介孔納米羥基磷灰石/聚乳酸復(fù)合物支架與成骨細胞的生物相容性研究*

羅新樂黃術(shù)宋錦旗朱偉民歐陽侃

（1.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，廣東深圳518109；2.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，廣東深圳518110；3.深圳市第二人民醫(yī)院運動醫(yī)學科，廣東深圳518100）

?基礎(chǔ)研究?

介孔納米羥基磷灰石/聚乳酸復(fù)合物支架與成骨細胞的生物相容性研究*

羅新樂1**黃術(shù)2宋錦旗2朱偉民3歐陽侃3

（1.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，廣東深圳518109；2.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，廣東深圳518110；3.深圳市第二人民醫(yī)院運動醫(yī)學科，廣東深圳518100）

背景：目前骨組織工程中，支架材料的生物相容性和生物力學性能都不盡滿意，后續(xù)的材料降解也是亟待解決的問題。新材料、方法、技術(shù)以及醫(yī)學研究相結(jié)合，可以使骨組織工程中支架的外形與結(jié)構(gòu)、生物相容性、降解速率都有很好的改進。目的：通過介孔納米羥基磷灰石/聚乳酸（nano-hydroxyapatite/poly lactic acid,nHA/PLLA）復(fù)合物的支架構(gòu)建以及與成骨細胞的相容性研究，旨在開發(fā)由2種材料復(fù)合而成具有更好的生物相容性的骨組織工程支架。方法：采取冷凍快速成型法制備nHA/PLLA復(fù)合物，BET法測定孔隙率，掃描電鏡（scanning electron miscroscopy,SEM）觀察材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)等進行物理性能表征，X線衍射（X-ray diffraction,XRD）表征材料物理學特性。SEM觀察成骨細胞在nHA/PLLA內(nèi)生長、黏附、增殖情況；熒光倒置顯微鏡觀察并計算細胞在該支架材料內(nèi)的存活情況；MTT實驗測定nHA/PLLA復(fù)合物對成骨細胞的活性影響。結(jié)果：制備的nHA/PLLA復(fù)合物，通道孔徑為（164±52）μm，介孔率為89.3%±1.4%；干性和濕性nHA/PLLA復(fù)合支架的壓縮模量分別為（1354.6±53.7）kPa和（1012.8±61.3）kPa。MTT實驗結(jié)果表明，nHA/PLLA復(fù)合物對成骨細胞活性無顯著影響，隨著孵育時間的延長，黏附在復(fù)合物表面及介孔中的細胞數(shù)量逐漸增加。結(jié)論：nHA-PLLA復(fù)合物是一種性能良好的骨組織工程支架材料，具有制備簡單、外形及內(nèi)部結(jié)構(gòu)符合組織工程支架要求、與成骨細胞的生物相容性好等優(yōu)點。

納米羥基磷灰石/聚乳酸復(fù)合物；生物相容性；組織工程；成骨細胞

骨與軟骨的缺失在骨科臨床中比較常見，自體骨的移植必定造成新的創(chuàng)傷，異體骨的移植存在排異問題[1-3]。骨組織工程的發(fā)展，首先必須有可靠的支架作為構(gòu)建的基礎(chǔ)，接種骨組織的種子細胞，培養(yǎng)后成功植入人體，成活后支架材料逐漸降解，完全形成新骨組織，達到修復(fù)的目的[4,5]。

骨組織工程中，支架材料選擇非常重要，首先要具有良好的生物相容性，保證氧氣、營養(yǎng)成分傳輸，有利于植入的種子細胞的新陳代謝，使其可以生長發(fā)育。常用支架材料主要包括天然材料，如殼聚糖、纖維素、透明質(zhì)酸，與人工合成材料，如海藻酸鹽、聚乳酸（polylactic acid,PLLA）、聚乙烯醇，兩大類。但是，大多數(shù)傳統(tǒng)支架材料無法滿足生物相容性、良好機械性能等要求，這也限制了組織工程骨在臨床中的應(yīng)用[6-9]。

研究骨組織工程所需的支架材料中，外形與內(nèi)部結(jié)構(gòu)的孔徑必須適合種子生長發(fā)育需要的條件，并且和人體的組織具有良好的生物相容性不被排異，植入人體后可以逐步的被自身組織替代。因此，在本研究中，選擇納米羥基磷灰石與聚乳酸2種材料進行復(fù)合形成支架材料，采用快速成形技術(shù)與冷凍技術(shù)結(jié)合構(gòu)建支架，達到了可以實現(xiàn)對外形的優(yōu)化，又可以利用冰晶升華形成的空隙控制孔徑大多在介孔范圍內(nèi)，同時也保證了與人體組織的相容性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

