法：采用體外實驗觀察KTR27對U2OS細(xì)胞系的細(xì)胞致病作用。裸鼠皮下注射人骨肉瘤細(xì)胞株U2OS，建立骨肉瘤裸鼠模型，在此基礎(chǔ)上將動物模型隨機(jī)分為6組，2組為空白對照，分別喂飼普通鼠糧和含強(qiáng)力霉素的鼠糧；2組瘤內(nèi)注射KTR27（1×107PFU/50 μl），喂飼普通鼠糧和含強(qiáng)力霉素的鼠糧；2組瘤內(nèi)注射DMEM 50 μl，喂飼普通鼠糧和含強(qiáng)力霉素的鼠糧。計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線，同時行組織學(xué)檢查。結(jié)果：體外實驗顯示KTR27對U2OS有明顯的致病作用，形成空斑。成功建立U2OS細(xì)胞系的骨肉瘤裸鼠模型并得到腫瘤生長曲線，注射KTR27后測量各組腫瘤體積大小，顯示各組腫瘤體積無顯著性差異（P＞0.05）。各組腫瘤體積時間變化曲線分析顯示，各組的時間趨勢不同，相比較有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.05）。可見注射KTR27的腫瘤生長趨勢受到抑制，與加用強(qiáng)力霉素后沒有顯著性差異（P＞0.05）。注射KTR27后24 h病理切片顯示腫瘤壞死增加，但7 d后腫瘤局部恢復(fù)增長。結(jié)論：基因工程HSV-1 KTR27對U2OS細(xì)胞有明顯的細(xì)胞致病作用。使用U2OS細(xì)胞系建立裸鼠皮下骨肉瘤模型，然后局部瘤內(nèi)注射基因工程HSV-1 KTR27，腫瘤的生長趨勢受到了抑制，加用強(qiáng)力霉素后這種抑制沒有明顯區(qū)別。

骨肉瘤;裸鼠;溶瘤病毒;單純皰疹病毒

基因工程單純皰疹病毒-1（herpes simplex virus 1,HSV-1）是溶瘤病毒家族中的一員，其第一個增殖型載體dlsptk被用于惡性膠質(zhì)瘤的治療[1]。近年來多個HSV-1來源的載體在膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、卵巢癌等許多腫瘤動物實驗和臨床試驗中顯示出一定的腫瘤特異性和腫瘤控制作用。這些載體都是通過刪減HSV-1上的一些基因達(dá)到控制其在正常細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染能力?；蚬こ蘃SV-1 KTR27是一個新的控制增殖型HSV-1載體，它是通過刪減HSV-1的ICP0基因，并通過嵌入四環(huán)素基因調(diào)控器控制ICP27基因的表達(dá)，通過2個基因的控制來進(jìn)一步提高其安全性[2]。

本研究在體外實驗中檢測了KTR27在U2OS細(xì)胞內(nèi)的增殖和細(xì)胞致病作用。進(jìn)而使用U2OS細(xì)胞系建立裸鼠皮下骨肉瘤模型，并在此基礎(chǔ)上研究基因工程HSV-1 KTR27對骨肉瘤的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和設(shè)備

細(xì)胞系為人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS，由北京大學(xué)腫瘤學(xué)院遺傳室提供。實驗動物為BALB/c，nu/nu裸小鼠，由北京腫瘤防治研究所中心實驗室提供，鼠齡4～6周，均為雄性。飼養(yǎng)于北京腫瘤防治研究所中心實驗室裸鼠間SPF環(huán)境中，生長良好。鼠糧由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所提供，分為普通鼠糧和含鹽酸強(qiáng)力霉素的特殊鼠糧兩種。其中特殊鼠糧鹽酸強(qiáng)力霉素含量為200 mg/kg。基因工程HSV-1 KTR27由哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。KTR27為復(fù)制受強(qiáng)力霉素調(diào)控的基因工程HSV-1載體，濃度為2.3×108PFU/ml。DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清（天津血液研究所產(chǎn)品），1%中性紅溶液，甲基纖維素（MTC）覆蓋培養(yǎng)基。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Hereus Instruments），倒置相差顯微鏡（Nikon Co.）。

