松樹土壤根際微生物溶磷基因的克隆與表達

吳雪　金輝　唐健

摘要：探究土壤根際微生物溶磷基因?qū)﹄y溶性礦物質(zhì)磷的溶解作用。利用從土壤中提取宏基因組，克隆了GabY基因，并構(gòu)建了表達載體，研究了該基因在大腸桿菌DH5α的表達對難溶礦物質(zhì)磷酸Ca3（PO4）2的溶解作用。結(jié)果表明，構(gòu)建的GabY表達載體成功表達；對照組產(chǎn)酸能力較試驗組弱，且對照組溶磷效率要低于試驗組，直接從植物根際土壤微生物宏基因組中篩選溶磷基因?qū)ΦV物質(zhì)無機磷的溶解的研究可行。

關(guān)鍵詞：根際微生物；溶磷；GabY基因

中圖分類號：S714.3；S791；Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）20-3952-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.20.039

Abstract： To study the dissolving function of GabY gene on mineral inorganic phosphorus. The macro genomic DNA from soil was extracted，GabY gene was cloned， and then integrated into expression vector pETDuet-1，induced the integrated vector expression in DH5α to research the dissolving function on Ca3（PO4）2. The results showed GabY gene expression was successfully induced，and was able to promote the dissolving efficiency of inorganic phosphorus. Directly selected the mineral inorganic phosphorus soluble gene from soil macro genomic DNA is a viable method.

Key words： rhizosphere microorganisms；soluble phosphorus；GabY gene

磷是植物生長所必需的一種礦物質(zhì)元素，而土壤中能被植物直接吸收利用的磷的含量是很低的，絕大多數(shù)的磷是以難溶解的無機磷形式存在[1，2]，而磷肥的大量使用易對環(huán)境造成嚴重的污染。關(guān)于微生物對植物利用自然界中無機磷進行了大量研究，如Badu-Khan等[3]、Shahid等[4]、Anzuay等[5]在礦物質(zhì)磷溶解基因（Mps+）方面都做過大量研究，其中包括GabY和PQQA、PQQB、PQQE等PQQ家族基因；國內(nèi)也對此做了相關(guān)研究[6]。廣西壯族自治區(qū)典型的桉樹林喀斯特地貌以及馬尾松紅色土質(zhì)蘊含著大量的礦物質(zhì)無機磷，因此對廣西桉樹林土壤中溶磷微生物的研究有著很重要的意義。本研究以廣西桉樹林和馬尾松根際土壤中宏基因組入手，研究宏基因組中的溶磷基因的溶磷效率，為馬尾松林和桉樹林土質(zhì)改造提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土壤來源

南寧本地馬尾松林根際土壤和桉樹林根際土壤混合體。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

PKO培養(yǎng)基[7]：Glucose，10 g；Ca3（PO4）2，5 g；（NH4）2SO4，0.5 g；NaCl，0.2 g；MgSO4·7H2O，0.1 g；KCl， 0.2 g；Yeast extract，0.5 g；MnSO4·H2O，0.002 g；FeSO4·7H2O，0.002 g。

LB液體培養(yǎng)基：1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%NaCl（含100 μg/mL的Amp，過濾除菌）。

抗壞血酸（100 μg/mL）：10 g抗壞血酸加去離子水定容至100 mL，4 ℃保存；鉬酸鹽溶液：13 g鉬酸銨定容至100 mL加入300 mL硫酸（1∶1）混勻后加入100 mL酒石酸銻鉀溶液（0.35 g定容至100 mL），置于棕色瓶4 ℃保存。

1.3 質(zhì)粒與菌種

pETDuet1載體、DH5α感受態(tài)細胞均為廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院實驗室保存。

1.4 土壤宏基因組提取

基因組DNA提取參考文獻[8]。

1.5 目的基因擴增

根據(jù)所設(shè)計的引物對擴增目的基因GabY：SP：GAATTGATCTGGCTGAACATGGCGACC（斜體為EcoR Ⅰ酶切位點）；AP：AAGCTTCATAGGTCAGCTT GTGGACGCCG（斜體為Hind Ⅲ酶切位點）；PCR擴增程序：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.6 載體構(gòu)建及表達

用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切目的基因與pETDuet1載體，并將目的基因酶切片段與pETDuet1載體采用DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒連接，具體方法參照說明書。大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，400 mL SOC恢復培養(yǎng)1 h后涂布含100 μg/mL Amp的LB平板，挑選陽性克隆擴大培養(yǎng)，并用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切驗證。

1.7 溶磷試驗

磷標準曲線繪制參考文獻[9]。將陽性克隆用接種環(huán)接種到IPTG終濃度為100 mmol/L的PDA固體無機磷培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察溶磷圈的情況。將1 mL菌液加到含有50 μg/mL Amp的PDA液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600 nm約為0.6時，加入1 mmol/L的IPTG，于28 ℃進行誘導表達。分別于2、4、8、24、48 h取樣，檢測培養(yǎng)基溶解磷含量；同時，在相同條件下將菌種接到LB培養(yǎng)基中，并測定pH。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤宏基因組的提取

將桉樹根際土壤和馬尾松根際土壤混合，參考文獻[8]提取了土壤宏基因組，瓊脂糖凝膠電泳顯示其大小約為23 kb（圖1）。

2.2 表達載體的構(gòu)建

Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ分別雙酶切GabY基因片段和質(zhì)粒pETDuet1，4 ℃連接過夜，篩選的克隆提取質(zhì)粒后再經(jīng)Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切驗證。結(jié)果（圖2）表明，單酶切條帶約為5 900 bp；雙酶切條帶分別為5 400、460 bp，與預測結(jié)果相符。