PLLA（山東岱罡生物材料有限公司），達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle's medium,DMEM）培養(yǎng)液；噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）、細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（美國Sigma公司）；流式細胞檢測試劑盒（美國Sigma公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司），X-650型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM；荷蘭飛利浦公司）。

1.2 nHA/PLLA制備與表征

采用與冷凍技術(shù)結(jié)合的構(gòu)建支架方法，制備納米羥基磷灰石/聚乳酸復(fù)合物，隨機抽取樣本[10]。以BET法測定復(fù)合物材料的孔隙率。材料制成薄片狀，掃描電鏡對表面結(jié)構(gòu)檢測。以X射線光電子能譜表征nHA在PLLA材料中的分布。材料的力學強度通過津島生物力學測試儀器測定。

1.3 成骨細胞接種于支架材料

將nHA/PLLA復(fù)合物置于24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)。取4代以內(nèi)處于對數(shù)生長期的成骨細胞，以胰蛋白酶消化、1000 rpm離心收集細胞，將細胞重懸于培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度至5×104個/ml，取1.0ml接種于nHA/PLLA復(fù)合物材料中。首次換液時間為24 h，隨后每2 d換液1次，于1、3、5 d通過掃描電鏡觀察細胞在材料上的生長情況。

1.4 細胞活性測定

將nHA/PLLA復(fù)合物與成骨細胞混合培養(yǎng)于24孔板內(nèi)，用活/死細胞雙染試劑在24 h、48 h對細胞染色，以倒置熒光顯微鏡觀察細胞活力?；罴毎锈}綠黃素染色后在494 nm下呈現(xiàn)綠光熒光，通過觀察該熒光強度，定性研究細胞活性。

1.5 細胞增殖研究

將nHA/PLLA復(fù)合物與成骨細胞混合培養(yǎng)于24孔板內(nèi)，每孔細胞數(shù)量均約為5×104個/ml。實驗組分別取細胞與支架材料共培養(yǎng)后第1、3、5天后（對照組為無材料細胞懸液；空白對照組為只加培養(yǎng)液），棄培養(yǎng)液，以聚丁二酸丁二醇酯（poly butylene succinate,PBS）洗滌2次。加入預(yù)先配制的MTT 80μl，同時加入400μl無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清并加入700 μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO），振蕩15 min，取溶液150μl至96孔板中。以酶標儀在490 nm處測定吸光光度值（optical density,OD）。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗，以p＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 nHA/PLLA復(fù)合物的形態(tài)表征

制作的nHA/PLLA復(fù)合物，在掃描電鏡50倍鏡下觀察，呈三維網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，復(fù)合支架材料孔徑約為（164±52）μm，各孔之間具有較好的連通性，空隙率為89.3%±1.4%?？讖酱笮〔痪⑶腋骺组g交錯聯(lián)通。該結(jié)構(gòu)是細胞接種與正常生長、黏附、增殖的基礎(chǔ)，保證了細胞的營養(yǎng)供應(yīng)及代謝物的消除（圖1A）。通過掃描電鏡的背散射電子模式觀察nHA在PLLA材料中的分布情況。從圖可知，大量白色納米nHA均勻的分布于PLLA材料中，且該結(jié)構(gòu)通過X射線光電子能譜對磷元素的分析，進行了進一步的驗證（圖1B）。

2.2 相結(jié)構(gòu)和壓縮特性表征

圖1 nHA/PLLA復(fù)合物電鏡掃描下的形態(tài)特征

以X射線衍射（XRD）表征材料的晶型結(jié)構(gòu)特點為，單純PLLA材料具有兩個XRD窄峰，分別為2θ=16.6°與22.3°，說明了PLLA的半結(jié)晶特性（圖2A，黑色曲線）。形成nHA/PLLA復(fù)合物結(jié)構(gòu)后，上述兩個峰消失，說明nHA的結(jié)合減少PLLA的結(jié)晶度（圖2A，紅色曲線）。同時出現(xiàn)了典型nHA的XRD峰，說明nHA已成功復(fù)合與PLLA材料中。

通過應(yīng)力—應(yīng)變曲線表征nHA/PLLA復(fù)合材料的壓縮特性（圖2B）。由圖可知，在0%～45%范圍內(nèi)，材料應(yīng)力隨著應(yīng)變的增加呈線性增強；當應(yīng)變大于45%時，隨著應(yīng)變的增加，應(yīng)力迅速增強。在相同的應(yīng)變下，nHA/PLLA復(fù)合材料的應(yīng)力均高于單純的PLLA材料。濕性nHA/PLLA復(fù)合支架的應(yīng)力略低于干性支架，因為其可發(fā)生微孔的水合作用。干性和濕性nHA/PLLA復(fù)合支架的壓縮模量分別為（1354.6±53.7）kPa和（1012.8±61.3）kPa，而單純PLLA材料僅為（539.3±36.2）kPa，說明nHA的復(fù)合顯著改善了PLLA的機械性能。