1.2 基因工程HSV-1 KTR27的擴(kuò)增

第0天，培養(yǎng)瓶中放置2×106個U2OS細(xì)胞。第3天使用KTR27原液轉(zhuǎn)染U2OS細(xì)胞，MOI值為0.005 PFU/細(xì)胞。37℃孵育1.5 h，更換培養(yǎng)液，加入10 ml含5 μg強(qiáng)力霉素（濃度0.5 μg/ml）的DMEM培養(yǎng)基。第7天，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞離心15 min，將細(xì)胞團(tuán)懸浮放置于培養(yǎng)基中-80℃儲存。第8～10天，冰凍和融化3次上述細(xì)胞株，每次于37℃融化后立刻將細(xì)胞株重新懸浮于培養(yǎng)基中。低速離心15 min，使大的細(xì)胞碎片沉至底部。將上清液-80℃儲存。使用暴露于強(qiáng)力霉素環(huán)境下的U2OS細(xì)胞測定上述病毒原液的濃度。

1.3 基因工程HSV-1 KTR27在U2OS細(xì)胞內(nèi)增殖及細(xì)胞致病作用的觀察

于培養(yǎng)皿中放置7.5×105個U2OS細(xì)胞，3 d后使用病毒原液轉(zhuǎn)染培養(yǎng)皿。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)皿中加入含12.5 μg強(qiáng)力霉素（濃度2.5 μg/ml）的培養(yǎng)基。加入含強(qiáng)力霉素培養(yǎng)基3 h后，倒掉培養(yǎng)基，加入含10 μg強(qiáng)力霉素（濃度10 μg/ml）的培養(yǎng)基。使用甲基纖維素培養(yǎng)基覆蓋單細(xì)胞層，存放于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。每日于普通光學(xué)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及空斑形成單位的情況。

1.4 建立U2OS裸鼠皮下骨肉瘤模型

將U2OS細(xì)胞復(fù)蘇，培養(yǎng)，傳代，經(jīng)計數(shù)制成1×106個/0.2 ml DMEM和1×105個/0.2 ml DMEM的細(xì)胞懸液。分別取8只裸鼠，把細(xì)胞懸液接種于裸鼠雙側(cè)腹股溝區(qū)皮下。隔日觀察接種部位有無感染。飼養(yǎng)3周，每隔2～3 d測量體重。

1.5 測量腫瘤大小

接種8 d后，每隔2～3 d以游標(biāo)卡尺測量皮下腫瘤的長徑a與短徑b，計算腫瘤體積V=ab2/2[3]。根據(jù)腫瘤體積測繪腫瘤生長曲線，測量裸鼠體重。

1.6 組織學(xué)檢查

接種后2周頸椎脫位處死裸鼠，局部切除腫瘤組織，多聚甲醛固定后行石蠟包埋切片，以5 μm層厚切片，蘇木精—伊紅染色觀察。

1.7 皮下瘤內(nèi)注射KTR27治療效果的觀察與評估

33只裸鼠，隨機(jī)分6組，每組5～6只。無菌條件下把1×106個/0.2 ml DMEM的U2OS細(xì)胞懸液接種于裸鼠左側(cè)腹股溝區(qū)皮下。隔日觀察接種部位有無感染。飼養(yǎng)3周，每隔2～3 d測量體重。分組與給藥情況見表1。

接種8 d后，每隔2～3 d以游標(biāo)卡尺測量皮下腫瘤的長徑a與短徑b，計算腫瘤體積V=ab2/2。根據(jù)腫瘤體積測繪腫瘤生長曲線，測量裸鼠體重。

第3次注射處理后7 d，切取腫瘤組織，多聚甲醛固定后行石蠟包埋切片，以5 μm層厚連續(xù)切片，蘇木精—伊紅染色觀察。對照組按相應(yīng)時間做相同處理。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，行重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析檢驗，p＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 基因工程HSV-1 KTR27在U2OS細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染