2.3 溶磷試驗

2.3.1 PKO固體培養(yǎng)基上溶磷圈結(jié)果 通過定性試驗，結(jié)果（圖3）表明，試驗組（B）的溶磷情況較對照組（A）明顯，由此顯示GabY基因表達，能夠獲得良好的溶磷效果。

2.3.2 PKO液體培養(yǎng)基中無機磷含量變化 在加入誘導劑IPTG前，培養(yǎng)基中存在微量溶磷，但隨著誘導時間的延長，表達GabY基因的菌種溶磷情況明顯較對照組好，在24 h時溶解磷含量分別為（41.0±1.41）、（5.1±0.14） μg/mL（圖4）。

2.3.3 LB液體培養(yǎng)基pH變化 LB培養(yǎng)基初始pH為7.2，隨著誘導時間的延長，試驗組與對照組的pH均有下降趨勢，但試驗組趨勢要比對照組明顯，到48 h時對照組的pH為6.15，而試驗組則下降至4.6，表明試驗組產(chǎn)酸能力明顯好于對照組，反映出試驗組的溶磷效率較比對照組高（圖5）。

3 小結(jié)與討論

針對廣西卡斯特地質(zhì)及紅土為主，其中土壤巖層無機礦物質(zhì)磷含量十分豐富，且經(jīng)濟植被以松樹林及桉樹為主，土壤中磷含量對于農(nóng)作物、經(jīng)濟植被等的生長十分重要，但土壤中的磷多以無機礦物質(zhì)磷形式存在，不利于植物的吸收利用。國內(nèi)外學者早已開展對于土壤溶磷微生物的研究[10，11]，如邢芳芳等[12]在玉米根際土壤中篩選出的高效溶磷菌在以Ca3（PO4）2為惟一磷源的無機磷液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d水溶磷含量可達429.2 mg/L，是對照組的45.95倍。本研究從廣西松樹林土壤樣品中直接提取土壤微生物宏基因組，通過克隆已報道的溶磷基因，構(gòu)建表達載體從而免去了繁雜的菌種篩選工作。在溶磷機制研究方面，國外研究顯示大腸桿菌DH5α因無法合成PQQ（吡咯喹啉醌）而無解磷作用，而當轉(zhuǎn)化有PQQ合成基因或其他如GabY等基因的表達載體時，就能產(chǎn)生GA（葡萄糖酸），GA與磷酸鹽作用，從而釋放出無機磷[13]。因此，根據(jù)溶磷微生物產(chǎn)酸來增加礦物質(zhì)無機磷溶解的特性，對于土質(zhì)改良等方面有著十分重要的意義。

參考文獻：

[1] KIM K Y，JORDAN D，KRISHNAN H B. Expression of genes from Rahnella aquatilis that are necessary for mineral phosphate solubilization in Escherichia coli[J].FEMS Microbiology Letters，1998，159（1）：121-127.

[2] WANG X R，WANG Y X，TIAN J，et al. Overexpressing AtPAP15 enhances phosphorus efficiency in soybean[J].Plant Physiology，2009，151（1）：233-240.

[3] BABU-KHAN S，YEO T C，MARTIN W L，et al. Cloning of a mineral phosphate-solubilizing gene from Pseudomonas cepacia[J].Applied and Environmental Microbiology，1995，61（3）：972-978.

[4] SHAHID M，HAMEED S，IMRAN A，et al. Root colonization and growth promotion of sunflower（Helianthus annuus L.） by phosphate solubilizing Enterobacter sp. Fs-11[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2012，28（8）：2749-2758.

[5] ANZUAY M S，F(xiàn)ROLA O，ANGELINI J G，et al. Effect of pesticides application on peanut（Arachis hypogaea L.） associated phosphate solubilizing soil bacteria[J].Applied Soil Ecology，2015，95：31-37.

[6] 趙 珂.溶磷菌YM3-2S溶磷特性及溶磷基因的克隆[D].四川雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2007.

[7] NAUTIYAL C S. An efficient microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing microorganisms[J].FEMS Microbiology Letters，1999，170（1）：265-270.

[8] 邵勁松，浦牧野，顧祝軍.3種土壤微生物基因組DNA提取方法的比較[J].南京曉莊學院學報，2013，29（3）：64-67.

[9] 張鳳蓮.釀酒酵母PP2C類蛋白磷酸酯酶對線粒體ATP酶活性的調(diào)控[D].天津：天津大學，2008.

[10] 王 義，賀春萍，鄭肖蘭，等.土壤解磷微生物研究進展[J].安徽農(nóng)學通報，2009，15（9）：60-64.

[11] 陳 哲，吳敏娜，秦紅靈，等.土壤微生物溶磷分子機理研究進展[J].土壤學報，2009（5）：925-931.

[12] 邢芳芳，高明夫，禚優(yōu)優(yōu)，等.玉米根際高效溶磷菌的篩選、鑒定及溶磷特性研究[J].中國農(nóng)學通報，2016，32（9）：119-124.

[13] GOOSEN N，HORSMAN H P，HUINEN R G，et al. Acinetobacter calcoaceticus genes involved in biosynthesis of the coenzyme pyrrolo-quinoline-quinone： Nucleotide sequence and expression in Escherichia coli K-12[J].Journal of Bacteriology，1989，171（1）：447-455.endprint