圖2 nHA/PLLA復(fù)合物晶型結(jié)構(gòu)曲線及應(yīng)力應(yīng)變曲線

2.3 成骨細胞在nHA/PLLA復(fù)合物中的生長

以掃描電鏡觀察成骨細胞在nHA/PLLA復(fù)合物中的生長，剛接種于材料后，細胞均勻分布于材料表面，且呈規(guī)則圓形，隨培養(yǎng)時間的延長，細胞逐漸沉降至材料孔隙內(nèi)部，輪廓完整黏附在材料壁上，并在支架材料孔隙內(nèi)生長、增殖、分化等。在培養(yǎng)過程中，nHA/PLLA復(fù)合物能保持其完整性，體外培養(yǎng)5 d后未發(fā)現(xiàn)nHA/PLLA明顯降解，能保持孔板內(nèi)部孔隙并維持細胞的正常生長（圖3）。

2.4 細胞活性檢測

體外培養(yǎng)24 h、48 h后，細胞正常生長，活細胞被染色成亮綠色。在培養(yǎng)24 h后，材料中心細胞正常生長（圖4A）；隨著培養(yǎng)時間延長至48 h，綠色熒光亮度進一步增加，表明細胞發(fā)生了進一步生長與分化（圖4B）。以MTT實驗法分析細胞活性，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間的增加各組細胞OD值逐漸增強，骨細胞在實驗組和對照組中增殖均呈上升趨勢，有統(tǒng)計學差異（p＜0.05，圖4C）。

3 討論

本研究中組織工程修復(fù)骨缺損的研發(fā)中所需要的支架構(gòu)成，盡量仿照人體骨的解剖結(jié)構(gòu)與組成，納米羥基磷灰石從成份上接近骨組織，采用快速成形技術(shù)與冷凍技術(shù)相結(jié)合，達到介孔的排列形式，孔徑比較均勻的分布在一定范圍之內(nèi)，盡管介孔呈現(xiàn)多種形態(tài)，孔壁的性質(zhì)好組成可以較好控制。在掃描電鏡下觀察，支架結(jié)構(gòu)呈三維網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，各孔之間具有較好的連通性，且各孔間交錯連通，該結(jié)構(gòu)是細胞接種與正常生長、黏附、增殖的基礎(chǔ)，保證了細胞的營養(yǎng)供應(yīng)及代謝物的消除。通過應(yīng)力—應(yīng)變測試達到支架結(jié)構(gòu)的強度要求，與成骨細胞的體外培養(yǎng)具有良好的相容性，隨著培養(yǎng)時間的增長，成骨細胞的活性明顯增加。因此，本研究中制備nHA/PLLA復(fù)合生物支架材料，可以調(diào)節(jié)共聚物，具有良好的生物相容性，可以作為有良好前景的骨組織工程中很好的支架材料，再進一步研發(fā)，力爭適用于臨床實際中。

骨組織工程中，支架材料的研發(fā)中羥基磷灰石材料，已經(jīng)被公認的骨骼礦物質(zhì)晶體的其中一種成分，其結(jié)構(gòu)為六角柱體，晶體為六方晶系，磷酸根離子四面體網(wǎng)絡(luò)使得羥基磷灰結(jié)構(gòu)具備很好的穩(wěn)定性[11,12]。羥基磷灰石材料具有很好的生物相容性，羥基磷灰石植入到人體組織中均可以與周圍組織密切結(jié)合，國內(nèi)外基礎(chǔ)與臨床研究均已證實。但是，羥基磷灰石材料脆性大、柔韌性差，因此，具體應(yīng)用受到限制。納米羥基磷灰石的粒徑分布在1～100 nm，表面積更大，吸附效果更好，醫(yī)學研究[13-15]發(fā)現(xiàn)，其具有比普通的羥基磷灰石更強的生物活性。納米級的羥基磷灰石結(jié)晶主要分散在人體骨膠原骨架中，由于骨骼需要承受力的載荷，因此，需要一種有較高韌性的材料與之復(fù)合，既有一定的強度，又具有一定的柔韌度[16-18]。