可見U2OS細(xì)胞皺縮、變圓，并有空斑形成（圖1）。

2.2 U2OS腫瘤細(xì)胞皮下接種后腫瘤生長曲線的建立

1×106個細(xì)胞/0.2 ml種植組8只中有6點出現(xiàn)了生長，其體積變化生長曲線如圖2。裸鼠未出現(xiàn)消瘦或死亡。而1×105個細(xì)胞/0.2 ml種植組在8個點僅有2點出現(xiàn)生長。

表1 瘤內(nèi)注射KTR27療效觀察的分組與給藥

圖1 KTR27轉(zhuǎn)染U2OS細(xì)胞后第3天

可見1×106個細(xì)胞/0.2 ml種植組腫瘤在觀測期內(nèi)均呈加速生長趨勢。統(tǒng)計學(xué)顯示在腫瘤生長初期，方差較大，而后期腫瘤平均值＞2倍方差，表明腫瘤大小變化基本符合正態(tài)分布（圖2）。

2.3 動物模型腫瘤組織學(xué)檢查

大體標(biāo)本：瘤體質(zhì)韌，隆起于皮下，瘤體斷面可見魚肉樣改變。鏡下組織病理：可見成骨，腫瘤細(xì)胞類圓形，核仁明顯，2～3個核仁/細(xì)胞，伴病理核分裂像，＞20個/10個高倍視野。腫瘤組織侵潤骨骼肌，伴壞死灶，局部呈凝固性壞死（圖3），符合成骨肉瘤。

圖2 1×106個細(xì)胞/0.2 μl種植組腫瘤生長曲線

圖3 皮下腫瘤鏡下組織病理（HE染色，40×），可見成骨（紫色），細(xì)胞明顯異型性，伴異常核分裂

2.4 分組治療及對照組的腫瘤局部觀察

在第3次注射處理后10 d測量各組腫瘤體積大小，A組（73.13±22.01）cm3，B組（50.47±22.38）cm3，C組（84.40±28.41）cm3，D 組（53.24±20.35）cm3，E 組（41.00±23.49）cm3，F(xiàn)組（105.88±29.66）cm3。各組腫瘤體積無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

各組腫瘤體積時間變化曲線（圖4）分析顯示，各組的時間趨勢不同，有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.05）?？梢娮⑸銴TR27的兩組腫瘤體積出現(xiàn)縮小，腫瘤生長趨勢受到抑制。

圖4 各組腫瘤生長時間曲線

2.5 行KTR27及DMEM注射治療后24 h的腫瘤組織病理學(xué)檢查

KTR27注射24 h后的腫瘤標(biāo)本病理切片可見較多壞死組織（圖5）。KTR27注射后7 d的腫瘤標(biāo)本病理切片可見壞死區(qū)域較24 h的標(biāo)本減小，腫瘤組織有所恢復(fù)（圖6）。

圖5 腫瘤注射KTR27后24 h鏡下組織病理（HE染色，10×），可見較多壞死組織

圖6 腫瘤注射KTR27后7 d鏡下組織病理（HE染色，10×），腫瘤細(xì)胞增多，壞死減少

3 討論

溶瘤病毒治療的基本策略就是在最大程度上減低對正常組織損傷的前提下利用病毒感染增殖破壞腫瘤細(xì)胞。本研究中使用的溶瘤病毒為基因工程改造過的HSV-1。目前已經(jīng)用于Ⅰ期臨床試驗的HSV-1載體主要用于復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、高度惡性膠質(zhì)瘤以及結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療[4-6]，治療方式以瘤內(nèi)注射為主，部分病例生存期延長，部分腫瘤出現(xiàn)了壞死或縮小改變。體外細(xì)胞實驗的研究結(jié)果[7]表明，HSV-1對于骨肉瘤細(xì)胞存在一定的易感性。在肯定溶瘤病毒的腫瘤治療效能時，還要考慮病毒使用的安全問題。惡性腫瘤細(xì)胞由于本身基因染色體不穩(wěn)定、細(xì)胞防御機(jī)制弱、細(xì)胞表面病毒受體多等多方面因素更容易感染病毒[8-11]。病毒對腫瘤細(xì)胞的這一選擇特性，在一定程度上實現(xiàn)了病毒的靶向治療，但仍有可能造成對正常組織的損傷，因此如何增強(qiáng)病毒的腫瘤特異性，更好的控制病毒在體內(nèi)的增殖，成為當(dāng)今研究的主要方向。

本研究采用經(jīng)過基因工程改造的HSV-1 KTR27進(jìn)行針對骨肉瘤溶瘤治療的體內(nèi)和體外實驗研究。KTR27是由哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院開發(fā)研制的新型HSV-1載體。該團(tuán)隊開發(fā)了一種四環(huán)素on/off調(diào)控系統(tǒng)（TRExTM;Invitrogen,Carlsbad,CA,USA；美國專利號5972650,10/26,1999），通過基因工程用四環(huán)素調(diào)控的啟動子取代HSV-1的ICP0基因（病毒復(fù)制），并控制ICP27基因（病毒復(fù)制）的表達(dá)，同時在ICP27的5'不表達(dá)區(qū)域插入一個核酶來減少ICP27的表達(dá)，這兩個基因的控制明顯降低了HSV-1的復(fù)制能力。而四環(huán)素可以開啟ICP27基因片段，去除對病毒復(fù)制的抑制，引發(fā)病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖。研究表明，在不同的人類腫瘤細(xì)胞中，四環(huán)素的存在可以使KTR27的復(fù)制能力增加1000～35萬倍。在對人類肺癌裸鼠模型進(jìn)行基因工程HSV-1 KTR27瘤內(nèi)注射后，腫瘤的生長有抑制，而使用四環(huán)素后抑制作用更為明顯[12]。

使用裸鼠建立人類腫瘤的動物模型來評估和預(yù)測藥物臨床藥效是一個非常有效的方法[13]。本研究使用人骨肉瘤細(xì)胞細(xì)胞系U2OS對裸鼠進(jìn)行皮下注射，建立了異種移植模型。對于體內(nèi)實驗病毒用量的選擇，參考之前U2OS體內(nèi)實驗的結(jié)果并在此基礎(chǔ)上通過向U2OS細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染不同濃度的病毒，觀察噬斑的形成情況，空斑出現(xiàn)提示KTR27病毒在U2OS細(xì)胞中復(fù)制活躍，KTR27對U2OS細(xì)胞有抑制作用[14]。