圖3 電鏡掃描下成骨細胞在nHA/PLLA復(fù)合物中生長情況（1000×）A.成骨細胞在nHA/PLLA復(fù)合物第1天的生長情況；B.成骨細胞在nHA/PLLA復(fù)合物第3天的生長情況；C.成骨細胞在nHA/PLLA復(fù)合物第5天的生長情況

圖4 成骨細胞活性的檢測A.成骨細胞與nHA/PLLA復(fù)合物混合24 h后的細胞活力；B.成骨細胞與nHA/PLLA復(fù)合物混合48 h后的細胞活力；C.MTT法定量研究培養(yǎng)細胞活性統(tǒng)計圖（與對照組比較，*p＜0.05）

nHA/PLLA復(fù)合支架材料克服了普通羥基磷灰石強度低、脆性大，易折斷和碎裂的缺點。通過掃描電鏡、XRD和X射線衍射儀對nHA/PLLA復(fù)合支架材料進行表征。其具有較好孔隙率，其結(jié)構(gòu)呈三維立體網(wǎng)狀的固態(tài)多聚體。該結(jié)構(gòu)是細胞在其上生長、分化、增殖以及營養(yǎng)物質(zhì)交換的基礎(chǔ)，為后期應(yīng)用于骨組織工程提供基礎(chǔ)，并且增加了細胞與材料的接觸面積避免了接觸性抑制，具備優(yōu)良的力學性能滿足機體負重部位骨缺損的修復(fù)。進一步研究該材料的生物相容性，觀察該材料與細胞混合后對細胞活力的影響。結(jié)果表明，該支架材料生物相容性好、未發(fā)現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，且該支架材料能促進成骨細胞黏附、增殖作用，促進成骨細胞礦化成骨作用。

綜上所述，nHA/PLLA復(fù)合支架材料是一種性能較好的骨組織工程支架材料。

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In vitro biocompatibility of mesoporous nano hydroxyapatite/poly lactic acid composite scaffolds with osteoblast in bone tissue engineering*

LUO Xinle1**,HUANG Shu2,SONG Jinqi2,ZHU Weimin3,OUYANG Kan3
(1.Department of Joint Surgery,People's Hospital of Longhua District,Shenzhen 518109;2.Department of Joint Surgery,Central Hospital of Longhua District,Shenzhen 518110;3.Department of Sport Medicine,Second People's Hospital of Shenzhen,Shenzhen 518100,Guangdong,China)

Background:At present,the biocompatibility and biomechanical properties of scaffold materials are not satisfactory in bone tissue engineering,and the subsequent degradation of materials is also a problem to be solved.The combination of new materials,methods,techniques and medical research could improve the shape and structure,biocompatibility and degradation rate of scaffolds in bone tissue engineering.Objective:To develop a compound of two materials with better biocompatibility in bone tissue engineering through the construction of scaffolds by mesoporous nano hydroxyapatite/poly lactic acid(nHA/PLLA)composite and the compatibility study of it with osteoblast.Methods:nHA/PLLA composite was prepared by freezing rapid prototyping method;porosity was determined by BET;internal structure was observed by SEM to show physical properties;physical characteristics were presented through X-ray diffraction.The growth,adhesion and proliferation of osteoblasts in nHA/PLLA in vitro were shown by SEM;the amount of osteoblasts in nHA/PLLA were observed and calculated by inverted fluorescence microscope;the influence of nHA/PLLA composite on osteoblasts activity was determined by MTT.Results:nHA/PLLA composite was prepared with the pore size of(164±52)μm and the porosity of 89.3%±1.4%;the modulus of compression of dry and wet nHA/PLLA composite scaffolds were(1354.6±53.7)kPa and(1012.8±61.3)kPa,respectively;MTT results showed that nHA/PLLA composite had no significant influence on osteoblasts activity and with the prolongation of incubation,the amount of osteoblasts adhering to the composite surface and in the mesoporous increased gradually.Conclusions:The nHA/PLLA composite is a kind of scaffold material with high performance in bone tissue engineering,and its advantages include easy preparation,shape and internal structure meeting the requirements of tissue engineering scaffold and good biocompatibility with osteoblasts.

Nano-Hydroxyapatite/Poly LacticAcid Composite;Biocompatibility;Tissue Engineering;Osteoblast

2095-9958（2017）08-0 336-05

10.3969/j.issn.2095-9958.2017.04-14

2015年湖南省科技廳社會發(fā)展支撐計劃項目資助課題（編號：2015SK20471）；深圳市龍華新區(qū)科技創(chuàng)新資金“社會公益科研”項目資助課題（編號：20151020A1030115）

**通信作者：羅新樂，E-mail：luoxinlesz@163.com