結(jié)果顯示，注射KTR27的兩組裸鼠的腫瘤生長曲線發(fā)生了變化，雖然腫瘤沒有完全消失，但腫瘤增長趨勢受到了抑制，而其他4組腫瘤增長趨勢沒有明顯抑制。這表明KTR27瘤內(nèi)注射起到了抑制腫瘤生長的作用。按照目前的療效評估標(biāo)準(zhǔn)，這是一種有效的治療[13]。腫瘤組織病理切片顯示病毒瘤內(nèi)注射24 h后，腫瘤內(nèi)的壞死組織明顯增加，而作用7 d后再檢查病理發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)壞死面積有一定程度的縮小，說明腫瘤生長有部分恢復(fù)。惡性腫瘤的其他治療方式，如手術(shù)、放療或化療，都可以使腫瘤體積明顯縮小或者消失。但相比之下，使用溶瘤病毒這種生物治療的安全性要高得多。溶瘤病毒治療腫瘤的重要作用機(jī)制就是病毒載體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞溶解凋亡，從而抑制腫瘤的生長；此外腫瘤溶解后特異抗原的釋放又可以激發(fā)機(jī)體針對腫瘤的特異免疫，包括細(xì)胞免疫和全身免疫，而這一機(jī)制對于溶瘤治療的長期治療效應(yīng)的發(fā)揮，特別是抑制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有非常重要的意義。對于前者，如何實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的充分轉(zhuǎn)染是一個難題。隨著腫瘤的增大，很多因素都會干擾局部病毒注射的效果，使病毒難以實現(xiàn)充分轉(zhuǎn)染。實體腫瘤體積增大后，內(nèi)部往往不均勻一致，如壞死、鈣化區(qū)域會影響溶瘤病毒的療效[15]；此外，體積增大后實體腫瘤內(nèi)部壓力往往會隨之明顯增加，也會限制溶瘤病毒的播散和轉(zhuǎn)染[16-19]，因此，選擇在腫瘤多大時進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染，以及采用何種轉(zhuǎn)染方式很重要。研究發(fā)現(xiàn)較小的腫瘤體積容易被感染（＜0.4 cm3），局部給藥的效果要優(yōu)于靜脈給藥[20]。然而腫瘤太小會使瘤內(nèi)注射的難度增加，無法保證病毒真正進(jìn)入腫瘤內(nèi)部，因此選擇腫瘤直徑在3～5 mm時進(jìn)行局部瘤內(nèi)注射操作，兼顧了操作方便和利于病毒充分轉(zhuǎn)染兩方面因素。但腫瘤的生長存在一定的差異，后兩次藥物注射時部分腫瘤已經(jīng)較大，直徑超過了5 mm，且局部質(zhì)地較硬，形狀不規(guī)則，甚至呈菜花狀，這種情況又增加了藥物瘤內(nèi)二次注射的難度，可能會大大降低病毒的有效播散，直接影響基因工程HSV-1 KTR27的溶瘤作用，這也可以解釋為什么后期腫瘤生長會出現(xiàn)部分恢復(fù)。該研究提示，溶瘤病毒對于較小的腫瘤組織抑制效果較好，可操作性強(qiáng)。因此臨床上可以考慮應(yīng)用于體積較小的原發(fā)腫瘤或腫瘤無法進(jìn)行切除如頭頸部腫瘤進(jìn)行瘤內(nèi)注射，還有可能發(fā)揮遠(yuǎn)期控制腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用。結(jié)合體外細(xì)胞實驗，在微觀水平上，基因工程HSV-1 KTR27能夠選擇性實現(xiàn)對骨肉瘤細(xì)胞U2OS的轉(zhuǎn)染和溶解。在臨床上，常常會遇到骨肉瘤臨近一些無法切除的重要結(jié)構(gòu)如主要神經(jīng)血管束而無法實現(xiàn)理想的手術(shù)邊界。如果能夠局部使用這種溶瘤病毒也許能夠取得一些控制作用。

安全性問題是所有臨床治療手段都要考慮的問題，病毒也不例外，要保證在實施腫瘤治療時的靶向性盡量不損傷正常組織。KTR27的安全保障是通過加入一個強(qiáng)力霉素調(diào)控原件實現(xiàn)的，在有強(qiáng)力霉素存在時，ICP27可以表達(dá)，KTR27開始高效復(fù)制。而沒有強(qiáng)力霉素時，病毒低擴(kuò)增或不擴(kuò)增。在本實驗中，對裸鼠進(jìn)行KTR27注射后，裸鼠的狀態(tài)沒有明顯改變，各組的體重也沒有明顯變化，這說明基因工程HSV-1 KTR27至少對于裸鼠瘤內(nèi)注射是安全的。在評估本實驗中強(qiáng)力霉素效果時發(fā)現(xiàn)，食用含鹽酸強(qiáng)力霉素鼠糧與使用普通鼠糧的兩組裸鼠的腫瘤體積沒有明顯區(qū)別。分析原因可能主要有以下幾點：①U2OS細(xì)胞的特殊性。U2OS本身能夠產(chǎn)生替代HSV-1的ICP0調(diào)節(jié)蛋白，而制造KTR27的一個最主要的控制HSV-1復(fù)制能力、減低毒性的基因工程改變依靠的就是ICP0基因的刪除。這種情況下，靠強(qiáng)力霉素調(diào)控打開ICP27表達(dá)增加的復(fù)制能力有限，體現(xiàn)在宏觀實體腫瘤上的變化就更有限了。②局部KTR27的注射劑量。如果劑量偏大，則強(qiáng)力霉素控制放大的復(fù)制轉(zhuǎn)染的效果可比性會相對減小。本研究證實溶瘤病毒在骨肉瘤細(xì)胞體內(nèi)外實驗中對腫瘤有抑制作用。

綜上所述，體外實驗顯示基因工程HSV-1 KTR27對U2OS細(xì)胞有明顯的細(xì)胞致病作用。在裸鼠骨肉瘤模型局部瘤內(nèi)注射基因工程HSV-1 KTR27，腫瘤的生長趨勢受到了抑制，加用強(qiáng)力霉素后這種抑制沒有明顯區(qū)別。

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Effect of a novel oncolytic herpes simplex virus KTR27 on nude mouse model of human osteosarcoma

WANG Difan1,XU Lihui2,WU Jie1*
(1.Department of Orthopaedics,Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050;2.Department of OrthopaedicOncology,Beijing Jishuitan Hospital,FourthClinicalMedicalCollege,PekingUniversity,Beijing100035,China)

Background:In recent years the treatment of osteosarcoma has been on a plateau and it is necessary to explore new ways.With the development of tumor molecular biology and genetic engineering,oncolytic virus has become a hot spot due to its effect in treatment of malignant tumors.Objective:To investigate the effect of a novel oncolytic herpes simplex virus KTR27 on U2OS,a human osteosarcoma cell line,in vitro and nude mouse model of osteosarcoma with local primary tumor.Methods:Observe the cytopathogenic effect of KTR27 on U2OS cell through in vitro experiment.U2OS cell strain was injected into nude mice subcutaneously to establish nude mouse models of osteosarcoma,which were randomly divided into six groups including two blank control groups fed with common food and special food with tetracycline respectively;two groups injected with KTR27 of 1×107PFU/50 μl intratumorally and fed with common food and special food with tetracycline respectively;two groups injected with DMEM 50μl intratumorally and fed with common food and special food with tetracycline respectively.Measure and calculate the volume of tumors.Set up and compare the growth curve.Histological examination was carried out.Results:In vitro experiment showed that KTR27 had an obvious cytopathogenic effect on U2OS cell and many plaques were formed in cell culture.Nude mouse models of osteosarcoma by U2OS cell strain were successfully established and tumor growth curves were obtained.Tumor volumes of all groups were measured after KTR27 injection,and there were no significant difference among groups(P＞0.05).The volume-time variation curves of all groups showed that the time tendency was significantly different among groups(p＜0.05).After KTR27 injection,the tumor volume reduced and the tumor growth tendency was suppressed,and there was no significant difference between mice fed with common food and mice fed with special food with tetracycline(P＞0.05).An increased tumor necrosis at 24 h after KTR27 injection was shown but tumor sites began to grow again after 7 days by pathologic examination.Conclusions:KTR27 has an obvious cytopathogenic effect on U2OS cell,therefore it can suppress the growth of tumor in nude mouse model of osteosarcoma established by injection with human osteosarcoma cell line U2OS subcutaneously.The effect has no change after administration with tetracycline.

Osteosarcoma;Nude Mouse;Oncolytic Virus;Herpes Simplex Virus

2095-9958（2017）08-0 341-06

10.3969/j.issn.2095-9958.2017.04-15

*通信作者：吳杰，E-mail：osteowu@aliyun.com